Name: Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Öğrenin, H-Ras ile indüklenen hücresel yaşlanma sırasında WI-38 insan fibroblastlarında reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotipini nicel olarak ölçme yöntemlerini. Bu protokoller, akış sitometrisi ve ELISA kullanarak ROS ve IL-6, IL-8 gibi SASP faktörlerinin hassas analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1D1A1A01060839) bir hibe (için Young Yeon Kim) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen bir Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir (Hayır 2016R1A2B2008887 No 2016R1A5A2007009) (için Jeanho Yun).

1. inducing onkogen kaynaklı yaşlanma
<ol><li>
Bir H hazırlanıyor-RasV12 retrovirüsü
	<ol>
<li>100 mm Kültür yemek oda sıcaklığında 2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 min için ekleyerek kat.</li>
		<li>Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.</li>
		<li>Plaka 3 x 106 ecotropic BOSC-23 ambalaj hücreleri kaplamalı kültür Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile) çanak ve onları bir CO2 doku kültürü olarak 37 ° C'de kültür Kuluçka 1 d için.</li>
		<li>Ertesi gün, pBabe puro-H-RasV12 DNA ile birlikte retroviral ambalaj DNA (pGAG/pol 2 µg ve pVSVG 0,25 µg) 2 µg transfect üretici yönergelerine göre 8 h için transfection reaktif kullanarak.</li>
		<li>Transfection ortamını çıkarın ve 8 mL taze medya ekleyin.</li>
		<li>48 h sonra viral parçacıkların içeren ortam toplama ve Santrifüjü 500 x g 5 min için de herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak.</li>
		<li>H-Ras virüs içeren medya 0,45 µm şırınga filtre ile filtre. Not: herhangi bir donma ve virüs supernatants için verimli bir viral enfeksiyon, çözme kaçının. En iyi verimi elde etmek için enfeksiyon gibi aynı gün hasat bir virüs kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
H-RasV12 retrovirüsü ile WI-38 normal insan fibroblast bulaşmasını
	<ol>
<li>Plaka 5 x 104 WI-38 hücreleri 60 mm kültüründe % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 1B H-RasV12 retrovirüsü hasat önce içeren DMEM ile yemek ve onları 37 ° C'de 1 günde kültür</li>
		<li>Ertesi gün büyüme orta kaldırın ve 1 mL H-RasV12 retrovirüsü medya ekleyin. Büyüme orta 2 µL polybrene hisse senedi çözüm (8 mg/mL distile su) içeren bir ek 1 mL ekleyin. Örnek 1 günde bir oksijen 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.</li>
		<li>H-RasV12 retrovirüsü karışımı 24 h daha sonra kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile. Büyüme orta ekleyin ve 2 gün içinde oksijen 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka için 2 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi.</li>
		<li>2 d puromisindir seçim sonra büyüme orta kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile. Büyüme orta ekleyin ve bir oksijen 37 ° C, belirtilen süre noktayı kadar (bir Şematik diyagramı Şekil 1A ' ya bakınız) %5 CO2 kuluçka hücrelerde kültür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izleme yaşlanma yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz yolu ile boyama
<ol><li>
Aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) dimetil formamide (DMF) içinde hazırlamak. Çözüm-20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Sitrik asit sodyum fosfat tampon 3.377 g (126 mM) Na2HPO4.7H2O çözülerek hazırlamak ve 0,708 g sitrik asit (36.8 mM) 100 mL distile su. 6.0, pH ayarlayın.</li>
		<li>0, 5 M potasyum ferrocyanide hazırlayın. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de çözümde</li>
		<li>0, 5 M potasyum ferricyanide hazırlayın. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de çözümde Not: Yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA β-gal) boyama çözüm pH kesin sonuçlar için önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taze bir SA β-gal boyama çözüm 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM potasyum ferrocyanide, 5 mM potasyum ferricyanide, % 20 (v/v) sitrik asit sodyum fosfat tampon ve 1 mg/mL X-gal içeren stok çözüm sulandrarak olun.</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 yıkama x 1 x PBS ile. Oda sıcaklığında 5 min için % 3 formaldehit ile hücreleri tamir. Not: retrovirüsü ile bulaşmamış hücreleri bir negatif kontrol kullanılmalıdır. Hastalık bulaşmamış tek kontrol hücreleri Proliferasyona durumlarını korumak için pasajlı devam etmelidir.</li>
	<li>Fiksasyon çözüm hücrelerdeki kaldırmak ve 1 x PBS ile yıkayın. Taze hazırlanmış 1 x SA β-gal boyama çözüm (60 mm kültür tabağına 1,5 mL) ekleyin. Kurutma önlemek ve 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya parafin film ile çanak mühür Alternatif olarak, bir nem odasında beraber tabakları kuluçkaya. Not: % 3 formaldehit içeren sabitleştirici çözüm tehlikeli atık bertaraf. CO2 olmadan bir Kuluçka kuluçka sırasında pH değişiklikleri önlemek için arzu edilir.</li>
	<li>Boyama hücreleri mikroskop altında ise ertesi gün durumunu; SA β-gal-pozitif hücreler Perinükleer bölgede mavi görünür. Not: SA β-gal-pozitif hücre düşük frekans Proliferasyona kontrol hücreleri gösterir. Boyama çok hafif ise, biraz daha uzun bir süre için kuluçka devam (temsilcisi örnek için bkz: Şekil 1B ).</li>
	<li>Bir SA β-gal boyama resmi bir CCD kamera 10 X ya da daha büyük objektif lens kullanarak elde. Resim boyama yüzdeyi hesaplamak için yeterli sayıda yakalamak (> 200 hücreleri).</li>
	<li>SA β-gal-lekeli hücre yüzdesi SA β-gal-pozitif hücre hücreleri toplam sayısına oranla sayısı miktarının hesaplamak. Not: SA β-gal boyama bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak Çoğalt deneyler (Şekil 1 C) sonuçlarına hesaplanacağını yinelenmelidir. Uygun hücre yoğunluğu SA β-gal boyama deneme için önemlidir. Yüksek confluency için yaşlanma ilişkili morfoloji değişikliği ile müdahale ve kontrol hücreleri yanlış sinyal teşvik.</li>
</ol>3. bir reaktif oksijen türleri indüksiyon H-Ras-indüklenen yaşlanma sırasında miktarının
<ol><li>Plaka 2 x 105 WI-38 hücreleri 60 mm kültürüne çanağı ve H-Ras-indüklenen yaşlanma 1. adımda açıklandığı gibi kışkırtmak. Not: Bu protokol hücresel yaşlanma modelleri diğer türleri için uygulanabilir.</li>
	<li>Büyüme orta (2, 4 veya 6 gün) belirtilen zamanda noktada kaldırmak ve 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ile tedavi bunları ayırmak ve 1 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek tripsin devre dışı bırakabilirsiniz FBS. Hücre sayısını belirler.</li>
	<li>1 x 105 hücreleri 15 mL konik tüp içine aktarmak ve Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak.</li>
	<li>Taze 2', Kültür (DCF-DA çalışma konsantrasyonu 50 µM) Orta için 10 mL 10 mm DCF-DA 50 µL ekleyerek 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) boyama ortam hazırlamak. Not: DCF-DA ışığa duyarlı olduğunu. Işığa maruz kaçınılmalıdır. DCF-DA ve boyama zaman konsantrasyon hücre türüne bağlı olarak ayarlanabilir.</li>
	<li>Büyüme orta dikkatle 15 mL konik tüp sizden kaldırın ve taze hazırlanmış DCF-DA boyama orta 1 mL ekleyin. Dikkatle hücre Pelet resuspend ve karanlıkta 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Sigara lekeli bir örnek bir negatif boyama kontrol içerir. Not: Proliferasyona hücreleri DCF-DA ile lekeli değil bir negatif kontrol hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak ve onları yıkamak 1 x 2 mL 1 x PBS ile. 1 mL 1 x PBS hücrelerle resuspend ve örnek (FACS) tüp sıralama uygun floresan aktif hücreye transfer.</li>
	<li>
Ölçü 2 ', bir uygun lazer kaynağı ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) Floresan sinyali. Örnekleri ile mavi lazer heyecanlandırmak (488 nm) ve Logaritmik ölçek kullanarak bir 530 ± 30 nm bulmak ile (FITC) verilmiş floresans algılamak.
	<ol>
<li>Negatif kontrol lekeli olmayan hücreleri ilk analiz. İleri dağılım (FSC) karşı tarafı dağılım (SSC) bir nokta arsa, perdeleme aracını kullanarak canlı hücreleri seçin ve ölü hücreleri ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak. Not: Hücre boyutu değişimi FSC karşı SSC, nokta mezarlığına dikkatle izlenmelidir. FSC karşı SSC, nokta mezarlığına çoğunluğuna sonra senescent hücrelerin boyutunu önemli ölçüde arttırılırsa, DCF-DA yoğunluğu içinde aynı boyutta hücre popülasyonlarının karşılaştırılmalıdır.</li>
		<li>Bir tek parametreli histogram DCF-DA görüntüleme (488 nm) Floresan xLogaritmik ölçekte-eksen ve olayları (cep numarası) y, doğrusal ölçeği üzerindeki-eksen, gerilim pik üzerinden yerleştirmek için 488 nm lazer ayarlamak lekeli olmayan hücreler sol kenarında.</li>
		<li>Örnekleri ve her örnek için kayıt en az 10,000 olayları lekeli DCF-DA analiz. Akış Sitometresi belirli analiz yazılımı kullanarak her örnek ortalama floresans değeri elde. Not: ROS ölçümleri bağımsız olarak en az 3 x ve Ortalama değerlerini bu sonuçlar hesaplanacağını yinelenmelidir. Temsilcisi H-Ras-indüklenen yaşlanma sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifying Il-6 ve Il-8 mRNA ifade yaşlanma ilişkili salgı fenotip analizi kullanarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu için
<ol><li>
Toplam RNA hazırlık
	<ol>
<li>Plaka 3 x 105 WI-38 hücreleri 100 mm Kültür üzerine % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM çanağı ve onları bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 1 gün için kültür. Yinelenen kültürler her zaman noktası için hazırlayın.</li>
		<li>1. adımda açıklandığı gibi H-RasV12 retrovirüsü hücrelerle bulaşmasını tarafından yaşlanma neden.</li>
		<li>Yıkayın hasattan önce 1 gün hücre 2 x 1 x PBS ile ve DMEM FBS olmadan 3 mL ekleyin. Not: Bu adım adım 5'te açıklandığı gibi ELISA için kullanılan şartına orta üretmek için yapılır. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA'ların bazı hassas hücreler içinde bir ifade neden olabilir. Böylece, IL-6 ve Il-8 mRNA ifade ve serum açlık olmadan kültürlü hücrelerde ilk karşılaştırılması gereken. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA ifadesinde önemli değişiklikler neden olmaktadır, qPCR için toplam RNA ve ELISA için şartına orta ayrı olarak hazırlanmalıdır.</li>
		<li>Klimalı orta örnekleri 24 h sonra toplamak ve orta-80 ° C'de ELISA için saklayın.</li>
		<li>Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ile tedavi bunları ayırmak ve 1 mL % 10 içeren büyüme ortamının ekleyerek tripsin devre dışı bırakabilirsiniz FBS. 5. adımda açıklandığı gibi ELISA sonuçları normalleştirme için hücre sayısı belirler. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından 1.5 mL microcentrifuge tüp hücrelerde hasat.</li>
		<li>Orta yumuşak emici tarafından kaldırın ve 1 mL RNA ayıklama çözeltisi ekleyin. O zaman, girdap microcentrifuge tüp şiddetle için 15 s. Daha sonra kloroform ve şiddetle girdap karışımı bir ek 15 için tekrar 200 µL ekler s.</li>
		<li>17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnek tüpler santrifüj kapasitesi Ardından dikkatle üst aşaması için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Not: İnterfaz ve alt Organik faz üst aşama aktarımı için yeni bir tüp sırasında rahatsız değil.</li>
		<li>İsopropanol RNA çökelti ve onları de nazik INVERSION tarafından karışımı 400 µL ekleyin. O zaman, Tüp, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tüp santrifüj kapasitesi O zaman, RNA Pelet korumak için dikkat çekici süpernatant, atın. 1 mL % 75 etanol ekleyerek RNA yıkayın ve tüp 2 – 3 x tersine çevirin. Tüp 17.000 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında RNA Pelet Makinası ve RNA dietil pyrocarbonate (DEPC) 50 µL içinde çözülür-distile su tedavi. 1 µL RNA çözüm kullanarak, toplam RNA konsantrasyon ile spektrofotometre ölçmek. Not: •kızılötesi RNA çözünürlük azaltır; Bu nedenle, RNA •kızılötesi kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cDNA hazırlık
	<ol>
<li>Ertesi gün bir ince duvarlı PCR tüp içine ekleyerek her örnek için Ters transkripsiyon tepki karışım hazırlamak: Toplam RNA'ın 2 µg (RNase free su ile 10 µL için ses seviyesini), 10 x RT arabellek, rasgele bir astar (50 pmol), 25 x dNTP Mix (100 0.8 µL 1 µL 2 µL mM), MMLV ters transkriptaz (50 U/µL) 1 µL ve 5.2 µL RNase free, su.</li>
		<li>Aşağıdaki koşullar ile termal cycler Ters transkripsiyon tepki programa ayarlayın: 42 ° C 60 dakika ve 95 ° C 5 dk. yer PCR tüpleri termal cycler ve programı Başlat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
	<ol>
<li>Gerçek zamanlı PCR ana mix tüm reaksiyonlar için hazırlayın. Reaksiyon karışımı her örnek için aşağıdaki gibidir: 2 x gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL her Il-6 ve Il-8 için ileriye ve geriye doğru astar ve ultra-saf distile su (DNaz-RNase-ücretsiz ve) 21 µL 25 µL. Bkz. Tablo 1. Not: aktin RNA astar bir iç denetimi içeren her örnek için gerçek zamanlı PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. GAPDH, normalleştirme için bir iç denetimi olarak da kullanılabilir.</li>
		<li>Her şey bir 96-şey optik qPCR plaka 48 µL ana mix ve su ile 3 kat seyreltilmiş cDNA ürünün 2 µL ekleyin. Her reaksiyon nüsha gerçekleştirin. CDNA şablonu PCR denetimi olarak yok bir denetim iyi hazırlamak.</li>
		<li>Aşağıdaki koşullar ile termal cycler gerçek zamanlı PCR reaksiyon programa ayarlayın: 95 ° C, 40 devir of15 s 95 ° c (denatürasyon) ve 1 dk. 60 ° c (tavlama ve uzantısı), 10 dak.</li>
		<li>Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek ve eşik döngüsü (CT) değeri PCR döngüsü tamamlandıktan sonra kaydedin. MRNA düzeyleri Il-6 veya Il-8 2- ΔΔCΤ yöntemi20kullanarak hesaplayın. Not: Göreli kat Değiştir ifadesinde aktin düzeylere normalleştirme sonra aşağıdaki formülü kullanarak belirlenir: Değişiklik kat 2-Δ (ΔCT) = Burada, ΔCT CT, Il-6 veya Il-8- CT, aktin; = ve Δ (ΔCT) = ΔCT, uyarılmış- ΔCT, denetimi.
</li>
		<li>Yinelenen her örnek için ortalama değeri hesaplamak. Not: qPCR bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak bu sonuçlara hesaplanacağını yinelenmelidir. Temsilcisi H-Ras-indüklenen yaşlanma sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir. Açlık serum IL-6 ve Il-8 mRNA bazı hassas hücreler içinde ifade neden olabilir. Böylece, IL-6 ve Il-8 mRNA ifade ve serum açlık olmadan kültürlü hücrelerde ilk karşılaştırılması gereken. Serum açlık Il-6 veya Il-8 mRNA ifade önemli değişikliklere neden olmaktadır, qPCR için toplam RNA ve ELISA için şartına orta ayrı olarak hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. miktarının salgılanan Il-6 ve Il-8 protein düzeyleri ELISA bir salgı fenotip yaşlanma ilişkili analizi için
<ol><li>Tezcan şartına orta 3 mL senescent WI-38 hücrelerden adım 4'te açıklandığı gibi hasat. Santrifüjü 500 x g 5 min için de hücre artıkları çıkarın.</li>
	<li>Klimalı orta 10 kat konsantre Santrifüjü 3000 x g 20 dk santrifüj filtre birimini kullanarak için de tarafından. Not: Şartına orta yoğunlukta mutlaka örnek türüne bağımlı.</li>
	<li>
ELISA şartına orta konsantre her örneğinin 50 µL ile uygun Il-6 ve Il-8 ELISA kitleri kullanarak gerçekleştirin. Not: her örnek iki ELISA wells için yapılan Test. Çünkü her zaman noktası 4. adımda çoğaltılmış olması, bu analiz ELISA tahlil ve örnek hazırlama tekniği izlemek için bize izin verir.<ol>
<li>ELISA levha kaplama, IL-6 veya Il-8 antikor bir konsantrasyon olarak 0,5 µg/mL 1 x PBS ile Il-6 veya 0,125 µg/mL için Il-8 için sulandırmak. Seyreltilmiş antikorların 100 µL ELISA plaka her şey için ekleyin. Film sızdırmazlık bir ELISA plaka ile plaka mühür ve bir gecede oda sıcaklığında sallayarak olmadan kuluçkaya.</li>
		<li>Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın (% 0.05 Ara-20 PBS). 300 µL engelleme arabelleği (PBS % 1 BSA) her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Engelleme çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Seri olarak seyreltilmiş ELISA standartları seyreltme arabelleği (% 0.05 Ara-20 ve % 0.1 BSA PBS içinde) standart bir eğri oluşturmak için hazır olun. Not: IL-6 için seri seyreltme 31,25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ve 2000 pg/mL ' dir. Il-8 için seri seyreltme 2.34, 4,69, 9,38, 18,75, 37.5, 75 ve 150 pg/mL dir.</li>
		<li>Standart çözüm 100 µL ya 100 µL örnek çözüm (konsantre Orta 50 µL) 50 µL seyreltme arabelleği ile her şey için ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Standart veya örnek çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Algılama antikor seyreltme arabelleği için Il-6 veya 0,25 µg/mL 0.1 µg/mL konsantrasyonu ile Il-8 için sulandırmak. Seyreltilmiş antikor iyi başına 100 µL ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. Streptavidin horseradish peroksidaz (HRP) 0,05 µg/mL konsantrasyonu seyreltme arabellekte oranında seyreltin. Streptavidin-HRP çözüm iyi başına 100 µL ekleyin. Wells, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Antikor çözüm aspirasyon tarafından kaldırın. Her şey 4 x 1 yıkama arabellek x 300 µL ile yıkayın. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substrat çözeltisi her şey için 100 µL ekleyin. Renk geliştirme için izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında wells kuluçkaya. Reaksiyon 1 M HCl durmak eriyik 100 µL ekleyerek durdurmak.</li>
		<li>Her şey absorbans 450 de ELISA okuyucu ile okumak nm.</li>
		<li>Oluşturulan standartları için standart eğri çizmek. Il-6 ve Il-8 konsantrasyonları standart eğrileri göre klimalı ortamda hesaplayın. Hücre sayısı için bir normalleştirme sonra sonuçları çizmek. Yinelenen örnekleri için ortalama değerleri hesaplar. Not: ELISAs bağımsız olarak en az 3 x ve ortalama değerleri temel alınarak bu sonuçlara (Şekil 4) hesaplanması gereken yinelenmelidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, H-Ras-indüklenen yaşlanma WI-38 normal insan fibroblast içinde sırasında hücre içi ROS düzeyleri izlemek için yöntem sunulmuştur. Canlı hücrelerde hücre içi ROS düzeyleri kantitatif hücre geçirgen reaktif DCF-DA kullanarak ölçülen ve akış sitometresi. Hücresel alımı DCF-DA hücre içi esterazlar tarafından deacetylated ve daha sonra son derece floresan 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF) oluşturmak üzere ROS tarafından okside. DCF floresan bir FL1 dedektörü (yeşil floresan) kullanarak akış sitometresi tarafından tespi...

Daha 50 yıl önce ortaya Hayflick ve Moorhead normal hücreleri geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama proliferatif potansiyellerini tükenme hücre bölümler1belirli sayıda sonra üzerine girin. Bu olay şimdi ikileştirici yaşlanma bilinen ve güçlü organizmalar yaşlanma2ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir inanılıyor. Ne kadar telomerlerin ilerici erozyon ikileştirici yaşlanma önemli bir nedeni olarak, DNA hasarı, oncogenic harekete geçirmek ve oksidatif stres, gibi çeşitli hücresel vurguluyor başka tür bir hücresel yaşlanma ikna etmek için bildirilmiştir "erken yaşlanma" veya "stres kaynaklı yaşlanma" denir. İlginçtir, erken yaşlanma oncogenes H-Ras ve BRAF gibi etkinleştirme üzerine güçlü bir tümör baskılayıcı rol oynar. Fare modelleri ve insan doku biyolojik hücre yaşlanma ağırlıklı olarak nerede oncogenic Ras ve BRAF aktif hale gelir ama dayandığı malign kanserleri azaldı premalign lezyonlar içinde yoktu güçlü kanıtlar doğurmuştur Bu lezyonlar3,4,5. Yaşlanma ve tümör bastırma rolü, hücresel yaşlanma, yara iyileşmesi, doku onarımı, immün gözetim ve embriyonik gelişim6dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerinde bir rol oynamaya önceki çalışmalarda gösterilmiştir.
Her ne kadar büyüme tutuklama yaygın hücresel yaşlanma7damgasını okudu, kanıt önemli bir vücut o hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) da hücresel yaşlanma8' e katkıda bulunur göstermektedir. ROS düzeyleri yükseltme sırasında çeşitli tip-in hücresel yaşlanma ikileştirici yaşlanma ve onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), dahil olmak üzere, on yıl önce ilk olarak bildirildi9,10. Bir daha doğrudan, yaşlanma11,12H2O2 sublethal bir doz ile eksojen tedavi neden olmaktadır. SOD1 gibi ROS atma enzim inhibisyonu da erken yaşlanma13neden olur. Buna ek olarak, düşük ortam oksijen koşulları ve artan ROS atma gecikme yaşlanma10,14,15başlangıcı. Bu sonuçlar kuşkusuz ROS önemli arabulucu veya hücresel yaşlanma indüksiyon belirleyicileri olduğunu gösteriyor. Hücresel yaşlanma ve nasıl ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında yüksek indüksiyon ROS katkıda nasıl ancak, daha fazla araştırma gereken.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücrelere ve dokulara den bir SASP16,17güçlü parakrin faaliyetleri var ortaya çıkardı. Yaşlı dokusunda senescent hücreleri SASP aracılığıyla birçok yolları özerk bir tükenmesi proliferatif hücrelerinin yanı sıra yaşa bağlı doku işlev bozuklukları ile tanıtmak. Çeşitli proinflamatuar faktörler, IL-6 gibi yaşa bağlı doku bozuklukları doku homeostazı, imha doku mimarisinin bozulma ile Il-8, TGFβ ve senescent hücreleri tarafından salgılanan matriks metalloproteinazların (MMPs), neden yaşlanma komşu hücrelerin ve steril iltihap18,19. Ancak, SASPs biyolojik bağlamda bağlı olarak yararlı etkileri olabilir. Buna ek olarak, senescent hücre türü ve daha fazla araştırma19ihtiyacını vurgulayan hücre sahne SASPs heterogenetic doğası bağlıdır.
Burada, hücre içi ROS düzeyleri OIS sırasında değerlendirmek için hızlı ve hassas sitometresi tabanlı teknikleri açıklar. Buna ek olarak, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve ELISA kullanarak SASP faktör analizi için yöntemler tanıtılmaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>kuyu geni</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hidroklon</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG / pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg / mL</td></tr><tr><td>puromisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg / mL ve nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-kloro-3-indolil ve beta; D-galaktopiranosid (X-gal)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potasyum ferrosiyanür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potasyum ferrisiyanür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>tripsin-EDTA</td><td>kuyu geni</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Ters transkriptaz</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Yeşil PCR master 2x karışım</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele Astar</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf damıtılmış su</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-6 ELISA testi</td><td>PeproTech</td> <td># 900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-8 ELISA testi</td><td>PeproTech</td> <td># 900_TM18</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > EKİPMANLARI< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.45 & mu; m şırınga filtresi</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometre</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>ABI Prizma 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>EMax mikroplaka okuyucu</td><td></td></tr></tbody></table>

reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan büyüme tutuklama üzerine proliferatif kapasitesi veya çeşitli gerilmeler maruz bitkinlik hali olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda hücresel yaşlanma geliştirme, yara iyileşmesi, immün gözetim ve yaşa bağlı doku disfonksiyon da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçleri için rol genişletmiştir. Hücre döngüsü tutuklama hücresel yaşlanma kritik damgasını olsa da, bir artan hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretim de hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynamaya gösterdi. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda senescent hücreler komşu hücre ve dokuların bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) aracılığıyla güçlü parakrin faaliyetleri sergi ortaya koydu. Hücresel yaşlanma karşı tedavi stratejileri ile ilgili faiz keskin artış yaşlanma mekanizmaları, hücre içi ROS ve SASP de dahil olmak üzere tam bir anlayış ihtiyacını vurgular. Burada, kantitatif ROS duyarlı floresan boya ve akış sitometresi kullanarak H-Ras-indüklenen hücresel yaşlanma sırasında hücre içi ROS düzeylerini değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar. Buna ek olarak, biz mRNA ifade indüksiyon ve salgı SASP faktör analizi için hassas teknikleri tanıtmak. Bu protokoller çeşitli hücresel yaşlanma modelleri için uygulanabilir.

H-Ras-indüklenen yaşlanma örneği Şekil 1' de gösterilen. H-RasV12 retrovirüsü ile WI-38 normal insan fibroblast bir enfeksiyon dramatik morfolojik değişiklikler (Şekil 1B) indüklenen. Buna ek olarak, Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi SA β-gal boyama etkinliği son derece H-RasV12 ifade yükseldi. SA β-gal etkinlik 6 d H-RasV12 retrovirüsü enfeksiyon sonra boyama, biz ve diğer gruplar2...

Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Bu prosedürün genel amacı, hücresel yaşlanma sırasında hücre içi ROS seviyelerini ve yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotipini veya SASP'yi izlemek için hassas teknikler sağlamaktır. Burada, bu yöntemlerin, WI-38 normal insan fibroblastlarında H-Ras ile indüklenen yaşlanma sırasında hücre içi ROS ve SASP faktörleri IL-6 ve IL-8 seviyelerindeki artışları başarılı bir şekilde ortaya çıkardığını gösteriyoruz. Bu teknikler, hücresel yaşlanma sırasında hücre içi ROS seviyelerindeki değişikliklerin izlenmesine ve SASP faktörlerinin ekspresyonunun analizine izin verir.Bu yöntemin temel avantajı, birçok farklı hücresel yaşlanma modeline uygulanabilmesidir. Bu nedenle, bu yöntem nihayetinde ROS ve SASP'nin hücresel yaşlanmadaki rolünü anlamamıza ve altta yatan düzenleyici mekanizmaları incelememize yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan Young Yeon Kim ve Jee-Hyun Um olacak.H-Ras retrovirüsünü hazırlayarak bu işleme başlayın. İlk olarak, ekotropik BOSC hücrelerini poli-L-lizin kaplı bir kültür kabında tohumlayın ve bir gün boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin. Ertesi gün, BOSC hücrelerini H-Ras retroviral DNA ile transfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktifi kullanarak DNA'ları paketleyin.Sekiz saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve sekiz mililitre taze medya ekleyin. Viral partiküller içeren ortamları 48 saat sonra toplayın ve santrifüjleme ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın. Ardından, virüs içeren ortamı 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresi ile filtreleyin.WI-38 hücrelerini, H-Ras retrovirüsünün hasadından bir gün önce 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir gün boyunca kültürleyin. Ertesi gün, büyüme ortamını çıkarın ve bir mililitre H-Ras virüsü ortamı ekleyin. İki mikrolitre polibren stok çözeltisi içeren bir mililitre daha büyüme ortamı ekleyin ve CO2 inkübatörde bir gün inkübe edin.Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamını ekleyin. Enfekte olmayan hücreleri çıkarmak için, hücreleri iki gün boyunca mililitre puromisin başına iki mikrogram ile tedavi edin. Stok çözeltisini seyrelterek taze SA beta-gal boyama çözeltisi hazırlayın.Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Formaldehit içeren fiksasyon çözeltisi ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Fiksasyon solüsyonunu hücrelerden çıkarın ve PBS ile yıkayın.Çanağı kaplamak için taze hazırlanmış SA beta-gal boyama solüsyonu ekleyin. Numunenin kurumasını önlemek için tabağı Parafilm ile kapatın ve CO2 içermeyen bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün mikroskop altında hücrelerin lekelenme durumunu kontrol edin.SA beta-gal-pozitif hücreler perinükleer bölgede mavi görünecektir. Bir CCD kamera ile SA beta-gal boyamanın bir görüntüsünü elde edin ve en az 200 toplam hücre arasındaki SA beta-gal-pozitif hücrelerin sayısını sayarak SA beta-gal lekeli hücrelerin yüzdesini hesaplayın. 60 milimetrelik bir kültür kabı üzerinde beşinci WI-38 hücrelerine iki kez 10 kez plaka koyun ve hücreleri daha önce tarif edildiği gibi H-Ras retrovirüsü ile enfekte ederek yaşlanmayı indükleyin.ROS ölçümü için istenen zaman noktasında, büyüme ortamını çıkarın ve PBS ile bir kez yıkayın. Tripsin / EDTA çözeltisi ile muamele ederek hücreleri ayırın ve hücre sayısını belirleyin. 15 mililitrelik konik bir tüpe 10 ila beşinci hücreyi aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Büyüme ortamını dikkatlice çıkarın ve bir mililitre taze hazırlanmış DCF-DA boyama ortamı ekleyin. Hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin ve karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve PBS ile bir kez yıkayın.Hücreleri bir mililitre PBS ile yeniden süspanse edin ve numuneleri bir FACS tüpüne aktarın. DCF-DA floresan sinyali, 488 nanometre mavi lazerle donatılmış bir akış sitometresi kullanılarak ölçülebilir. İlk olarak, lekelenmemiş bir kontrol hücresi örneği çalıştırın.İleri saçılma ve yan saçılmanın nokta grafiğinde, canlı hücreleri seçin ve bir geçit aracı kullanarak ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını ortadan kaldırın. Ardından, DCF-DA floresan sinyalini gösteren histogramda, tepe noktasını kontrol hücrelerinden sol kenara yerleştirmek için mavi lazer voltajını ayarlayın. Şimdi, DCF-DA ile boyanmış her örneği çalıştırın ve en az 10.000 olay kaydedin.Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi H-Ras retrovirüsü ile enfekte ederek yaşlanmayı indükleyin. Hasattan bir gün önce, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. FBS olmadan üç mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri bir gün boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin.24 saat sonra, şartlandırılmış ortamı toplayın ve sonraki ELISA için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücreleri tripsinize edin ve hücreleri santrifüjleme ile 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Konvansiyonel RNA ekstraksiyon yöntemini kullanarak toplam RNA'yı hazırlayın ve ters transkripsiyon reaksiyonu yoluyla iki mikrogram toplam RNA'dan cDNA oluşturun.Gerçek zamanlı PCR için, IL-6 veya IL-8 için ileri ve geri primerleri içeren tüm reaksiyonlar için SYBR Green PCR Master Mix'i hazırlayın. Dahili kontrol olarak aktin primerleri içeren her numune için reaksiyon karışımını hazırlayın. 96 oyuklu bir optik qPCR plakasında her bir oyuğa 48 mikrolitre Master Mix ve bir ila üç seyreltilmiş iki mikrolitre cDNA ürünü ekleyin.Her reaksiyonu üç kopya halinde gerçekleştirin. Termal döngüleyicide gerçek zamanlı PCR reaksiyon programını kurun ve gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Çalışmanın tamamlanmasının ardından, eşik döngü değerlerini veya CT değerlerini toplayın ve aktin seviyelerine normalizasyondan sonra IL-6 veya IL-8'in mRNA seviyelerini hesaplayın.Daha önce yaşlanan WI-38 hücrelerinden hasat edilen çözülme şartlandırılmış ortam. Hücre kalıntılarını beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyerek çıkarın. Gözenek boyutu 3.000 dalton olan bir santrifüj filtre kullanarak şartlandırılmış ortamı 10 kat konsantre edin.ELISA'yı uygun IL-6 veya IL-8 ELISA kiti ile gerçekleştirin. İlk olarak, plakayı gece boyunca oda sıcaklığında inkübe ederek ELISA plakasını seyreltilmiş IL-6 veya IL-8 antikoru ile iyice kaplayın. Her kuyucuğu dört kez yıkadıktan sonra, her bir oyuğa bloke edici tampon ekleyin ve bir saat inkübe edin.Plakayı dört kez yıkayın. Seri olarak seyreltilmiş ELISA standartlarını veya konsantre şartlandırılmış ortam örneklerini ekleyin ve iki saat inkübe edin. Plakayı yıkadıktan sonra, numuneleri ikincil bir antikor ve sırayla streptavidin-HRP konjugatı ile inkübe edin.Her oyuğa 100 mikrolitre TMB substrat çözeltisi ekleyin ve renk gelişimine izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun. 450 nanometrede bir ELISA okuyucu ile her kuyucuğun emilimini okuyun.Oluşturulan standartlar için standart eğriyi çizin. Standart eğrilere göre şartlandırılmış ortamdaki IL-6 ve IL-8 konsantrasyonlarını hesaplayın. Hücre sayımına normalleştirmeden sonra sonuçları çizin.WI-38 normal insan fibroblastlarının H-Ras retrovirüsü ile enfeksiyonu, hücresel morfolojide dramatik değişikliklere neden oldu. Hücrelerin% 70'inden fazlasında SA beta-gal boyama aktivitesi gözlendi, bu da H-Ras ekspresyonunun altı gün içinde WI-38 hücrelerinde hücresel yaşlanmayı indüklediğini gösteriyor. DCF-DA boyama analizi, H-Ras ekspresyonunun hücre içi ROS seviyelerinde de önemli bir artışa neden olduğunu ortaya koymaktadır.Hücre içi ROS seviyelerindeki artış, H-Ras ekspresyonundan iki gün sonra gözlenir ve altı günlük zaman noktasına kadar korunur. Temsili yaşlanma ile ilişkili salgı faktörleri IL-6 ve IL-8'in gerçek zamanlı PCR analizi, yaşlanan WI-38 hücrelerinde IL-6 ve IL-8'in mRNA ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ortaya koymaktadır. Şartlandırılmış ortamın ELISA'ları, H-Ras ile indüklenen yaşlanan hücrelerde IL-6 ve IL-8 sekresyonunun da arttığını doğruladı.Onkogen ekspresyonu, DNA hasarı veya oksidatif stres yoluyla hücresel yaşlanmayı indüklemek genellikle altı ila sekiz gün sürer. Hücreler hazır olduğunda, uygun şekilde yapılırsa ROS ölçümü iki saat içinde yapılabilir. Bu tekniklere hakim olduktan sonra, SASP faktörlerinin mRNA ve protein seviyelerinin analizi bir gün içinde tamamlanabilir.ROS seviyelerini ve SASP indüksiyonunu analiz ederken, SA beta-gal boyama ve gerekirse ek yöntem yoluyla hücresel yaşlanmayı doğrulamak önemlidir. Ek olarak, ROS artışının yaşlanmanın erken evresinde meydana geldiğini, SASP gelişiminin ise ancak yaşlanma tam olarak kurulduktan sonra tespit edilebildiğini hatırlamak çok önemlidir. Bu teknikler çok çeşitli hücresel yaşlanma modellerine uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, hücresel yaşlanma sırasında ROS seviyelerinin ve SASP indüksiyonunun nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Bu protokol, insan yağ dokusundan izole edilen stromal damar fraksiyonunda yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin objektif ve tek hücreli tespiti için yansıtılmış ışık konfokal mikroskopisi sunmaktadır. Yöntem, immünositokimya ile uyumludur, nicel değerlendirme için pH kontrollerini içerir ve ayrıca geleneksel SA-β-gal boyamaya daha hassas ve daha az öznel bir alternatif sunar.

Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Bu yöntem, yaşlı cilt fibroblastlarının sağlıklı fibroblastları nasıl etkilediğini inceler. Yaşlanma, UVB maruziyeti yoluyla indüklenir ve koşullu ortam normal fibroblastlara uygulanır. Cilt yaşlanmasında değişen hücre-hücre iletişimini hedefleyen biyoaktif bileşiklerin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Yaşlı Hücrelerden Koşullu Ortamla In vitro Modelde Sağlıklı Hücreler Arası İletişimi Yeniden Sağlayacak Antioksidan Kombinasyonu

Öğrenin, H-Ras ile indüklenen hücresel yaşlanma sırasında WI-38 insan fibroblastlarında reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotipini nicel olarak ölçme yöntemlerini. Bu protokoller, akış sitometrisi ve ELISA kullanarak ROS ve IL-6, IL-8 gibi SASP faktörlerinin hassas analizini sağlar.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında (Video) | JoVE Journal

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Daha fazla video keşfet