Name: 3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Öğrenin, 3D baskılı şablon kullanarak zebra balığı embriyolarını yüksek verimli dizileme için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, 96 veya 384 kuyucuklu plakalara hızlı yerleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser "1000plan Gençlik" programı, başlangıç fonlar Kent Üniversitesi ve NSFC Grant # 21607115 ve 21777116 (LIN) tarafından desteklenmiştir.

1. tasarım ve üretim şablon diziliyor zebra balığı embriyolar
<ol><li>
Bir 12 tarafından 8 ile standart bir 96-şey plaka 96-şey düzen arraying şablonu tasarlayın. Boyutları listelenen Şekil 1A ' üst embriyo tuzak odası için kullanım (Ayrıca bkz: ek dosyası).
	<ol>
<li>Şekil 1B ve 1 D tuzak için de gösterilen boyutları kullanın.</li>
		<li>Boyutlar Şekil 1 c içinde alt vakum odası için kullanın.</li>
		<li>Şekil 1B adımında havada için boyutları kullanın / çıkış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D yazıcı (0,1 mm hassasiyetle) şablonu yazdırmak için kullanın; yazdırma işlemi için kullanılacak Malzemeler tablo önerilen reçine için bkz. Not: 0,1 mm hassasiyetle 3D yazıcılar arraying şablon imalatı için tavsiye edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Önerilen şablon yüzeyi için koyu gri veya siyah renktir.</li>
</ol>2. zebra balığı embriyo yumurtlama
<ol><li>İki çift erkek ve dişi balık yumurtlama önce bir gün kutusu çiftleşme başına yerleştirin. Ayrı erkek ve kadın tarafından şeffaf plastik bir bölücü.</li>
	<li>Bölücüler sabah erkek ve dişi balık karıştırmak için götürür.</li>
	<li>Erkek ve dişi balık çıkartın ve ince gözenekli süzgeç kullanarak zebra balığı embriyo toplamak. (Bkz. Tablo reçetesi) 250 mL yumurta ile embriyo su yıkama.</li>
	<li>Petri yemekler (90 mm çapında) Holtfreter'ın çözüm ile toplanan embriyo transfer ( Tablo malzemelerigörmek) ve ölü ve döllenmemiş embriyo bir stereomicroscope kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Embriyo 28.5 ° C kuluçka makinesine koyun. 4 h fertilizasyon (hpf) sonrası, embriyo gözlemlemek ve herhangi bir ölü ve sağlıksız embriyo kaldırın. Embriyo bir sonraki adım için hazırsınız.</li>
</ol>3. hazırlık şablonu diziliyor
<ol><li>Şablon 2-3 kez 500 mL deiyonize su ile yıkama ve kurutma fırın (45 ° C) 5 min için içine koy.</li>
	<li>Alt kamara film (Şekil 2Adım 1) sızdırmazlık bir parça ile teyp.</li>
	<li>Bir vakum pompası şablonun altındaki hava çıkışı üzerinden bağlayın. Not: 0.1 Mpa vakum pompası için önerilen maksimum vakum var. Kullanılan vakum gücünü unutmayın. Negatif basınç çok güçlü ise, bir haç şeklindeki basıncı düşürmek için mühürleme film üzerinde delik açın.</li>
</ol>4. bir 96-şey plaka zebra balığı embriyo diziliyor
<ol><li>Plastik transfer pipet kullanarak, yaklaşık 150 embriyo şablonu, Şekil 2' de, 2. adımda gösterildiği gibi yerleştirin.</li>
	<li>Vakum Pompası adım 3.3 mühürleme filmde tarafından mühürlü odası negatif basınç oluşturmak için hava çıkışına bağlayın.</li>
	<li>Her şey bir embriyo (Şekil 2, adım 3) entrapped kadar tüm şablon yatay sallamak. Not: Holtfreter'ın çözüm embriyoların her kuyuda sıkışıp kalırlar önce kurur, tuzak odasında ek Holtfreter'ın çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin.</li>
	<li>İlave Holtfreter'ın çözüm ve wells (Şekil 2, adım 4) entrapped değil embriyo atmak.</li>
	<li>Devre dışı bırakmak ve vakum pompası bağlantısını kesin.</li>
	<li>Standart bir 96-şey plaka baş aşağı şablonu (Şekil 2, adım 5) karşı yerleştirin ve her ikisini de aynı anda (Şekil 2, adım 6) döndürün.</li>
	<li>Şablon alt dokunun veya hava bağlanmak bir sıkıştırılmış gaz toz prizine olabilir tüm kapana kısılmış embriyo şablondan 96-şey plaka (Şekil 2, adım 6) aktarmak için.</li>
	<li>4.1-4,8 ek çok iyi tabak hazırlamak için adımları yineleyin.</li>
	<li>Mühürleme film kaldırın ve üstten 3 kez şablonu yukarıdan aşağıya doğru ileride kullanmak üzere 500 mL deiyonize su ile yıkayın. Not: şablon temizlemek için etanol gibi herhangi bir organik solventler kullanmayın.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Transformation%2C+Speciation%2C+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li>
<li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+%28nanotomy%29+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid%2C+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22in+CT+Images+with+Convolutional+Neural+Network.+Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar bir patent açıklanan 3D baskılı şablonundaki doldurdu.

Zebra balığı embriyo diziliyor 3D baskılı şablonu başarılı uygulanması için yakın ilgi gerektiren iki kritik adımlarda bu protokolü vardır.
Tasarımı arraying şablonu, en önemli faktör de tuzaktır. Yapar emin tek embriyo her kuyuda sıkışmış, bir tane çapı ve tuzak kuyunun derinliği ve ile delik çapi yakın dikkat etmelidir. Önerilen çapı içinde (koryon dahil) tipik bir embriyo çapının 1,5-2 katı olduğunu. İyi tuzak derinliği içinde 2 kez (koryon dahil) tipik bir embriyo çapını embriyo aynı iyi i...

Popüler bir model organizma olarak, zebra balığı1,2,3,4tıp ve toksikoloji alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Vitro platformları için karşılaştırıldığında, zebra balığı teklif daha fazla biyolojik karmaşıklığı bir ya da iki hücre tipleri değil sunabilir. Bütün bir organizma modeli, zebra balığı'nın büyük verimlilik, hızlı ve eşzamanlı embriyonik gelişim ve yüksek organ olmasının yanı sıra transparans büyük ölçekli toksisite veya uyuşturucu/bileşik5eleme için kullanılmak üzere bu modeli benzersiz avantajlar verdik. Her hafta yetişkin zebra balığı bir çift tarafından üretilen embriyolar yüzlerce diğer tüm hayvan modeller aşmak ve yüksek işlem hacmi tarama için uygun yaptık.
Zebra balığı kullanarak tipik prosedürü, embriyo seçimi, yumurtlama ve nereye onlar su daldırma yoluyla pozlama tabi uygun kaplar içine embriyo diziliyor yetişkin zebra balığı gibi manuel çalışma önemli miktarda içerir. Embriyo gelişimi izlenir ve ölüm, çıkım gücü ve anormallik gibi gözlemlenebilir bitiş noktaları kez el ile değerlendirilir ve kimyasal toksisitesi veya etkinliğinin belirtileri tanımlamaları ön kullanılan uyuşturucu ya da bileşikler. Kadar prosedürü hızlandırmak için otomatik görüntüleme ve bilgisayar destekli görüntü analizi gibi yaklaşımlar daha önce araştırılmalıdır. Örneğin, mikroskoplar yüksek içerik görüntüleme yetenekleri ile otomatik parlak alan veya floresan görüntüleme 96/384 iyi tabak6çeşitli gelişim aşamalarında, zebra balığı embriyo üzerinde gerçekleştirmek için adapte edilmiştir. Mikroskoplar ile birleştiğinde mikrosıvısal aygıtları zebra balığı larva beyin sinir hücreleri7görüntüleme için geçerli manipülasyonu yoluyla konumlandırmak için kullanılmıştır. Bu yaklaşımları önemli ölçüde görüntü satın almalar için geleneksel el ile işlem karşılaştırıldığında verimliliğini artırabilirsiniz. Ayrıca, çok sayıda ile oluşturulan resim, görüntü analiz araçları da veri işleme kadar hızlandırmak için Liu ve ark. ve Tu vd tarafından gösterildiği gibi geliştirilmiştir 8 , 9.
Görüntüleme ve görüntü analizi üretilen iş düzeyi arttıkça, tarama hızı sınırlaması adım genellikle onları 96 - veya 384-da kalıplara diziliyor anlamına gelir pozlama, zebra balığı embriyo hazırlama sürecinde yatıyor netleşti. Bu performans sorunu adım çözmek için robotik vizyon güdümlü geliştirilmiş olup, tüm tarafından Mandrell vd. 10 ve bizden daha önce el ile işleme ama aletleri yerine11 oldukça sofistike ve bu tür teknikler uygulamak için derin bir öğrenme eğrisi olduğunu. Bu nedenle, bir kolay kullanımlı yaklaşım zebra balığı tarama üretilen iş düzeyini daha da geliştirmek için önemli bir faktör haline gelir ve bu çalışmanın temel amacı sağlamak için.
Bu çalışmada, tasarlanmış ve şablon tarafından 3D baskı arraying bir embriyo fabrikasyon. Arraying bir şablon ile standart bir 96-şey plaka uygun kuyu içine zebra balığı embriyo tuzağa düşürmeye tasarlanmıştır. Embriyo seçerek ve onları tek tek bireysel kuyuya diziliyor yerine, bir embriyo tuzak ve dizi tüm 96 embriyo multiwall bir tabak hemen gerçekleştirebilir. Bu şablonu ve aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak, bir önemli ölçüde tarama kapasitesi en az on kat, el ile çalışmasına göre dönem alttan yukarıya ittirmek içinde istiyorsunuz multiwall tabak içine embriyo diziliyor verimliliğini artırmak olabilir. Aşağıda açıklanan protokol diziliyor şablon, zebra balığı yumurtlama, embriyo toplama ve diziliyor için genel bir tasarım içerir. Şekil 1 arraying şablonu genel tasarım gösterir. Şekil 2 parça 3 ve 4'de anlatıldığı şablonu kullanarak adım adım Protokolü özetini gösterir.

<table><tbody><tr><td>Zebra Balığı Tesisi Shanghai</td><td>Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Çiftleşme kutusu</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Şişesi, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat ve nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Metilen Mavisi Hidrat</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Deniz</td><td>Tuzları Anında Okyanus</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyici</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Kontrollü Damla Pastör Pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Biyokimyasal inkübatör</td><td>Şangay Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D yazıcı</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Işığa duyarlı reçine</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcı PCR Plaka Contaları</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Çok 8 kanallı pipet 30 - 300 &mu; l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Sıkıştırılmış Gaz Silgi</td><td>Şangay Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Su</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma fırını</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>Sistem suyu</td><td></td><td></td> ile <td>tesisten su çıkışı s su sistemi</td></tr><tr><td>Yumurta suyu</td><td></td><td></td><td>Seyreltik 60mg " Anında Okyanus" deniz tuzları ve 1 L DI suda 0.25 mg/L metilen mavisi</td></tr><tr><td>Holtfreter' s çözeltisi</td><td></td><td></td><td>7.0 g Sodyum klorür (NaCl), 0.4 g Sodyum bikarbonat (NaHCO3), 0.1 g Potasyum Klorür (KCl), 0.235 g Kalsiyum klorür (CaCl2.2H<>sub2O) 1.9 L DI suda çözün. HCl kullanarak pH'ı 7'ye ayarlayın ve Di su kullanarak hacmi 2 L'ye ayarlayın</td></tr></tbody></table>

3 boyutlu (3d)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Zebra balığı genel olarak tanınan tatlı su organizma gelişim biyolojisi, Çevresel Toksikoloji ve insan hastalığı sık kullanılan ilgili araştırma alanları var. Sayesinde benzersiz özellikleri büyük verimlilik, vb, embriyo kalınlığı, hızlı ve eş zamanlı geliştirme de dahil olmak üzere, zebra balığı embriyolar genellikle büyük ölçekli toksisite değerlendirilmesi kimyasal maddeler için kullanılır ve uyuşturucu/tarama bileşik. Tipik prosedürü yetişkin zebra balığı yumurtlama, embriyo seçimi ve embriyoların çok iyi kalıplara diziliyor içerir. Oradan, embriyo pozlama ve kimyasal toksisitesi tabi olan veya uyuşturucu/bileşikler etkinliği nispeten hızlı bir şekilde bağlı fenotipik gözlemler olarak değerlendirilebilir. Bu işlemler arasında diziliyor embriyo üretilen iş düzeyi sınırlar en zaman alıcı ve emek yoğun adımlardan biridir. Bu protokol için 3D baskılı arraying şablon kullanımı ile birleştiğinde yapar işleme kadar zahmetli Bu adım hızlandırmak için vakum yenilikçi bir yaklaşım sunuyoruz. İletişim kuralı burada genel tasarımı arraying şablon, detaylı deneysel kurulum ve temsilcisi sonuçlarına göre takip adım adım yordamı açıklar. Uygulandığında, bu yaklaşım zebra balığı embriyo konular test olarak kullanarak araştırma uygulamaları çeşitli yararlı ispatlamak zorundadır.

Şekil 3 tipik bir 3D baskılı arraying şablonunu gösterir. Bu şablon ışığa duyarlı reçine hammadde olarak kullanır ve bir 3D printerlere harcama maddeler tarafından yapıldı; siyah boya tabakası embriyo rengini daha iyi bir kontrast sağlamak için uygulandı. 96 wells (12 tarafından 8) konumunu ile standart bir 96-şey plaka uyacak şekilde tasarlanmıştır. Benzer şekilde, 384 (24 den 16) iyi şablon da tasarlanabilir ve aynı yöntemi kullanarak fabrikasyon. Ters odas...

Burada, tasarım ve yüksek işlem hacmi zebra balığı embriyo bir 96-şey plaka diziliyor için böyle şablon kullanımı ayrıntılı yordam tarafından ardından arraying bir zebra balığı embriyo imal için bir protokol mevcut.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Bu yöntem, Zebra balığı embriyo dizileme prosedürünü önemli ölçüde hızlandırabilir ve Zebra Balığı'nı yüksek verimli tarama için gerçekten uygun hale getirebilir. Bu tekniğin ana avantajı, Zebra balığı embriyolarını 96 veya 384 oyuklu bir matrise önceden dizmek için 3D baskılı bir şablonun kullanılmasıdır, bu da yüksek verimli bir plaka hazırlama sürecini kolaylaştırır. Yöntem fikri ilk olarak, modüler bir plakanın her bir oyuğuna tek tek embriyoları manuel olarak seçip seçerek nanopartiküllerin taranmasını gerçekleştirirken aklımıza geldi ve verimliliği artırmak istedik.Tianyu'ya ek olarak, diğer yüksek lisans öğrencisi Yue Jiang da prosedürü gösterecek. Bu prosedüre, standart bir 96 kuyulu plakaya uyan on ikiye sekiz 96 kuyulu bir düzene sahip dizi şablonunun tasarımıyla başlayın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi.Şablonu yazdırmak için 0,1 milimetre hassasiyete sahip bir 3D yazıcı kullanın. Şablonun bazı temel bileşenleri, tuzak odası, tuzak kuyusu, vakum odası ve hava giriş çıkışıdır. Zebra balığı embriyo yumurtlamasını gerçekleştirmek için önce erkek ve dişileri şeffaf bir plastik bölücü ile ayırın.Ardından, yumurtlamadan bir gün önce çiftleşme kutusuna iki çift erkek ve dişi balık yerleştirin. Yumurtlama gününde, erkek ve dişi balıkları karıştırmak için sabahları bölücüleri çıkarın. Erkek ve dişi balıkları çıkarın ve ince gözenekli bir süzgeç kullanarak Zebra balığı embriyolarını toplayın.Embriyoları 250 mililitre yumurta suyu ile yıkayın. Toplanan embriyoları Holtfreter Solüsyonu ile Petri kaplarına aktarın. Stereo mikroskop kullanarak ölü ve döllenmemiş embriyoları çıkarın.Embriyoları 28,5 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Döllenmeden dört saat sonra embriyoları gözlemleyin ve ölü ve sağlıksız embriyoları çıkarın. Embriyolar artık bir sonraki adım için hazırdır.Şablonu beş dakika kurutma fırınına koymadan önce 500 mililitre deiyonize su ile iki ila üç kez yıkayın. Ardından, alt hazneyi bir parça sızdırmazlık filmi ile bantlayın. Sızdırmazlık filmi ile kapatılmış haznede negatif basınç oluşturmak için şablonun altındaki hava çıkışından bir vakum pompası bağlayın.Plastik bir transfer pipeti kullanarak, şablona yaklaşık 150 embriyo yerleştirin. Her bir oyukta bir embriyo sıkışana kadar tüm şablonu yatay olarak sallayın. Bu adımda, mevcut her Zebra balığı embriyosunu kontrol etmek ve emin olmak çok önemlidir.Holtfreter arabelleği çok düşükse, şablonu sallayarak ek arabellek eklenebilir. Fazladan Holtfreter Solüsyonunu ve kuyucuklarda sıkışıp kalmayan embriyoları atın. Vakum pompasını kapatın ve bağlantısını kesin.Standart bir 96 kuyulu plakayı şablona karşı baş aşağı yerleştirin ve her ikisini de aynı anda döndürün. Sıkışan tüm embriyoları şablondan 96 oyuklu plakaya aktarmak için şablonun altına dokunun veya hava çıkışını sıkıştırılmış bir gaz toz alma kabına bağlayın. Son olarak, sızdırmazlık filmini çıkarın ve şablonu ileride kullanmak üzere 500 mililitre deiyonize su ile yukarıdan aşağıya üç kez yıkayın.Burada, şablon tarafından dizilmiş 96 oyuklu bir plakanın kısmi görüntüsü gösterilmektedir. Tersine, bu görüntü manuel olarak dizilmiş 96 oyuklu bir plakanın kısmi görüntüsünü göstermektedir. Embriyoların manuel ve dizilim şablonu yöntemleri ile kaplandıktan sonraki genel sağlık durumu burada görüntülenir.Embriyoların yumurtadan çıkma, sağkalım ve malformasyon oranlarına dayanarak, her iki durumda da embriyoların genel sağlığı üzerinde önemli bir etki gözlenmemiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa sadece iki ila üç dakika içinde bir 96 veya 384 kuyulu plaka hazırlayacaktır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların bu model organizmanın yeni özelliklerinden tam olarak yararlanmalarının ve in vitro yüksek verimli taramayı gerçekten başarmalarının yolunu açtı.

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.

Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Polietilen tereftalat (PET) laminasyonu kullanarak mikroakışkan cihazlar üretmek için yenilikçi bir yöntem, birden fazla canlı zebra balığı embriyosunu yakalamanın ve görüntülemenin maliyetini ve karmaşıklığını önemli ölçüde azaltır.

Çoğullanmış Zebra Balığı Görüntüleme için Düşük Maliyetli Polietilen Tereftalat Laminasyon Mikroakışkan Tasarımları

Öğrenin, 3D baskılı şablon kullanarak zebra balığı embriyolarını yüksek verimli dizileme için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, 96 veya 384 kuyucuklu plakalara hızlı yerleştirme sağlar.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

Daha fazla video keşfet