Name: Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Keşfedin antimikrobiyal peptid yerelleştirmesini E. coli ve B. megaterium kullanarak görselleştirme yöntemiyle. Bu protokol, hücre zarı dinamiklerini ve peptit-bakteri etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIH-NIAID) ödülü R15AI079685 tarafından desteklenmiştir.

1. çözüm hazırlık
Not: E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki, sırasıyla üretmek için 1.1-1.9 ve 1.8-1,11 adımlarda açıklanan çözümler hazırlamak.
<ol><li>1 hazırlamak M Tris-Cl, 10.34 g Tris HCl ve Tris OH 4,17 g 50 ml dH2O 125 mL şişe içinde eriterek tarafından pH 7.8. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Çözüm bir (20 mM MgCl2, 0,7 M sukroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 11.98 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Çözüm B (10 mM MgCl2, 0, 8 M Sükroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>0, 8 M Sükroz 50 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>5 mg/mL deoksiribonükleaz hazırlamak ben (DNaz ben) 0,015 g DNaz eriterek tarafından ben dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm</li>
	<li>0,125 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlamak, 0.698 g EDTA disodyum eriterek tarafından pH 8.0 içine 15 mL dH2O'bir 125 mL şişe (372.2 g/mol) kurutmak. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>600 µg/mL sefaleksin 50 ml dH2O'bir 125 mL şişe (365.404 g/mol) sefaleksin hidrat 0,03 g çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>5 mg/mL lizozim 0,015 g lizozim dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm</li>
	<li>%3 w/v Trypticase soya suyu (TSB) TSB dH2O 2 lt şişeye 1 litre içinde 30 g çözülerek hazırlayın. Aliquot çözüm 25 mL veya 100 mL sırasıyla E. coli spheroplasts veya B. megaterium önceki, hazırlanmasında kullanılacak TSB içeren şişeler içine. Sıvı orta sterilize etmek için basınçlı kap şişeler. Steril TSB-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında ya da 4 ° C.</li>
	<li>Çözüm C (1 M Sükroz, 0,04 M maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) 34.23 g sükroz (342.3 g/mol), 0,46 g Maleik asit (116.07 g/mol) ve 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O'bir 250 mL şişe 100 ml çözülerek hazırlayın. PH 6,5 için ayarlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>200 mL protoplast orta 100 mL % 3 w/v TSB ve 100 mL solüsyon C 1 L cam şişede karıştırarak hazırlayın. Otoklav çözüm sterilize ve oda sıcaklığında saklamak için.</li>
</ol>2. gecede kültür hazırlanması
Not: Bölüm 2-4 uygun steril teknikleri kullanarak gerçekleştirin. İstenirse, bakteriyel bir yük bir plazmid potansiyel kirlilik azaltmak antibiyotik direnci için içerir. Bir tür antibiyotik direnci ile kullanıyorsanız, gerekli antibiyotikler adımları 2.1, 3.1-3.2 ve 4.1-4.4 ekleyin.
<ol><li>Bir gecede kültür steril pipet ucu kullanarak ve 2-3 mL % 3 w/v TSB içeren 14 mL kültür tüp içine yerleştirerek bir koloni bakterilerin seçerek hazırlayın. 37 ° C'de 16 – 21 h için sallayarak süre kuluçkaya.</li>
</ol>3. gram-negatif E. coli Spheroplasts hazırlanması
<ol><li>250 mL şişeye gecede kültür 1: 0 3 w/v TSB 25 mL hacminde sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,5-0,8 600 optik bir yoğunluk ulaşmıştır kadar yaklaşık 2,5 h sallayarak süre kuluçkaya nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.</li>
	<li>Bu kültür 1:10 % 3 w/v TSB 30 ml 250 mL şişeye sulandırmak ve 37 ° C'de yaklaşık tek hücre filamentler üretmek için 60 µg/mL Sefaleksin (347.4 g/mol) huzurunda 2,5 h için sallayarak süre kuluçkaya uzunluğu 50-150 µm , gözlemlenebilir ışık mikroskobu (Şekil 1B) kullanarak 1000 X büyütme altında olan.</li>
	<li>Bakteriyel çözüm 1.500 x g, 4 dk. Decant 4 ° C de centrifuging tarafından filamentler hasat ve Pelet rezerve etme süpernatant, atın.</li>
	<li>Filamentler yavaşça 0,8 M sukroz, Pelet bozmamaya dikkat edin 1 mL ekleyerek yıkayın. 1 dk. için kuluçkaya ve sonra süpernatant Pelet bozmadan atın.</li>
	<li>1 150 µL eklemek M Tris-Cl (pH 7.8), 5 mg/mL lizozim 120 µL, 5 mg/ml DNaz 30 µL ben ve sipariş için Pelet ve çözüm için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 120 µL 0,125 M EDTA içinde onların anılan sıraya göre.</li>
	<li>Çözüm A 1 mL 1 dk yavaşça çözüm el ile dönen bir micropipette kullanarak 3.5 içinde hazırlanan solüsyona yavaş yavaş ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dk için çözüm kuluçkaya.</li>
	<li>7 mL 4 ° C çözeltisi B iki 15 mL konik tüpler içine koymak. 3.6 her iki tüpler içinde hazırlanan solüsyona eşit miktarda ekleyebilirsiniz. Belgili tanımlık eriyik vasıl 1.500 x g, 4 ° C 4 dk için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde tüm 1-2 mL süpernatant Pelet bozmadan çıkarın. Pelet yavaşça P1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Görsel olarak spheroplasts oluşumu 1000 X büyütme ışık mikroskobu (Şekil 1 c) kullanarak da örneğine gözlemleyerek denetleyin.</li>
	<li>Spheroplasts-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.</li>
</ol>4. gram-pozitif B. megaterium önceki hazırlanması
<ol><li>Bir 250 mL şişe 100 ml % 3 w/v TSB gecede kültür 1:1,000 sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,9-optik bir yoğunluğa ulaşmıştır kadar yaklaşık 4.5 için s sallayarak süre kuluçkaya 1.0 600 nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.</li>
	<li>Sıvı kültür iki 50 mL konik boru ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj içine dökün.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, her iki konik boru üzerinden süpernatant atmak. Her Pelet 2.5 mL protoplast ortamda resuspend ve resuspended çözümleri tek bir konik tüp birleştirebilirsiniz. 125 mL şişe kombine resuspended çözümünde pipette.</li>
	<li>5 mg/mL lizozim 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya sallayarak süre.</li>
	<li>Önceki küreler (Şekil 2) yerine şişmiş çubuklar olarak görüntülenir bakteri gibi herhangi bir usulsüzlük belirterek hafif bir mikroskop kullanarak 1000 x büyütme altında gelişimini izlemek. Serolojik pipet kullanarak, çözüm 15 mL konik tüp ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj aktarın.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 5 mL protoplast medyada yeniden askıya alma. Önceki-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.</li>
</ol>5. peptid çözüm ve membran boya görüntüleme için hazırlanması
<ol><li>
Peptid çözüm
	<ol>
<li>Alüminyum Folyo sarılı bir microfuge tüp içinde BF2 P11A 800 µL dH2içinde O. kullanım protein konsantrasyonu ölçümleri yapmak için en az bir triptofan kalıntı içeren bir peptid etiketli FITC 2 mg geçiyoruz.</li>
		<li>Spectrophotometrically, peptid çözüm 280, absorbans ölçmek nüsha nm. Molar tükenme katsayısı triptofan (5.700/Mcm) kullanarak peptid konsantrasyonu hesaplayın.</li>
		<li>2O 100-200 µM. Store-20 ° C'de microfuge tüp içinde son bir konsantrasyon için ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılmış dH peptid konsantrasyon sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membran boya
	<ol>
<li>Bir microfuge tüp di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) 10 mM stokunun di-8-ANEPPS 843.3 µL DMSO, içinde 5 mg çözülerek hazırlayın. Işıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.</li>
		<li>Bir microfuge tüp 0,03 mM di-8-ANEPPS 1 mL 997 µL DMSO için 10 mM di-8-ANEPPS 3 µL ekleyerek hazırlayın. Microfuge tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. E. coli Spheroplasts ve d. megaterium önceki kullanarak Confocal mikroskobu görselleştirme
<ol><li>Spheroplasts veya önceki bir poli-L-lizin kaplamalı cam slayt üzerine 5 µL pipet. AMP (100-200 µM) slayt için etiketli FITC 2 µL ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya.</li>
	<li>Membran boya di-8-ANEPPS (0,03 mM) 1 µL slayda ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya. Bir cam coverslip ile kapak ve oje ile kapatın.</li>
	<li>Confocal mikroskop ve argon lazeri aç. Argon lazer % 20 güç çıkışı ve % 20 iletim ayarlayın.</li>
	<li>Emisyon dalga boyu aralığı 499-532 nm ve 670-745 nm FITC etiketli peptid emisyon kanal ve di-8-ANEPPS-etiketli membran boya emisyon kanalında, anılan sıraya göre ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü önceki veya 63 X amacı ile spheroplasts (resim 1 ve Şekil 2). 8-bit almak için görüntüleme yazılımı kullanın, 512 x 512 bileşik z-yığın görüntüleri spheroplast veya protoplast tamamını 0.5 µm dilim oluşur. Not: taşma payı-aracılığıyla görüntüleme spheroplasts ve önceki emisyon azaltmak için dikkatli bir değerlendirme alın. Ayrıntılar için bkz.</li>
</ol>7. AMP yerelleştirme karakterizasyonu
<ol><li>Bileşik z-yığın görüntü görüntüleme yazılımı açın. Spheroplast veya işgal merkezi en dilim bulun ve bir dairesel bölge, faiz (ROI) yerleştirin (çapı 0.3 µm) membran (yatırım getirisi 1), spheroplast veya işgal (ROI 2) ortasına bir tane ve bir yere spheroplast veya ölçmek için işgal arka plan Floresan (ROI 3) (Şekil 5). Doymuş piksel dahil kaçının. Her yatırım getirisi floresan yoğunluğu görüntüleme yazılımı tarafından hesaplanır. Not: peptid membran bütünlüğü için Yerelleştir değil ne zaman, nerede peptid yerelleştirilmiştir alan membran üzerinde yatırım getirisi 1 durumlarda çizin.</li>
	<li>Aşağıdaki eşitliği hücre içi peptid floresan yoğunluğu membran peptid floresan yoğunluğu için oranını belirlemek için kullanın: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Not: Yatırım getirisi 3 floresan yoğunluğu arka plan floresan için hesap için floresans yoğunluklarda ROI 2 ve yatırım getirisi 1 den çıkarılır.</li>
</ol>

<ol><li>Baltzer, S. A., Brown, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+promising+alternatives+to+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).</li>
<li>Hancock, R. E., Sahl, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+and+host-defense+peptides+as+new+anti-infective+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies.</a> Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).</li>
<li>Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16847082">Peptide antimicrobial agents.</a> Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).</li>
<li>Toke, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+new+candidates+in+the+fight+against+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections.</a> Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in 2014.</a> Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).</li>
<li>Epand, R. M., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+antimicrobial+peptides+and+their+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action.</a> Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).</li>
<li>Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Delivery+to+the+Brain+via+Adsorptive-Mediated+Endocytosis%3A+Advances+With+SynB+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors.</a> AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).</li>
<li>Splith, K., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+with+cell-penetrating+peptide+properties+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa.</a> European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).</li>
<li>Bustillo, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+analysis+of+hipposin%2C+a+histone-derived+antimicrobial+peptide+consisting+of+membrane+translocating+and+membrane+permeabilizing+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).</li>
<li>Koo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relations+of+parasin+I%2C+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide.</a> Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).</li>
<li>Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+bioactivity+of+antimicrobial+peptides+by+addition+of+amino-terminal+copper+and+nickel+%28ATCUN%29+binding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs.</a> ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).</li>
<li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Action+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+II%3A+Buforin+II+Kills+Microorganisms+by+Penetrating+the+Cell+Membrane+and+Inhibiting+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).</li>
<li>Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+analysis+of+buforin+II%2C+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide%3A+The+proline+hinge+is+responsible+for+the+cell-penetrating+ability+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).</li>
<li>Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+histone-derived+antimicrobial+peptides+use+different+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).</li>
<li>Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Spheroplasts+as+a+Model+for+Visualizing+Membrane+Translocation+of+Antimicrobial+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).</li>
<li>Chassy, B. M., Giuffrida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Lysis+of+Gram-Positive%2C+Asporogenous+Bacteria+with+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme.</a> Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).</li>
<li>Fitz-James, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+and+Chemical+Studies+of+the+Browth+of+Protoplasts+of+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophysic.+and+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium.</a> J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).</li>
<li>Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-sensitive+ion+channel+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).</li>
<li>Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).</li>
<li>Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNadeau%2C+JL+%22Introduction+to+Experimental+Biophysics%3A+Biological+Methods+for+Physical+Scientists%22">Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists</a>. , CRC Press. (2016).</li>
<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+Escherichia+coli+spheroplast+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).</li>
<li>Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+%28AMPs%29+produced+by+Saccharomyces+cerevisiae+induce+alterations+in+the+intracellular+pH%2C+membrane+permeability+and+culturability+of+Hanseniaspora+guilliermondii+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells.</a> Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Translocation+Mechanism+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).</li>
<li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (59), e3571(2012).</li>
<li>van der Kraan, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrampin%3A+a+novel+antimicrobial+peptide+in+the+N1-domain+of+bovine+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin.</a> Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).</li>
<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li>
<li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li>
<li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers%3A+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li>
<li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li>
<li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melittin-Induced+Permeabilization%2C+Re-sealing%2C+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li>
<li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.

Burada sunulan protokolleri genişlemiş, küresel bakteri bulun, yönlendirmek ve görüntü çok daha kolay olduğundan daha büyük örnek boyutları bakteriyel görüntülerin daha hızlı elde etmek araştırmacılar için uygun olun. Birkaç açıdan değerli, veri toplamak için geliştirilmiş bu yeteneğidir. İlk olarak, peptid yerelleştirme desen daha sistematik bir kantitatif analiz sağlar. Nitel eğilimleri daha küçük görüntüleri kümelerinden göstermiş olabilir iken, yüksek-nitelik imge sadece büyük örnek bir dizi ortaya daha nüanslı yerel...

Antimikrobiyal peptidler (amper) önem onların potansiyel kullanım nedeniyle konvansiyonel antibiyotik1,2,3,4,5alternatif olarak kazanmıştır. Amper ya hücre zarı arasında translocating ve hücre içi bileşenleri veya nükleik asitler gibi ile etkileşerek hücre içeriği6kaçağı neden membran permeabilizing tarafından bakterileri öldürmek. Sigara zorlanarak geçirimsiz hücre zarı7,8çapraz olabilir çünkü antibiyotik olarak kullanımlarının yanı sıra, amper translocating ilaç teslim uygulamalar için adapte. Biz, bu nedenle, temel AMP mekanizmaları uyuşturucu tasarımda kullanımları için zemin hazırlamaya eylem anlamak arıyorlar.
Confocal mikroskobu yerelleştirme desenleri fluorescently etiketli amper onların mekanizması eylem9,10,11,12, ilgili bilgiler sağlayan bakteri hücreleri içinde değerlendirmek için bir yol sunar 13 , 14. bakteri membran etiketleme tarafından kimse fluorescently etiketli bir peptid membran veya bakteri hücre hücre içi boşluğun üzerine yerelleştirir belirleyebilirsiniz. Ancak, bu tekniğin konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ve değişken yönlendirmesi slayt15bakteri nedeniyle zorlu Imaging yapabilirsiniz bakteriler, küçük boyutu ve çubuk şeklinde ile sınırlıdır.
Gelişmiş görsel olarak fluorescently etiketli peptid yerelleştirme desenleri confocal mikroskobu kullanarak etkinleştirmek için sunulan Yöntem hedefidir. Görselleştirme gelişmiş küçük, ince, çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) kapatarak genişlemiş, küresel formları içine bakteri olarak anılacaktır spheroplasts (için gram-negatif suşları) ve önceki (için gram-pozitif suşları)16,17,18,19,20,21. Artan büyüklükleri ve bir bakteri yönünü bir slaytta, görüntüleme için alakasız yapar simetrik şekilleri nedeniyle spheroplasts ve önceki görüntü için daha kolay olur. Buna ek olarak, biz kantitatif amper yerelleştirme veya translocating her iki membran karakterize için confocal mikroskobu verileri çözümlemek için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntemler uygulamak ayırt etmek fluorescently peptid yerelleştirme desenleri etiketli kolaylaştırır. Burada sunulan protokolleri membran-aktif ajanlar amper hücre penetran peptidler de dahil olmak üzere dışında çeşitli lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bir avantaj bu tekniğin bu hücre hücre heterojenite15, aksine tanımlamak için yaygın olarak kullanılan diğer floresans deneyleri gösterebilir bir tek hücre düzeyinde anlayışlar amper etki mekanizması sağlar eylem yalnızca sağlar toplu tahminleri9,22,23,24,25amper mekanizmaları. Hücre girişini, lipid veziküller24gibi değerlendirmek için kullanılan diğer modellere kıyasla daha fizyolojik ilgili15 oldukları için spheroplasts ve AMP hücre girişini değerlendirmek için önceki belirli yararlı26 yaşında.

<table><tbody><tr><td>Trizma hidroklorit (Tris HCl)</td> <td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma bazı (Tris OH)</td> <td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Orijinal protokol geliştirmede Sigma 106361 kullanıldı; 106361, yedek olarak ED2SS ile kesildi</td></tr><tr><td>Sefaleksin hidrat</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Triptikaz soya suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>edilen di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Orijinal protokol geliştirmede Sigma D8779 kullanıldı; D8779, yedek olarak 34869 ile durduruldu</td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Şırınga Filtresi, w / 0.2 & mu; m HT Tuffryn Membran</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>Görüntü alımı için</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Gelişmiş Floresan</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Görüntü işleme için</td></tr></tbody></table>

Üretim ve bakteriyel spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Peptid yerelleştirme desenleri bakteri içinde değerlendirmek için bir yöntem olarak confocal mikroskobu kullanımı yaygın olarak konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ile engellenir. Kolayca çözümlemesi için verilen mikroskop geliştirilemez gibi biz küçük çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) dönüştürmek için protokolleri mevcut daha büyük, kolayca görüntülü küresel formlara spheroplasts veya önceki adı. Bu dönüşüm gözlemciler hızla ve açıkça peptidler kendilerini (Yani, membran yerelleştirme) bakteriyel membran lodge veya girin (Örneğin, translocating) hücre membran çapraz belirlemek izin verir. Bu yaklaşım ile biz de peptidler yerelleştirme veya translocating membran karakterize etmek için sistematik bir yöntem mevcut. Bu yöntem çeşitli membran-aktif peptidler ve bakteri suşları için kullanılabilir iken, biz göstermek belgili tanımlık yarar bu protokolün Buforin II P11A arasındaki etkileşimin gözlemleyerek (BF2 P11A), E. coli ile antimikrobiyal bir peptid (AMP), spheroplasts ve d. megaterium önceki.

Peptidler bakteriyel membran yerelleştirmek veya bakteriyel membran arasında kolayca translocate bakteri büyütmek ve onları küresel yaparak, biz kolayca ayırt edebilirsiniz. Konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları membran için yerelleştirilmiş sinyalleri ile üst üste gözükeceği peptid sinyalleri membran veya normal bakteri hücre içi alan ortaya olup olmadığını ayırt etmek zor yapmak hücre içi alanı (Şekil 3A). Buna ek olarak, membran marker ve ko...

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Bu yöntem, antimikrobiyal peptit alanında, peptitlerin hücre zarına lokalize olup olmadığı veya hücre zarı boyunca yer değiştirip değiştirmediği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sferoplastların ve protoplastların kullanılması, bakteri hücresi görüntülemede karşılaşılan çözünürlük zorlukları olmadan fizyolojik olarak ilgili bir model sistemde peptit lokalizasyonunun görselleştirilmesine ve analizine olanak tanır. Bu yöntem antimikrobiyal peptitler hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre penetran peptitler gibi diğer zar aktif maddelere de uygulanabilir.Gram-negatif E.coli sferoplastları ve Gram-pozitif B.megaterium protoplast biyolojik güvenlik kabininde veya laminer akış başlığında uygun steril teknik kullanılarak hazırlanmalıdır. İstenirse, bakteri suşları antibiyotiğe dirençli bir plazmit içerebilir ve sferoplastlar ve protoplastlar açık bir laboratuvar tezgahında hazırlanabilir. Bu videoda sferoplastiler ve protoplastlar, antibiyotiğe dirençli bakteri suşları kullanılarak açık bir laboratuvar tezgahında hazırlanmaktadır.Bir gece kültürü oluşturmak için, tek bir bakteri kolonisini katı bir agar kültür plakasından, çalkalama ile 37 santigrat derecede 16 i

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Rekombinant gelen kolesterol bağlayıcı toksin Streptolizin O arındırıcı...

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Kaynak: Figueroa, D.M., et.al. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, önce filamentasyonu indüklemek için hücre bölünmesini inhibe ederek, ardından hücre duvarının enzimatik sindirimini izleyerek Escherichia coli sferoplastlarının üretimini göstermektedir. İşlem, mikroskobik gözlem için uygun sferoplast oluşumunu ve stabilitesini sağlamak için bir şelatlama maddesi,...

E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Kaynak: Figueroa, D.M., ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, Gram pozitif bakteri Bacillus megaterium'dan protoplast üretmek için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Gram Pozitif Bakteri Bacillus megaterium'dan Protoplast Üretimi

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Kaynak: Figueroa, D. ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastlar ve protoplastların üretimi ve görselleştirmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, çubuk şeklinde, gram-negatif bakterilerden sferoplastların hazırlanmasını gösteriyor. Bakteriler, bir antibiyotik varlığında yetiştirilerek uzun filamentler oluşturur. Bunlar hipertonik bir çözeltiyle yıkanır ve dış hücre duvarını çıkarmak için liz tamponu ile işlenilir. Hipotonik tedavi, soğutulmuş...

Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Bu protokol, hücre dışı membrana bağlı veziküller içinde paketlenmiş, tipik olarak çözünmeyen veya disülfür bağı içeren proteinler de dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin bakteriyel üretimi için ayrıntılı bir yöntem açıklamaktadır. Bu, uygulamalı biyoteknoloji ve tıp da dahil olmak üzere çok yönlü bilimsel araştırma alanlarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

Keşfedin antimikrobiyal peptid yerelleştirmesini E. coli ve B. megaterium kullanarak görselleştirme yöntemiyle. Bu protokol, hücre zarı dinamiklerini ve peptit-bakteri etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir model sunar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

Daha fazla video keşfet