Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

Bu yöntem, antimikrobiyal peptit alanında, peptitlerin hücre zarına lokalize olup olmadığı veya hücre zarı boyunca yer değiştirip değiştirmediği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sferoplastların ve protoplastların kullanılması, bakteri hücresi görüntülemede karşılaşılan çözünürlük zorlukları olmadan fizyolojik olarak ilgili bir model sistemde peptit lokalizasyonunun görselleştirilmesine ve analizine olanak tanır. Bu yöntem antimikrobiyal peptitler hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre penetran peptitler gibi diğer zar aktif maddelere de uygulanabilir.

Gram-negatif E.coli sferoplastları ve Gram-pozitif B.megaterium protoplast biyolojik güvenlik kabininde veya laminer akış başlığında uygun steril teknik kullanılarak hazırlanmalıdır. İstenirse, bakteri suşları antibiyotiğe dirençli bir plazmit içerebilir ve sferoplastlar ve protoplastlar açık bir laboratuvar tezgahında hazırlanabilir. Bu videoda sferoplastiler ve protoplastlar, antibiyotiğe dirençli bakteri suşları kullanılarak açık bir laboratuvar tezgahında hazırlanmaktadır.

Bir gece kültürü oluşturmak için, tek bir bakteri kolonisini katı bir agar kültür plakasından, çalkalama ile 37 santigrat derecede 16 ila 21 saatlik bir inkübasyon için iki ila üç mililitre yüzde üç triptikat soya suyu (TSB) içeren 14 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarmak için steril bir mikropipet ucu kullanın. Gram-negatif E.coli sferoplastlarını hazırlamak için, gece boyunca kültürü bir ila 100 oranında ve 250 mililitrelik bir şişede 25 mililitre TSB'yi seyreltin ve bakterileri 2,5 saat daha çalkalama inkübatörüne geri koyun. Çözelti 600 nanometrede 0.5 ila 0.8 arasında bir optik yoğunluğa ulaştığında, kültürü, mililitre başına 60 mikrogramlık bir nihai etkili konsantrasyon ile ikinci bir 2.5 saatlik inkübasyon için 250 mililitrelik yeni bir şişede taze TSB'de bir ila on oranında seyreltin.

1000x büyütmede ışık mikroskobu altında görselleştirildiği gibi, yaklaşık 50 ila 150 mikrometre uzunluğunda tek hücreli filamentler üretmek. Filamentleri toplamak ve süpernatanı boşaltmak için bakteri çözeltisini santrifüjleyin. Filamentleri, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek bir mililitre 0.8 molar sakarozun nazikçe eklenmesiyle yıkayın.

Bir dakika sonra, peleti bozmadan süpernatanı atın ve belirtilen reaktifleri kendi sıralarına göre filamentlere ekleyin. Oda sıcaklığında on dakika sonra, çözeltiyi elle hafifçe döndürürken, bir dakikalık bir süre boyunca yavaş yavaş bir mililitre çözelti A ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin, daha sonra filament süspansiyonunu, yedi mililitre dört santigrat derece çözelti B içeren iki 15 mililitrelik konik tüp arasında iki eşit alikota bölün

Peletleri nazikçe yeniden askıya almak için bir p1000 mikropipet kullanın. Işık mikroskobu ile sferoplast oluşumu için numunenin küçük bir alikotunu kontrol edin. Spferoplast daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar veya üç donma çözülme döngüsünden geçene kadar saklanabilir.

Gram-pozitif B.megaterium protoplastlarını hazırlamak için, gece boyunca bakteri kültürünü, 37 santigrat derecede 4.5 saatlik bir inkübasyon için 250 mililitrelik bir şişede 100 mililitre yüzde üç TSB'de bir ila 1000 oranında seyreltin. Sıvı kültür, 600 nanometrede 0.9 ila 1.0 arasında bir optik yoğunluğa ulaştığında, bakterileri santrifüjlemeleri için iki adet 50 mililitrelik konik tüp arasında bölün ve süpernatanları şaşırtmak için asirolojik pipet kullanın. Peletleri tüp başına 2,5 mililitre protoplast ortamında yeniden askıya alın ve süspansiyonu 125 mililitrelik bir şişede kültür için tek bir konik tüpe çekin.

Çalkalama ile 37 santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için kültüre mililitre lizozim başına bir mililitre ekleyin. Işık mikroskobu altında protoplastın büyümesinin izlenmesi ve küreler yerine şişmiş çubuklar olarak görünen bakteriler gibi herhangi bir düzensizliğin not edilmesi. İnkübasyonun sonunda, süspansiyonu santrifüjleme için 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve peleti beş mililitre protoplast ortamında yeniden süspanse edin.

Protoplast daha sonra eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar veya üç donma çözülme döngüsünden geçene kadar saklanabilir. Sferoplast veya protoplastın görselleştirilmesi için, ilgilenilen süspansiyonun beş mikrolitresini Poli L Lizin kaplı bir cam slayt üzerine aktarın, ardından 100 ila 200 mikromolar antimikrobiyal peptit veya AMP etiketli iki mikrolitre fitc aktarın. Işıktan korunan üç dakikalık bir inkübasyondan sonra, karanlıkta üç dakikalık bir inkübasyon için numuneye bir mikrolitre uygun bir zar kalıbı ekleyin.

Kuluçka işleminin sonunda, etiketli sferoplast veya protoplastı bir cam kapak astarı ile örtün ve kapak fişini oje ile kapatın. Hücreleri görüntülemek için, konfokal mikroskobu ve uygun lazeri açın ve 63x objektifi seçin, ardından ilgilenilen her bakteri hücresinin tamamının 0,5 mikrometre dilimlerinden oluşan sekiz bit 512 x 512 kompozit Z yığını görüntüsü elde etmek için uygun görüntüleme yazılımını kullanın. Floresan olarak etiketlenmiş AMP'nin lokalizasyonunu görselleştirmek için, kompozit Z yığını görüntülerini uygun bir görüntüleme analiz programında açın ve ilgilenilen ilk sferoplast veya protolastın en ortadaki dilimini bulun.

Doymuş piksellerden kaçınmaya dikkat ederek, arka plan floresansını ölçmek için zarın üzerine 0,3 mikrometre çapında dairesel bir ilgi bölgesini, biri hücrenin merkezine ve diğerini hücreden uzağa yerleştirin. İlgilenilen her bölgedeki ortalama floresan yoğunluğu daha sonra yazılım tarafından hesaplanabilir. Konvansiyonel ışık mikroskoplarının çözünürlük sınırları, floresan etiketli peptit sinyallerinin normal bakterilerde zardan mı yoksa hücre içi boşluktan mı kaynaklandığını ayırt etmeyi zorlaştırır.

Sinyaller zara lokalize oldukça, hücre içi boşlukla örtüşüyor gibi görünecektir. Buna karşılık, sferoplast ve protoplastın normal bakterilere kıyasla genişlemiş boyutu, zar belirteci ile hücre içi boşluk arasında net bir çözünürlük ile sonuçlanır. Peptit lokalizasyonunu ayırt etmeyi kolaylaştırır.

Örneğin, floresan olarak işaretlenmiş peptidin zarına lokalizasyonu ve hücre zarı boyunca translokasyonu, az önce gösterildiği gibi konfokal floresan mikroskobu ile hem E.coli sferoplast hem de B.megaterium protoplastta görselleştirilebilir. İlgilenilen bölgelerin sferoplast veya protoplastın zarı ve hücre içi boşluğu üzerine ve arka plana yerleştirilmesi, AMP ile etkileşime giren her bir sferoplast veya protoplastın zarı üzerindeki hücre içi peptit floresan yoğunluğunun peptit floresan yoğunluğuna oranının hesaplanmasına izin verir. Örneğin, bu yöntem, histon türevli bir mikrobiyal peptit mutantının E.coli sferoplast ve B.megaterium protoplastları ile etkileşimlerini görselleştirmek için kullanılabilir.

Bu deneyde AMP, her iki bakteri suşunda da benzer bir lokalizasyon modeli gösterdi. Yabani tip peptide göre azaltılmış translokasyonu vurgulamak. Sonuç olarak, bu teknik, araştırmacıların peptit lokalizasyon modellerini tek bir hücre düzeyinde keşfetmelerini sağlar.

İlgilenilen bir peptidin etki mekanizması hakkında içgörüler sunmak. Araştırmacıların peptit mekanizmalarının sistematik karakterizasyonu için daha fazla sayıda görüntü toplamasına izin vermenin yanı sıra, daha büyük sferoplastların ve protoplastların görüntüleri, kantitatif analiz için daha küçük bakteri hücrelerininkinden daha yönetilebilir.