Polyamine tabanlı peptid Amphiphiles (PPAs) ve ilgili Biyomalzeme kendi kendine montaj sentezi için facile iletişim kuralı

Bu yöntem, peptit amfifillerinin poliaminlere nasıl dekore edileceği ve sekizgen koruma gruplarının kullanımı ile ilgili temel soruları yanıtlayabilir Bu tekniğin ana avantajı, birden fazla reaktif taraf içeren korumasız kimyasal yapı taşlarına sahip hibrit peptit amfifilleri üretebilmenizdir. Prosedürü gösterenler, Conda Sheridan Laboratuvarı'ndan laboratuvar öğrencileri Mehdi, Nathalia ve Krishnaiah olacak. İlk olarak, 2-Klorotritil klorür reçinesini dikkatlice tartın, reçineyi 50 mililitre kapasiteli, fritlenmiş, orta gözenekli bir sentez kabına yerleştirin.

Ardından, sinetez kabını değişken hızlı bir mekanik çalkalayıcıya takın ve çalkalamayı en üst düzeye çıkarmak için kabı 45 derecelik bir açıyla çevirin. Daha sonra reçineye 15 mililitre DCM ekleyin. Reçine boncuklarının 15 dakika şişmesine izin verdikten sonra, reçineye istenen poliaminin sekiz eşdeğerini ekleyin ve beş saat boyunca reaksiyona girmesine izin verin.

Beş saat sonra, poliaminin reçineye başarılı bir şekilde reaksiyonduğunu doğrulamak için bir kaiser testi yapın. Bunu takiben, susuz metanole dört eşdeğer DDE ekleyerek ve reaksiyon karışımını gece boyunca çalkalayarak birincil amin grubunu koruyun. Ertesi gün, reçine boncuğundan mavi renk gelmeyerek başarılı korumayı doğrulamak için bir kaiser testi yapın.

Ardından, DCM'yi boşaltın ve reçineyi iki ila bir DCM ve DMF karışımı ile iki kez yıkayın. Şimdi, reçineye DCM'de 20 eşdeğer Boc Anhidrit ekleyin ve reaksiyonun üç saat devam etmesine izin verin. İkincil aminin korunmasını doğrulamak için bir kloranil testi yaptıktan sonra, çözücü karışımını boşaltın ve reçineyi iki ila bir DCM ve DMF karışımı ile iki kez yıkayın.

Bunu takiben, reçineye DMF'de% 2'lik bir hidrazin çözeltisinin 10 mililitresini ekleyin. Bir saat çalkaladıktan sonra, birincil aminin başarılı bir şekilde korunmasının kaldırıldığını doğrulamak için bir kaiser testi yapın. Daha sonra, Fmoc korumalı amino asidin dört eşdeğerini, 3.95 eşdeğer HBTU'yu ve 15 eşdeğer DIPEA'yı karıştırın.

Bire bir DCM ve DMF karışımı ekleyin ve tamamen çözünene kadar kokteyli sonikleştirin. Karışımı reçineye eklemeden önce amino asit, birleştirme maddesi ve DIPEA'nın gerçekten karıştırıldığından ve aktive edildiğinden emin olun. Karboksilik asit aktivasyonunu sağlamak için üç ila beş dakika bekledikten sonra, reaksiyon karışımını reçine içeren kaba ekleyin ve reaksiyonun ortam sıcaklığında iki ila dört saat devam etmesine izin verin.

Başarılı birleştirmeyi doğrulamak için her adımda bir kaiser veya kloranil testi yapın. Başarılı eşleşmeyi doğrulamak için bir kaiser testi yaptıktan sonra, DMF'ye 10 mililitre %20'lik bir 4-Metilpiridin çözeltisi ekleyerek Fmoc grubunun amino asitten korumasını kaldırın. Reaksiyon bittiğinde, amino asidin başarılı bir şekilde korunmasının kaldırıldığını doğrulamak için bir kaiser testi yapın.

Daha sonra reçineyi iki kez 10 mililitre DMF ile yıkayın, her yıkamada 5 dakika ve son olarak 10 mililitre DCM ile 10 dakika boyunca yıkayın. Gerekli tüm amino asitleri birleştirdikten sonra, istenen karboksilik asit işlevselliğinin 10 eşdeğerini 9.5 eşdeğer HBTU'ya ve 12 eşdeğer DIPEA'ya ekleyerek hidrofobik kuyruğu son amino aside eşlenik edin. Kokteyli tamamen çözünene kadar sonikleştirin, ardından kokteyli kaba ekleyin.

Reaksiyonu en az beş saat boyunca gerçekleştirin, ancak en yüksek verim için gece boyunca yapılması tavsiye edilir. Reçineyi sekiz mililitre DMF ile iki dakika ve iki kez sekiz mililitre DCM ile beş dakika yıkayın. Her eklemeden önce, çözücüyü kaptan boşaltın.

Son yıkama yapıldıktan sonra reçineyi 15 dakika vakum altında kurutun. 15 mililitre bölünme kokteyli hazırlamak için 0,5 mililitre suya 14 mililitre TFA ve 0,5 mililitre Triizopropilsilan ekleyin. Bu dekolte kokteylini reçineye ekleyin ve oda sıcaklığında iki ila dört saat çalkalayın.

Bölünme reaksiyonu tamamlandıktan sonra, çözeltiyi 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişede toplayın. Daha sonra, karışımı 40 santigrat derecede ısıtırken, karışımı 40 santigrat derecede ısıtırken, TFA'yı düşük basınçta bir döner buharlaştırıcı kullanarak vakumda bir ila iki mililitreye konsantre edin. Daha sonra, konsantre TFA çözeltisini içeren orijinal şişeye 5 mililitre susuz soğuk eter ekleyin.

Ek katıları kurtarmak için sonikat. Ardından, önceki adımdaki eter çözeltisi ile birleştirin. Şişeyi örtün ve yağışı en üst düzeye çıkarmak için gece boyunca buzdolabının içine koyun.

Ertesi gün, çökelen malzemeyi ince veya orta dökme boyutlu bir merkez disk filtre hunisi kullanarak vakumlu filtrasyon ile toplayın. Son olarak, kalan organik maddeleri çıkarmak için çökeltiyi beş ila on mililitre soğuk eterle iki kez yıkayın. HPLC izi ve MALDI Spektrumu, malzeme karakterizasyonu veya biyolojik değerlendirme için %95'ten daha yüksek bir saflığa sahip olması gereken PPA ürününün varlığını doğrular.

UV bazlı HPLC izinde tek bir keskin tepe gözlenir ve MALDI Spektrumu, artı veya eksi bir dalton içinde PPA'nın hesaplanan moleküler ağırlığına karşılık gelir. PPA'ların kendi kendine montajı, transmisyon elektron mikroskobu, atomik kuvvet mikroskobu, küçük açılı X-Işını saçılımı, taramalı elektron mikroskobu ve dinamik ışık saçılımı ile görselleştirilebilir ve analiz edilebilir. Başarılı kendi kendine montaj, hem transmisyon elektron mikroskobu hem de atomik kuvvet mikroskobu içinde iyi tanımlanmış nanoyapılar ile sonuçlanacaktır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sonraki çalışmalardan önce ürünleri saflaştırmayı ve saflıklarını değerlendirmeyi unutmayın. Bu prosedürü takiben, peptit amfifilleri, peptitler ve peptit-poliamin hibritleri gibi diğer moleküller hazırlanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, poliamin nano yapıların ilaç dağıtımı, görüntüleme veya kataliz gibi alanlardaki etkisini keşfetmek için kendi kendine montajlı peptit amfifilleri alanındaki araştırmalara yardımcı olur Bu videoyu izledikten sonra, poliamin bazlı peptit amfifillerinin ve ilgili peptit amfifillerinin sentezinin nasıl taşınacağını iyi anlamalısınız. Trifloroasetik asit ve 4-Metilpiridin tehlikeli olabilir ve bu işlem yapılırken eldiven, laboratuvar önlüğü giymek ve çeker ocakta çalışmak gibi önlemler alınmalıdır.