Name: Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin LIF-3i yöntemiyle geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini naif duruma geri dönüştürme yöntemini. Bu protokol, hücrelerin çok yönlü farklılaşma potansiyelini artırır ve soy hattı hazırlıklı gen ekspresyonunu azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser hibe NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Yenilik Ödülü, Maryland kök hücre araştırma fonu (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk bilim Forum Ödülü ve Moseley Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li>
<li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16388305">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24513647">Chromosome preparation from cultured cells.</a> J Vis Exp. (83), e50203(2014).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-activated+stem+cell+circuits+and+stromal+signals+cooperatively+accelerate+non-integrated+iPSC+reprogramming+of+human+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors.</a> PLoS One. 7 (8), 42838(2012).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+distinct+states+of+human+naive+pluripotency+generated+by+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming.</a> Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+simultaneous+generation+of+hematopoietic+and+vascular+progenitors+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li>
<li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li>
<li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+and+selection+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.</a> Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).</li>
</ol>

Yaşam teknolojileri ve Johns Hopkins Üniversitesi (JHU) arasında bir lisans sözleşmesi kapsamında, Dr. Zambidis kök hücrelerinin lisans için üniversite tarafından alınan telif pay hakkına sahiptir. Bu düzenleme şartları JHU tarafından çıkar çatışması ilkelerine uygun olarak yönetilir. Bu veri ve malzemeleri paylaşımı günlük ilkeleri yazarların bağlılık değiştirmez.

LIF-3i sistem klasik fare 2i saf reversion kokteyl1 değiştirilmiş bir sürümü insan pluripotent kök hücreler için geçerlidir. (Hangi 2i yalnız genişletilemiyor) hPSC kendini yenileme LIF-2i içinde bu kokteyl ile tankyrase inhibitörü XAV939 ilave olarak stabil. LIF-3i kültür toplu ve geleneksel hPSC verimli reversion için insan Preimplantasyon epiblast3benzeyen bir pluripotent devlet sağlar. Her ne kadar hPSC XAV939 eylem olası karmaşık mekan...

2i (MEK/ERK ve GSK3β inhibitörü) kültür sistemi ilk türdeş olmayan serum tabanlı fare embriyonik kök hücreler (mESC) kültürleri pluripotency fare Preimplantasyon epiblast1benzer bir Tekdüzen yer durumunu iyileştirmek için geliştirilmiştir. Ancak, 2i insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları2istikrarlı bakım desteklemez. Çeşitli karmaşık küçük molekül, büyüme faktörü-takıma ve transgenik yaklaşımlar son zamanlarda putatively yakalama bildirilmiştir benzer insan saf benzeri pluripotent moleküler Devletler2. Ancak, çoğu da bu yöntemler ile oluşturulan "saf gibi" Birleşik karyotip istikrarsızlık, epigenomic defektleri (Örneğin, genel kaybı ebeveyn genomik basma) sergilenen veya farklılaşma potansiyeli Engelli.
İçinde karşıtlık, GSK3β, ERK ve tankyrase sinyal Üçlü kimyasal inhibisyonu kokteyl ve lösemi inhibitör faktörü (LIF-3i) geleneksel hPSC hatları3geniş bir repertuar istikrarlı saf benzeri reversion için yeterli. LIF 3i döndürülmesi saf hPSC (N-hPSC) normal karyotypes muhafaza ve onların ifadeleri saf özel insan Preimplantasyon epiblast genlerin arttı (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i de haiz reversion hPSC moleküler ve biyokimyasal özellikleri artan fosforile STAT3 sinyal, dahil mESC gibi saf pluripotency için benzersiz bir dizi ile azalmıştır ERK fosforilasyon, küresel 5-metilsitozin CpG hypomethylation, genom çapında KSY demethylation, embriyonik kök hücre (ESC)-belirli bir gen rehberleri ve baskın distal OCT4 artırıcı kullanımı. Ayrıca, ile karşılaştırıldığında diğer saf aberrantly hypomethylated sonuçlandı reversion yöntemleri genomik loci baskılı, LIF 3i döndürülmesi N-hPSC edildi sistematik baskılı CpG desen veya kaybı DNA metiltransferaz ifade yoksun (Örneğin, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Geleneksel insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC) büyümek besleyiciler ya da E8 besleyici-Alerjik koşulları üzerinde geniş bir dizi doğrudan LIF-3i kültürünün hızlı ve dökme reversion için saf epiblast gibi devlet elde. Ancak, doğrudan LIF-3i saf reversion bazı kararsız geleneksel hPSC hatları genetik olarak farklı donör kökenden gelen doğan içsel genomik ve soy astarlanmalıdır variabilities nedeniyle verimsiz olabilir.
Böylece, belgili tanımlık yarar LIF-3i yönteminin genişletmek için kademeli optimizasyonu geliştirilmiş ve burada, sunulan bu evrensel saf reversion neredeyse herhangi bir geleneksel hESC veya hiPSC transgene içermeyen satır Fiderler, fazla yükleyiciler kültürlü sağlar. Protein kinaz (forskolin) ve sonic kirpi (SUS) (kazara iki ek küçük moleküller (LIF-5I) LIF-3i kokteylle takviyeleri geleneksel hPSC geçici ilk kültür adımda bu universalized saf reversion yöntemi kullanır purmorphamine) işaret. Geleneksel hPSC LIF-5i bir ilk geçiş onları sonraki kararlı LIF-3i reversion toplu miktarlarda uyum sağlar. İlk LIF-5i adaptasyon geleneksel hPSC E8 veya besleyiciler (önce onların sonraki kararlı, sürekli pasajda LIF-3i yalnız) yetişen ilk tek hücre klonal çoğalması önemli ölçüde artırmaktadır. Geleneksel hPSC satırları adapte ilk LIF-5i bir pasajda için sonraki toplu klonal saf yeniden dönmek hücre LIF-3i koşullarında hangi malzeme çekme ve nadir istikrarlı kolonileri ya da rutin kullanımı subcloning gereğini namussuz passaging tahammül Anti-apoptotik molekülleri veya Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörleri.
LIF-3i yöntemi başarıyla stabil genişletmek ve geniş bir repertuar korumak için istihdam edilmiştir > 30 bağımsız, genetik olarak farklı geleneksel hPSC hatlarında > 10-30 pasajlar ya enzimatik olmayan veya enzimatik ayrılma yöntemleri kullanarak ve İndüksiyon kromozom kanıtı olmadan veya epigenomic anormallikleri, baskılı gen loci, anormallikler de dahil olmak üzere. Ayrıca, sıralı LIF-5i/LIF-3i kültür kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azaltarak geleneksel hPSC satırları geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency artıran şu ana kadar bildirilmiştir tek saf reversion yöntemidir ve büyük ölçüde onların multipotent farklılaşma potansiyeli geliştirmek. LIF-3i saf reversion yöntemi siler doğasında lineage astarlanmalıdır, geleneksel hPSC satırları farklılaşma değişkenliği Interline ve hücresel tedavi ve rejeneratif tıp uygulamasında a büyük yarar olacaktır.

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>kullanımı 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>kullanımı 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>kullanımı 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>kullanımı 2&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>kullanımı 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>kullanımı 1:1000 (Western blot), total protein detection için</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>kullanımı 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>kullanımı 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>kullanımı 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>kullanımı 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>kullanımı 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>kullanımı 1:1000 (Western blot), total protein detection için</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>kullanımı 1:50 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>kullanımı a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>kullanımı 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>kullanımı 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>kullanımı 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>kullanımı 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>Vitronectin XF&trade; matrix için dilüent</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>ayrıca 6.2 line olarak da adlandırılır</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>suda yeniden çözün ve otoklav ile sterilize</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>DMSO içinde 100mM olarak yeniden yapılandırın</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>DMSO içinde 10mM olarak yeniden yapılandırın</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>AF-120-14E</td><td></td></tr><tr><td>recombinant

geleneksel insan pluripotent kök hücreler kimyasal reversion için geliştirilmiş multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Saf insan pluripotent kök hücreleri (N-hPSC) ile gelişmiş bir işlevsellik rejeneratif tıp alanında geniş bir etkisi olabilir. Bu iletişim kuralı, verimli bir şekilde lineage astarlanmalıdır, geleneksel insan pluripotent kök hücreler (hPSC) saf benzeri pluripotency için besleyici-Alerjik ya da besleyici bağımlı koşulları ile gelişmiş işlevsellik tutulan dönmek için hedeftir. Klasik lösemi inhibitör faktörü (LIF), GSK3β, bu kimyasal saf reversion yöntemi kullanır ve yalnızca bir tankyrase inhibitörü XAV939 ile desteklenmiş MEK/ERK inhibisyon kokteyl (LIF-2i), (LIF-3i). LIF-3i benimseyerek biyokimyasal, transkripsiyon bir istikrarlı pluripotent devlet ve insan pre-implantasyon epiblast epigenetik özellikleri geleneksel hPSC döner. Bu LIF-3i yöntemi en az hücre kültür manipülasyon gerektirir ve son derece geniş insan embriyonik kök hücre (hESC) ve transgene içermeyen insan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları repertuarında tekrarlanabilir. LIF-3i yöntemi farklılaşma önce yeniden astar bir adım gerekli değildir; N-hPSC doğrudan son derece yüksek verimlilik ile Ayrıştırılan ve karyotip korumak ve epigenomic stabiliteleri (baskılı loci dahil olmak üzere). Yöntem evrenselliğini artırmak için geleneksel hPSC ilk kültürlü protein kinaz (forskolin) ve (LIF-5I) sinyal sonic kirpi (SUS) (purmorphamine) kazara iki ek küçük moleküller ile desteklenmiş LIF-3i kokteyl içinde. Bu kısa LIF-5i adaptasyon adım önemli ölçüde geleneksel hPSC ilk klonal genişlemesi geliştirir ve onları daha sonra saf-döndürülmesi ile LIF-böylece malzeme çekme/subcloning nadir N-hPSC gerek obviating 3i toplu miktarlarda yalnız olmak izin verir koloniler daha sonra. LIF 5i stabilize hPSCs daha sonra anti-apoptotik molekülleri gerek olmadan tek başına LIF-3i içinde korunur. En önemlisi, LIF-3i reversion belirgin geleneksel hPSC geniş bir repertuar fonksiyonel pluripotency kendi soy astarlanmalıdır gen ekspresyonu azalan ve yönlendirilmiş farklılaşma Interline değişkenliği sık silme geliştirir bağımsız hPSC satırları arasında görülmektedir. Temsilcisi karakterizasyonu LIF 3i döndürülmesi N-hPSC, isogenic hPSC fonksiyonel karşılaştırmalar için sağlanan ve deneysel stratejiler lineage astarlanmalıdır vsvardır. saf gibi Birleşik özetlenmiştir.

Bu iletişim kuralı verimli saf benzeri reversion LIF-3i ile hem besleyici bağlı ve besleyici bağımsız lineage astarlanmalıdır geleneksel hPSC kültürlerde (Şekil 1) en iyi duruma getirir. Detaylı iletişim kuralı, açıklanan burada, LIF-3i ya besleyici bağımlı veya besleyici-Alerjik geleneksel hPSC koşulları (Örneğin E8 orta) başlayarak sıralı uyum özetliyor.
Temsilcisi çeşitli geleneksel hESC...

Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

LIF-3i yöntemi, geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini, insan pre-implantasyon epiblastının biyokimyasal, transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerine sahip daha ilkel bir pluripotent duruma geri döndürür. Bu yöntem, geleneksel insan pluripotent kök hücrelerinin işlevselliğini, soy-öncelikli gen ekspresyonunu azaltarak ve bağımsız hPSC hatları arasında yaygın olarak gözlenen yönlendirilmiş farklılaşmanın ara-soy değişkenliğini silerek geliştirir. Bu yöntemi kullanarak, kimyasal olarak geri dönüştürülmüş insan pluripotent kök hücreleri, genişletilmiş geçiş sonrası kariotip ve epigenomik stabilitesini korur, dahil olmak üzere baskılı lokuslarda ve doğrudan ve iyileştirilmiş verimlerle farklılaştırılabilir ve yeniden başlatma adımı gerektirmez.LIF-3i yöntemi, erken insan gelişimsel biyolojisi üzerinde yeni araştırma yolları açacak ve insan pluripotent kök hücre farklılaşması, gen hedefleme ve türler arası kimeraların oluşturulmasını geliştirerek rejeneratif tıbbı ilerletebilir. Protokolü başlatmak için, normal kariotipleri doğrulanmış geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri, fare embriyonik fibroblastı veya MEF bazlı bir besleyici kültür sistemi ile ko-kültür

chemical-reversion-conventional-human-pluripotent-stem-cells-to-nave

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

İnsan pluripotent kök hücrelerinden farklılaştırılmış hücre türleri üreten (hPSCs) büyük terapötik söz tutar ama zorlu kalır. PSC 'ler genellikle uygun bir sinyal seti ile uyarıldığında bile ayrım yapmak için doğal bir yetersizlik sergiler. Burada açıklanan PSC hatları çeşitli arasında multilineage farklılaşma geliştirmek için basit bir araçtır.

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Öğrenin LIF-3i yöntemiyle geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini naif duruma geri dönüştürme yöntemini. Bu protokol, hücrelerin çok yönlü farklılaşma potansiyelini artırır ve soy hattı hazırlıklı gen ekspresyonunu azaltır.

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet (Video) | JoVE Journal

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Daha fazla video keşfet