Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet
10 Haziran 2018
Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.
LIF-3i yöntemi, geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini, insan pre-implantasyon epiblastının biyokimyasal, transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerine sahip daha ilkel bir pluripotent duruma geri döndürür. Bu yöntem, geleneksel insan pluripotent kök hücrelerinin işlevselliğini, soy-öncelikli gen ekspresyonunu azaltarak ve bağımsız hPSC hatları arasında yaygın olarak gözlenen yönlendirilmiş farklılaşmanın ara-soy değişkenliğini silerek geliştirir. Bu yöntemi kullanarak, kimyasal olarak geri dönüştürülmüş insan pluripotent kök hücreleri, genişletilmiş geçiş sonrası kariotip ve epigenomik stabilitesini korur, dahil olmak üzere baskılı lokuslarda ve doğrudan ve iyileştirilmiş verimlerle farklılaştırılabilir ve yeniden başlatma adımı gerektirmez.
LIF-3i yöntemi, erken insan gelişimsel biyolojisi üzerinde yeni araştırma yolları açacak ve insan pluripotent kök hücre farklılaşması, gen hedefleme ve türler arası kimeraların oluşturulmasını geliştirerek rejeneratif tıbbı ilerletebilir. Protokolü başlatmak için, normal kariotipleri doğrulanmış geleneksel insan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri, fare embriyonik fibroblastı veya MEF bazlı bir besleyici kültür sistemi ile ko-kültürlerde veya besleyici içermeyen bir kültür sisteminde koruyun ve genişletin. MEF besleyicilerini, LIF-5i'ye uyarlanmış geleneksel hPSC kültürlerini geçirmeden en az bir gün önce hazırlanmış jelatinize edilmiş altı kuyulu bir plakta hazırlayın.
Geleneksel hPSC kültürleri yaklaşık %50 konfluansa ulaştıktan sonra, standart hESC kültür ortamını, her kuyu için iki mililitre Leukemia Inhibitory Factor 5i veya LIF-5i ortamı ile değiştirin. Konvansiyonel hPSC'leri ve MEF'leri, CO2 inkübatöründe LIF-5i içinde iki güne kadar kültürleyin ve koruyun. Ardından, sonraki geçiş ve LIF-3i'deki stabil geri dönüş için onları adapte etmek üzere LIF-5i ortamını her gün değiştirin.
Besleyici içermeyen konvansiyonel kültürler için, ertesi sabah geçiş yapmadan önce hPSC'leri sadece bir gece LIF-5i içinde kültürleyin. Geçişten önce, LIF-5i'ye uyarlanmış geleneksel hPSC'leri bir kez PBS ile yıkayın ve her kuyuya bir mililitre hücre-disosiyasyon reaktifi ekleyin. Ardından, plakayı 37 derece Celsius'ta bir CO2 inkübatöründe beş dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri pipetle tek hücreli süspansiyona geri nazikçe çırpın. Hücre süspansiyonu, hESC ortamında, steril, 15 mililitrelik konik tüpte en az iki kat seyreltilmiş olarak toplayın ve tek hücreli süspansiyonu elde etmek için pipetle nazikçe çırpın. Hücreleri 300 g'de beş dakika santrifüjleyin.
Santrifüjden sonra, süpernatantı aspire edin ve atın ve hücre peletini bir ila iki mililitre LIF-5i ortamında yeniden çözün. Ardından, hücreleri sayın. Önceden hazırlanmış altı kuyulu MEF plakasını iki kez her kuyu için iki mililitre PBS ile yıkayın.
Altı kuyulu PBS yıkanmış MEF plakasının bir kuyusuna iki mililitre LIF-5i ortamında bir ila iki kez 10 altıncı hücreyi dağıtın. Plakayı CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün, plakayı nazikçe çalkalayıp tüm bağlı olmayan hücreleri kaldırın ve ortamı aspire edin ve ortamı iki mililitre LIF-5i ortamı ile değiştirin.
Bu adımı, hücreler %60 ila %70 konfluansa ulaşana kadar üç ila beş gün boyunca veya günlük olarak tekrarlayın. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hazırlıklarının markalı farklılaşma veya anormal kariotipleri titizlikle hariç tutulduğu sürece, geniş bir insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücre hatlarının hızlı ve toplu naif benzeri geri dönüşünü destekler. İlk LIF-5i adaptasyonundan sonra, sonraki stabil LIF-3i kültürlerini her üç ila dört günde bir, biyo-güvenlik kabini içinde veya kültürler %60 ila %70 konfluansa ulaştığında geçirin.
Kültür ortamını atın ve LIF-5i-LIF-3i kültürlerinin her kuyusunu, nazikçe iki mililitre PBS ekleyerek yıkayın. PBS'yi atın ve bir mililitre hücre ayrışma çözeltisini ekleyin. Hücreleri 37 derece Celsius'ta bir CO2 inkübatöründe beş dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonu toplayın, iki kat seyreltilmiş hESC ortamı ekleyin ve tek hücreli süspansiyonu elde etmek için pipetle nazikçe çırpın. Süspansiyonu steril 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücreleri 300 g'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin ve atın.
Peleti LIF-3i ortamında yeniden çözün ve ardından hücreleri sayın. Ardından, rutin LIF-3i kültürleri geçişinde jellatinize edilmiş altı kuyulu plakada ışınlanmış MEF üzerine her kuyuya iki kez 10 beşincisi hücreyi yerleştirin. İlk LIF-5i'ye uyarlanmış kültürler için, ilk geçişten önce LIF-3i MEF'de daha yüksek bir başlangıç yoğunluğu uygulayın.
Bireysel insan pluripotent kök hücre hatları, LIF-3i geri dönüş kültürünün erken geçişleri sırasında sürekli toplu geçişin korunması için gerekliyse, yüksek başlangıç dikim yoğunluklarına optimize edil
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
LIF-3i yöntemi, konvansiyonel insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) etkili bir şekilde naif implantasyon öncesi epiblast benzeri bir duruma geri döndürür. Bu protokol, farklılaşma kapasitelerini artırır ve soy hattına özgü önceden belirlenmiş gen ekspresyonunu azaltır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Rejeneratif Tıp
- Gelişim Biyolojisi
Arka Plan
- Konvansiyonel hPSC'ler, diferansiyasyonda değişkenlik göstermektedir.
- Naif pluripotent durumlar, erken gelişimi anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Rejeneratif uygulamalar için geliştirilmiş diferansiyasyon yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır.
- LIF-3i yöntemi bu zorlukları gidermektedir.
Çalışmanın Amacı
- hPSC'leri naïf duruma döndürmek için bir protokol geliştirmek.
- Yönlendirilmiş farklılaşmanın verimliliğini artırmak.
- hPSC hatları arasındaki hatlar arası değişkenliği azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) ile ko-kültür.
- Besleyici hücreden bağımsız (feeder-free) kültür sistemleri.
- MEF besleyicileri için jelatinize altı kuyucuklu plakların hazırlanması.
- Stabiliteyi değerlendirmek için geri döndürülmüş hPSC'lerin genişletilmiş pasajlanması.
Ana Sonuçlar
- hPSC'lerin stabil bir naif duruma başarılı şekilde geri döndürülmesi.
- Hat öncüllü gen ekspresyonunda azalma gözlendi.
- Yeniden öncülleme gerekmeksizin artırılmış diferansiyasyon verimlilikleri.
- Karyotipik ve epigenomik stabilitenin korunması.
Sonuçlar
- LIF-3i yöntemi, insan gelişimsel biyolojisinde yeni yollar açmaktadır.
- Rejeneratif tıp uygulamalarını geliştirebilir.
- Bu protokol, gen hedefleme ve kimerik çalışmaları kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Bu protokol, konvansiyonel insan pluripotent kök hücrelerinin toplu olarak naif benzeri bir duruma döndürülmesini sağlayarak, farklılaşma sonuçlarındaki hatlar arası değişkenliği azaltır ve fonksiyonel pluripotensiyi artırır. Yeniden primingleme yapmadan farklılaşma verimliliğini artırarak, daha öngörülebilir preklinik modellemeyi destekler ve rejeneratif tıp süreçlerinde hedef doğrulamanın risklerini azaltır. Yöntemin çeşitli hESC ve transgen içermeyen hiPSC hatları genelindeki tekrarlanabilirliği; erken keşif ve translasyonel araştırmalar için ölçeklenebilir, standartlaştırılmış iş akışlarını kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Epigenetik gürültüsü azaltılmış, gelişimsel olarak daha erken bir evreye döndürülen soy hattı belirginleşmiş hPSC'ler aracılığıyla terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Etki mekanizmasını netleştirmek için naif benzeri ve primel durumlar arasındaki izojenik karşılaştırmaları kullanarak fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Tahminleme Değeri: Öncü madde tanımlamasını zorlaştıran hatlar arası değişkenliği minimize ederek diferansiyasyon analizlerindeki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tutarlı hücresel yanıtlar gerektiren yüksek kapasiteli tarama platformları için uygun, stabil ve karyotipik olarak normal, naive-benzeri hPSC'ler üretir.
- Kantitatif Çıktı: Germ tabakaları genelinde ölçülebilir farklılaşma verimliliklerini destekleyerek, sağlam doz-yanıt ve fenotipik tarama imkanı sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Klonal seçime gerek kalmadan toplu reverzyona izin vererek, büyük ölçekli analiz hazırlıklarını ve reaktif tarama kampanyalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişki: Erken gelişimsel bozuklukları modellemek için gelişimsel olarak doğru bir insan implantasyon öncesi epiblast benzeri sistem sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: İmprinted lokuslarda epigenomik stabiliteyi koruyarak, in vivo farklılaşma ve teratom oluşumuna yönelik güvenilir ekstrapolasyonu destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Yönlendirilmiş farklılaşmadaki hatlar arası değişkenliği ortadan kaldırarak, preklinik etkinlik çalışmalarındaki yanlış negatif/pozitif sonuçları azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
LIF-5i'den LIF-3i'ye ardışık yöntem; farklılaşma analizleri, öncü madde belirleme ve preklinik doğrulama aşamaları öncesinde standartlaştırılmış naif durum üretimine olanak tanıyarak keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hedef mekanizmaları ve yolak bağımlılıklarını netleştirmek amacıyla, naive-benzeri ve primlenmiş hPSC durumlarının izojenik karşılaştırmaları yoluyla hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Kuyucuklar arası değişkenliği azaltarak, assay standardizasyonu ve bileşik tarama işlemleri için tekrarlanabilir, diferansiyasyon kapasitesine sahip hücre popülasyonları sağlar.
- Analitik: Farklı koşulların karşılaştırılması için trilineage diferansiyasyon verimliliğinin kantitatif okumalarına ve gen ekspresyon normalizasyonuna olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Uzatılmış pasaj boyunca epigenomik ve karyotipik stabiliteyi koruyarak, boylamsal preklinik çalışmaları ve biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve hücre hattında naive-benzeri hPSC'ler üretmek için tersine çevrilebilir, platformdan bağımsız bir yöntem oluşturarak gereksiz optimizasyonları azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Soy hattına özgü sinyallenmenin azaltılması ve pluripotens stabilitesinin artırılmasıyla diferansiyasyon sonuçlarında öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Minimum manipülasyon gerektiren ve laboratuvarlar arası yüksek tekrarlanabilirliğe sahip, besleyici hücre uyumlu veya besleyicisiz standart protokol.
- Stratejik Değer: Diferansiyasyon analizlerindeki biyolojik gürültünün minimize edilmesiyle, geç aşama kaybı riskini azaltarak iyileştirilmiş karar verme süreçleri.
- Portföy Etkisi: Genetik arka plan değişkenliği yerine fonksiyonel sıfırlama kapasitesine dayalı olarak hücre hatlarının risk ayarlı önceliklendirmesine imkan tanır.
Uygulama Hususları
- Pasajlama, dissosiyasyon ve pluripotensi marker validasyonu dahil olmak üzere kök hücre kültürü konusunda uzmanlık gerektirir.
- MEF ko-kültürü veya feeder-free adaptasyon için CO2 inkübatörü, biyogüvenlik kabini ve standart hücre kültürü ekipmanlarına bağımlıdır.
- LIF-3i için LIF, GSK3β ve MEK/ERK inhibitörleri ile tankyraz inhibitörü XAV939 içeren standartlaştırılmış ortam formülasyonu; LIF-5i adaptasyonu için ise isteğe bağlı olarak forskolin ve purmorphamine gereklidir.
- Başarılı bir reversiyon sağlamak için başlangıç hPSC hatlarında normal karyotipin ve düşük spontan diferansiyasyonun doğrulanması gerekir.
- Model sistemler arası adaptasyon, klonal ekspansiyon için başlangıç ekim yoğunluğunun ve LIF-5i maruziyet süresinin optimizasyonunu gerektirebilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
