Name: Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, yenidoğan farelerde kolon hücrelerini fotoboyama yöntemiyle işaretleyerek hematopoietik hücrelerin göç potansiyelini değerlendirmeyi. Bu teknik, bağışıklık ve mikrobiyom etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nitya Jain bir NIH/NIAID kariyer geçiş Ödülü 1K22AI116661-01 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan yordamları ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Massachusetts General Hospital onayı ile gerçekleştirilmiştir.
Dikkat: Bu protokol bir sınıf 3b lazer (LG3) kullanımını gerektirir. LG3 lazer koruyucu gözlük her zaman bu lazer çalışırken kullanılması gerekir. Yaralanma riskini önlemek için uygun eğitim ve güvenlik yönergelere uyulmalıdır.
1. tasarım ve lazer montajı
<ol><li>Işık yayan diyot (LED) bağlanmak (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fiber birleştiğinde) LED sürücü üzerinden için LED için gelir 4 pinli M8 bağlantı kablosu bağlı. Dikkatli bir şekilde bağlantı tutturmak için sıkıştırın.</li>
	<li>Optogenetics bağlantı kablosu için LED eklemeden önce bağlayıcı tutun LED kadar açılış orada emin olmak için ışık görünür hiçbir engel vardır. Eğer gerekli herhangi bir engelleri ortadan kaldırmak ve optogenetics bağlantı kablosu ataşını delik üfle.</li>
	<li>Fiber optik kanül kanül bağlayıcı kol bir ucunu ekleyerek optogenetics bağlantı kablosu bağlayın. Bağlayıcı kol diğer ucunu bağlantı kablosu takın.  Güvenli bağlantı ama değil viraj veya fiber optik kanül kırmak için dikkatli olmak için yeterli basınç uygulayın. Not: her ne zaman lazer kullanmak değildir kırılgan fiber optik kanül koruyucu başlığı ile kaplıdır.</li>
	<li>LED sürücü 0 ile 1.2 A. ayarlanmış geçerli sınırı sürekli ayar düğmesi ile sürekli dalga (CW) moduna ayarla</li>
</ol>2. Photoconversion iki nokta üst üste hücrelerinin
Not: Erkek ve dişi fareler intracolonic 405 nm ışık için 1-2 gün sonra kendi Doğum maruz kaldılar ve yaş 1 hafta önce kurban edildi.
<ol><li>Karanlık bir yerde bir elektrik prizine bir erişim ile güvenli. LED sürücü sokunuz. Not: ortam ışığı farelerin uzun bir pozlama istenmeyen bir photoconversion hücrelerinin neden olabilir gibi bu yordamı en az beyaz ışık içinde gerçekleştirilir. Kırmızı ışık alternatif olarak kullanılır. Dikkat: Aşağıdaki adımı bir hayvan anestezik kullanımını gerektirir. Anestezi Yönetimi Sınıf II başlıklı veya başka bir uygun atma sistemi kullanılarak gerçekleşir. İnhalasyon anestezi baş dönmesi, uyuşukluk veya hatta bilinç kaybı neden olabilir.</li>
	<li>4-%5 isoflurane % 100 O2 bir indüksiyon kutusunda maruz fare anestezi. Uygun anestezi derinliği sıkıca arka pençe (cevap yok) pinching tarafından doğrulayın. Anestezi burun konisi, yaklaşık % 2 isoflurane üzerinden korumak. İşleyici isoflurane bir uygun başlık veya anestezik atma aygıt kullanımı ile etkilenmemek.</li>
	<li>İntracolonic maruz imzalat fare scruff fare arkası için 1 el yavaşça işaret parmağı ve başparmak ile kullanarak yerleştirin. Karın ortaya çıkarmak için fareyi çevirin. Fare pembe rengini kaybetmeye başlar yoksa onun solunum hızı yavaş başlar kavrama gevşetin. Fare kuyruğu halka ve küçük parmaklar arasındaki güvenli.</li>
	<li>Diğer elini de koruyucu başlığı kanül kaldırın. Süre paraca desteklemek fare orta hat için paralel kanül uzun ekseninin hafifçe yerleştirin fiber optik kanül anüs yoluyla kolon böylece tüm 5 mm Fiber optik fare içinde. Not: Bu yordam yavaş yavaş ve kolon duvar sorgulamaktı değil özenle yapılır. Kıpır kıpır ve kanül büküm dakika içine kolon ilerleme yardımcı olur.</li>
	<li>Koruyucu gözlük don ve maksimum değerine (sonuna kadar saat yönünde) geçerli lazer artırmak. UV ışık varlığı fare karın yarı saydam bakarak onaylayın. Not: LG3 lazer koruyucu gözlük görünürlüğünü önemli ölçüde azaltır. Var bir meslektaşım (giyiyor koruyucu donanım) gözlük donning ve yardımcı üzerine lazer dönüm.</li>
	<li>2 dk. geri kanül yaklaşık 1 mm toplam lazer ışığı kolona her 30 maruz ışığa maruz luminal alanı en üst düzeye çıkarmak için s. Lazer 2 dk sonunda devre dışı.</li>
	<li>Yavaş yavaş kanül fare kaldırın. Anestezi boş bir sıcak kafeste üzerinden geri aldıktan sonra fare ev kafese geri.</li>
</ol>3. yalıtım bağırsak lenfositler
<ol><li>Hank'in dengeli tuz çözüm/buzağı serum (HBSS/CS) arabelleği 1 L, epitel şerit arabellek 200 mL, 500 mL yıkama medya ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 200 mL hazırlamak-ücretsiz yıkama medya. Not: Reaktif birimleri 9 Örneklem büyüklüğü için hesaplanır.<ol>
<li>HBSS/CS tampon (HBSS; %5 CS) HBSS için 950 mL 50 mL CS ekleyerek getirin. Onu buza saklayın.</li>
		<li>[HBSS; %5 CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) (pH 7.2-7,5)] epitel şerit arabellek için 185 mL CS, 1 M DTT, 0,5 M EDTA 2 mL ve 1 M HEPES tampon 3 mL 200 µL 10 mL ekleyerek hazırlamak HBSS. 37 ° C su banyosu epitel şerit arabellekte bir yer.</li>
		<li>(HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA) yıkama medya CS 5 mL ve 1 mL 0.5 M EDTA HBSS 494 mL için ekleyerek getirin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>EDTA içermeyen yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 15 mM HEPES) 195 mL HBSS 2 mL CS ve 3 mL 1 m HEPES ekleyerek hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Bir FACS tampon yapmak [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x (pH 7.2 =); % 2 CS] CS 10 mL PBS için 490 mL ekleyerek. Onu buza saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku toplama yemek bir 70 µm hücre süzgeç bir 60 x 10 mm Kültür çanak koyarak hazırlamak. Yemek için HBSS/CS tampon (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) 10 mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Fare ile inhale isoflurane uygun anestezi atma işlemini kullanarak aşırı dozda ötenazi (yaklaşık 3 dk Riziko > % 4 isoflurane Oda hava veya %100 O2). Sonra belirgin nefes kesilmesi ve refleks hareketi, derin ağrı yokluğu sıkıca bir arka pençe pinching tarafından doğrulayın (forseps kullanarak önerilir). Ötenazi ile cerrahi makas ya da yeni bir usturanın kullanarak bir işten çıkarma emin olun. Not: Servikal yerinden çıkması boyutu ve hayvan yaş nedeniyle bu adım için tavsiye edilmez. Bu yöntemler üzerinde ötenazi 2013 travma yönergeleri ile tutarlı olduğundan ve MGH IACUC tarafından onaylandı.</li>
	<li>Karın açmak için temiz forseps ve makas kullanarak kolon hasat. Bağırsak kolon ortaya çıkarmak için fare karın 1 tarafına yansıtır. İlk o (doğru anüs) sadece distal transecting tarafından tüm kolon kaldırmak çekum için. Sonra iki nokta üst üste forseps ile sıkıca açgözlü iken, makas üretra Rectuma kesmek için kullanın. Anüs mümkün olduğunca yakın olarak kolon kesme. Dalak Kolonu çıkardıktan sonra hasat (bkz: 4.1-4.2 aşağıdaki adımlar). Not: photoconversion iletişim kuralı yalnızca ~ % 25 yenidoğan'ın kolon (fiber optik kanül 5 mm) hedefleyen iken, tüm kolon hücre yalıtım modunda yardım için hasat edilir.</li>
	<li>İki nokta üst üste iki nokta üst üste ve kuru kağıt havlu üzerine içeriğini itmek için forseps kullanarak temizleyin. Doku ince bir kültür yemek kapağında bir hamur içine iki nokta üst üste doğrayın ve bu hamur hücre süzgeç Petri kabına aktarmak için jilet kullanarak lunaparkçı.</li>
	<li>Temiz 8 mm uzun manyetik heyecan çubuğu için süzgeç ekleme ve çanak 9-pozisyon manyetik karıştırıcı tabağa yerleştirin. Manyetik heyecan bar hızını ayarlamak için 800 devir/dakika ve oda sıcaklığında 5 min için hücreleri kuluçkaya. Arabellek atın ve 10 mL HBSS/CS (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) kullanarak yıkama yineleyin. Arabellek yıkama sonunda atmak.</li>
	<li>Epitel hücreleri prewarmed epitel şerit arabellek (HBSS % 5 CS 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 adımda yapılan ve 37 ° C su banyosu içinde depolanmış 15 mM HEPES [pH 7.2-7,5] arabellek) 10 mL ekleyerek hücre süzgeç ayırmak ve 30 dk içinde 3 için 800 rpm'de karıştırın 7 ° C inkübatör. İnkübasyon sonunda, epitel kesir bir temiz 15 mL tüp için zenginleştirilmiş arabellek aktarın. Not: sağlam lamina propria hücrelerde hücre süzgeç sırasında bu adım11kalırken epitel ve ilişkili hücreleri (bağırsak epitel hücreleri ve bağırsak epitel lenfositler) arabelleği serbest.<ol>
<li>Zenginleştirilmiş Bağırsak epitel kesir (IELs) vasıl 700 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Kullanılmak üzere adım 3,15 buzda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2 hücre süzgeç içinde lamina propria kesir yıkama x HBSS/CS ile. Bunu yapmak için 10 mL HBSS/CS çözeltisi (HBSS; buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapıldı % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.</li>
	<li>Örnek 2 yıkama yıkama medya x. Yıkama medya (HBSS; % 1 CS; adım 3.1.3 ve oda sıcaklığında depolanmış 1 mM EDTA arabellek) 10 mL hücre süzgeç ekleyin ve 15 dakika 37 ° C kuluçka 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.<ol>
<li>Yıkama medya kullandıktan sonra adım 3.14 kullanımda buzda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnek 2 yıkama x HBSS ile/CS. 10 mL HBSS/CS tampon (HBSS; buz üzerinde depolanan 3.1.1. adımda yapılan % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.</li>
	<li>EDTA içermeyen yıkama arabellek dokusunda kuluçkaya. 10 mL EDTA içermeyen yıkama arabellek (HBSS; % 1 CS; 3.1.4. adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanmış 15 mM HEPES tampon) hücre süzgeç ekleyin ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya. Bu adımın sonundaki arabellek atmak.</li>
	<li>Örnek 2 yıkama x HBSS/CS ile ve enzim çözüm hazırlamak. HBSS/CS (HBSS; % 5 CS arabellek buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapılan) 10 mL ekleyin arabellek hücre süzgeç ve 10 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.<ol>
<li>Enzim çözüm hazırlamak (EDTA içermeyen yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 167 mg/mL collagenase) ikinci yıkama süresi boyunca: 9 mg eklemek DNaz ben ve 15 mg liyofilize collagenase 90 mL EDTA ücretsiz için arabellek yıkayın. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria lenfositler (LPLs) elde etmek için hücre süzgeç bulunan lamina propria kesir sindirmek. Enzim çözüm 10 mL ekleyin (EDTA ücretsiz yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 3.12.1 adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanan 167 mg/mL collagenase arabellek) hücre süzgeç için ve 45 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Not: LPLs sonra enzimatik sindirim çözüm içine salınır.<ol>
<li>Hücreleri içeren enzim çözüm toplamak ve 50 mL konik tüp içine yeni bir hücre süzgeç aracılığıyla filtre.</li>
	</ol></li>
	<li>20 mL soğuk yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA made ın adım 3.1.3 ve saklı 3.9.1. adımda buzda arabellek) enzim çözüm collagenase faaliyetleri engellemek için filtre uygulanmış hücreleri ekleyin. Tüp vasıl 700 x g oda sıcaklığında 6 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve LPLs 1 mL FACS arabellek içeren pelet resuspend.</li>
	<li>IEL (Kimden adım 3.7.1) ve lipoprotein LİPAZ (Kimden adım 3.14) kesirler birleştirir ve onları floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5). Not: bölme bilgi isterseniz IEL ve lipoprotein LİPAZ kesirler ayrı ayrı lekeli.</li>
</ol>4. yalıtım lenfositleri dalak üzerinden
<ol><li>Toplama tüp microcentrifuge tüp içine 500 µL FACS arabelleği ekleyerek hazırlayın. Onu buza saklayın.</li>
	<li>İki nokta üst üste (adım 3.4) kaldırma sonra bütün dalak hasat ve toplama tüpü yerleştirin. Doku buz üstünde depolar.</li>
	<li>Bir elektrik doku homogenizer kullanarak, dalak yaklaşık 1 dk. santrifüj microcentrifuge tüp içinde 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek lunaparkçı.</li>
	<li>Kırmızı kan hücre lizis 500 µL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği hücre ölümü tarafından ozmotik lizis başlatmak için örnek resuspending tarafından gerçekleştirin. Örnek 1-2 dk oda sıcaklığında kuluçkaya ve sonra FACS arabellek 725 µL içinde resuspend izin.</li>
	<li>300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Pelet FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve yeni microcentrifuge tüp içine 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tüm örnek için yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).</li>
</ol>5. Dendra-r+ hücreleri kullanarak akış sitometresi tanımlaması
<ol><li>300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de IEL/LPL ve dalak örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Granül mix boyama antikor 100 µL içinde resuspend. Mix 1 µL fluorescently Birleşik anti-CD45 antikor FACS arabelleği örnek başına 100 µL ekleyerek boyama antikor hazırlayın. Not: Deneme önce akış sitometresi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için Doygunluk bağlama oluştuğu kullanılan antikor titre önemlidir.</li>
	<li>Örnekleri (karanlık bir konumda) buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Örnekleri FACS arabellek 300 µL içinde resuspend ve onları vasıl 300 x g [mikro santrifüj] için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve örnekleri FACS arabellek 325 µL içinde resuspend. Akış Sitometresi örneği analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
<li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+and+autoimmune+disease%3A+the+hosted+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li>
<li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases%3A+Lessons+from+Immune+Ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li>
<li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li>
<li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li>
<li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li>
<li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX%283%29CR1%28hi%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li>
<li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li>
<li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li>
<li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li>
<li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li>
<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kimlik ve çalışabileceği ve bağırsaktaki microbiota etkilenmiştir hücrelerin karakterizasyonu önemlidir ve mukozal microenvironment bilgilerinden vücudun geri kalanına nasıl geçirilir anlayış kolaylaştıracaktır. Gut ile ilgili hücre geçiş çalışmak için bir yöntem yalıtımı gut ilişkili hücre tarafından evlat edinen bir transfer alıcı fareler onların doku-posta desenlerini belirlemek ve12,13işlev takip gerektirir. Aktarılan belirli hücre türleri izleniyor olabilir ...

Memeli gastrointestinal sistem ana makine1ile simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır bakteri türleri yüzlerce liman. Yerel ortamda mevcut bağışıklık hücreleri ile bu mikropların barışçıl kullanımını zorlayın ve patojen akınları karşı koruyucu bir bariyer oluşturmak. Böylece, bağışıklık hücreleri ve microbiota arasındaki çift yönlü etkileşimler ana bağışıklık sistemi eğitir ve patojenler için bağışıklık reaktivite eşiğini ayarlar komensal bir topluluk kurmak için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kompozisyon veya dysbiosis, can değişimler bağışıklık homeostazı rahatsız ve huzursuz bağırsak iltihapları2,3 tip 1 diyabet ve IBD gibi hastalıklar immün aracılı önde gelen dizginlemek düzenleyici devreler .
Sonra hemen Doğum sırasında aynı zamanda bağışıklık sistemini kurmak bağırsak mikrobiyal topluluklar başlar benzersiz bir gelişimsel pencere dönemi4olgunlaşır. Postnatal microbiota istikrarlı, vardiyalar halinde doğal olarak meydana gelen topluluk kompozisyon ve sık sık5ile değil. İki farklı anatomik konumda bağırsak - lamina propria ve bağırsak epitel6microbiota ile etkileşim bağışıklık hücreleri bulunur. Çeşitli tiplerde bağışıklık hücreleri lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve doğuştan gelen lenfoid hücre gibi) (hangi katmak dendritik hücreler, monosit ve makrofajlar) myeloid hücrelerin yanı sıra dahil bağırsak, mevcut. Bu hücreler, olarak da bilinen hematopoetik hücreler, çok sayıda bağırsak bariyer korumak ve homeostazı korumak işlevler gerçekleştirin.
Bağırsak siteleri kendi düzenleyici işlevlerine ek olarak, mukoza bağışıklık hücreleri sistemik dokunulmazlık7,8,9düzenleyen mikrobiyal iletileri ekstra bağırsak sitelere de taşıyabilir. Bu araştırma ilgi alanıdır ve onların işlevini prob için bağırsak dokusu dışında geçirmek bağışıklık hücreleri tanımlamak yöntemleri ihtiyacını vurgular. Rapor burada protokol photoconvertible floresan protein etiket hücrelere istismar edilir bir ticari olarak mevcut fare modeli kullanır. PhAMeksize fareler ubiquitously ultraviyole (UV) ışık10tarafından geri dönüşümsüz etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık yeşil bir floresan Dendra2 protein hızlı. Yeni doğan farelerin kolon 405 nm ışık sağlamak için fiber optik kanül kullanarak, kaynaklı veya kolon aktarıldığı photoconverted hematopoetik hücreler, dalak bulunabilir göstermektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Lazer< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Işık Yayan Diyot (LED)</td> <td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>DİKKAT: Bu bir Sınıf 3b lazerdir. Lazer kullanılırken koruyucu gözlük takılmalıdır. 1400 mA akım ile 405 nm dalga boyu yayar. Elyaf bağlantılıdır. SMA konektörünü kabul eder. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED sürücüsü</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Lazerden 1200 mA'lık sabit bir akım geçirir. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetik yama kablosu</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>SMA konektörlü 1 m uzunluğunda kablo. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optik kanül</td><td>Dor lensleri&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm uzunluğunda, dış çapı 500 & mikro olan kanül; m ve iç çapı 480 &mikro;m'dir. NA değeri 0,5'tir. Yüksük zirkonya, 1.25 mm OD'dir. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td>, <td>LG3 lazer güvenlik gözlükleri https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 2,4 A akımla 15 V sağlar</td></tr><tr><td>;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>%47 görünür ışık geçirgenliğine sahip turuncu lensler</td></tr><tr><td>https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 Kırmızı ışık&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>74327-10</td><td>15 W lamba https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td><güçlü>Bağırsak hücre izolasyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-893-1389</td><td>DİKKAT: Bu anestezinin solunması baş dönmesine, uyuşukluğa ve hatta bilinç kaybına neden olabilir. Bu anestezik, Sınıf II bir başlıkta kullanılmalıdır. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca / Mg ücretsiz https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Buzağı Serumu</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>0,5</td><td>M konsantrasyonlu</td><td>15575020</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>canlandırıcı DİKKAT: Yutulması halinde zararlıdır ve cilt tahrişine neden olur. 1 M konsantrasyon https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M konsantrasyonlu https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F 70 mikron hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Mikro manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Her kullanımdan sonra %70 etanol ile durulayın. Her kullanımdan önce damıtılmış suda birkaç kez durulayın. Çubuk 8 mm uzunluğunda ve sekizgen bir şekle sahiptir. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma plakası</td><td>Corning Laboratuvar Karıştırıcıları</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma 10104159001</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet yardımcısı</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td><>Tek hücreli süspansiyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>1,5 mL tutar. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Doku homojenizatörü&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>2 adet AA pil gerektirir. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homojenizatör uçları&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastik, ACK lizing tamponu https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 0,5 mL uçlar</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 40 mikron hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-fare CD45 ve nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Klon 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Canlı/Ölü</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td><güçlü>Diğer</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ustura bıçaklar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Kafa kesmek için kullanın. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

vivo photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Enterik bakteri toplulukları erken yaşta kurulur ve bağışıklık hücre gelişimi ve işlevini etkiler. Yenidoğan microbiota antibiyotik kullanımı ve diyet, otoimmün ve inflamatuvar hastalıklara yatkınlık etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda dış etkilere maruz kalabilir. Bozuklukları inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi bağırsak için bağışıklık hücreleri büyük akını ile karakterizedir. Ancak, bağışıklık hücreleri tarafından microbiota şartına ayrıca bağışıklık yanıtı ekstra bağırsak sitelerdeki etkilemek için bağırsaklar dışarı göç. Böylece, tanımlamak ve bağırsak mikrobiyal iletilerden distal sitelere taşıyabilir hücreleri ayırdetmek için gerek yoktur. Burada, ekstra bağırsak sitelerde kimlik geçişten sonra sağlar yeni doğan fareler vivo içinde kolon etiket hücrelere bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir fiber optik kablo 405 nm ışık iki nokta üst üsteeksize 2 - gün eski PhAM farelerin teslim etmek için kullanıldı. Önceki deneyler, 30 s maruz kalma en az sitotoksisite (Şekil 1A) ile iki nokta üst üste hücre maksimal photoconversion vermek tespit edilmiştir. Bu nedenle, sıralı 30 s Etkilenmeler kolon farklı kesimlerinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi yapılmıştır. Lazer pozlama, fareler hemen euthanized ve photoconversion h...

Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.

Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Bu yöntem, mukozal immünoloji alanında, hücrelerin mikrobiyal mesajlar taşıyıp taşımadığı ve eğer öyleyse hangi hücreler olduğu gibi yenidoğan konak immün mikrobiyom etkileşimleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bebek farelerde kolon yerleşik hücrelerini spesifik olmayan bir şekilde etiketlemesi ve onların bağırsak dışı bölgelere kaçakçılık modellerini belirlememizi sağlamasıdır. Lazeri monte etmek için, ışık yayan diyotu veya LED'i LED'in dört pimli M8 konektör kablosu aracılığıyla LED sürücüsüne bağlayın ve bağlantıyı sabitlemek için vidayı dikkatlice sıkın.Görünür bir engel olmadığından emin olmak için LED'in konektör açıklığını ışığa doğru tutun. Optogenetik yama kablosunu açıklığa yerleştirin. Kanülü konektör manşonunun her iki ucuna da yerleştirin.Ardından, fiberoptik kanülü fiberoptik yama kablosuna bağlayarak konektör manşonunun diğer ucunu yama kablosunun ucuna takın. LED sürücüsünü sürekli dalga moduna sıfıra ve akım limitini 1.2 amper olarak ayarlamak için sürekli ayar düğmesini kullanın. Lazer hazır olduğunda, LED sürücüyü karanlık bir yerde bir güç kaynağına takın.Anestezi uygulanmış bir doğum sonrası 10 ila 12 gün

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Yenidoğanların İnsan Sitomegalovirüs (HCMV) enfeksiyonu zeka geriliği önemli bir nedeni temsil, henüz virüs kaynaklı patogenezinde yol açan moleküler olayların hala tam olarak anlaşılamamıştır. Beyin enfeksiyon dinamiğini incelemek için, bütün hayvan...

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Ex vivo olarak etiketlenmiş hücreler ile bir fare modelinde, MRI kullanılarak in vivo hücre takibi için genel bir protokol açıklar. Hücre etiketleme, görüntü alma ve işleme ölçümü için tipik bir protokol dahildir.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Öğrenin, yenidoğan farelerde kolon hücrelerini fotoboyama yöntemiyle işaretleyerek hematopoietik hücrelerin göç potansiyelini değerlendirmeyi. Bu teknik, bağışıklık ve mikrobiyom etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste (Video) | JoVE Journal

Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

Daha fazla video keşfet