Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark
4 Temmuz 2018
Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.
Nazal potansiyel farkı, kistik fibrozu modelleyen transgenik farelerin fenotipini karakterize etmek için değerli bir yöntemdir. Kistik fibrozis için yeni tip tedavilerin etkinliğinin araştırılmasına izin verir. Tekniğin temel avantajları, sürekli üreyen farelerde güvenilir ölçümler sağlamasıdır.
İlgili mortaliteyi azaltır ve testin aynı hayvanda tekrarlanmasına izin verir. Çift lümenli nazal kateteri hazırlamak için, 20 santimetre uzunluğundaki bir polietilen tüpün ortasını, çekmek için yeterince yumuşak olana kadar yaklaşık 10 ila 15 saniye alevin içinde tutun. Ardından, burun probu için yaklaşık 15 santimetre uzunluğunda çok ince bir kılcal boru ve 0,1 milimetre dış çap elde etmek için iki ucu birbirinden ayırın.
Daha sonra, iki kılcal damarı saf etanol ile temizleyin ve yağdan arındırın. Bunları bantla birleştirin ve siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak birbirine yapıştırın. Yaklaşık sekiz santimetre uzunluğunda çift lümenli kateteri elde etmek için probların fazla uzunluğunu bir tıraş bıçağıyla kesin.
Ardından, geçirgen olduklarını doğrulamak için her iki lümenden de su enjekte edin ve uçtan beş milimetre mesafede bir işaret yapın. Daha sonra, elektrolit kremi ve doymuş üç molar potasyum çözeltisini bire bir oranında karıştırarak bir krema karışımı hazırlayın ve küçük hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin. Deney düzeneği için, deney sırasında ve sonrasında hipotermiyi önlemek için, biri ölçüm düzeneği için, diğeri ise deney sonunda hayvanın geri kazanılmak üzere yerleştirileceği kutu için olmak üzere iki ısıtma yastığı kullanın.
Veri belleğine, yüksek giriş empedansına ve yüksek çözünürlüklü voltmetreye bağlı olan bilgisayarı açın. Ardından veri yakalama için yazılımı açın. Elektrotları voltmetreye bağlayın.
Elektrotların ucunu krema karışımına batırın. İlk elektrot ofset değerini kontrol edin ve değer artı veya eksi iki milivolttan büyükse elektrotları reddedin. Ardından peristaltik pompayı açın ve pompa tüpünü nazal kateterin perfüz lümenine yerleştirin.
Nazal kateterin bir lümenini 10 mikrolitrelik bir pipet ucundan elektrolit krem karışımı ile doldurun. Kateteri bir silikon tüp konektörüne uyarlayın ve konektörü krem karışımıyla doldurun. Daha sonra, pozitif elektrodu konektöre yerleştirin.
Ölçüm elektrodu köprü ofset değerini kontrol edin ve değer artı veya eksi iki milivolttan büyükse köprüleri reddedin. Daha sonra, pompa tüpünün proksimal çıkışını, nazal perfüzyon için seçilen çözeltiyi içeren şişeye bağlayın. Daha sonra pompa tüpünün distal çıkışını nazal kateterin perfüzyon lümenine bağlayın.
Daha sonra, nazal kateterin ikinci lümenini taze çözelti A1 ile doldurun. Nazal kateterin ucunu solüsyon A içeren şişeye batırın. 10 saniyelik perfüzyona karşılık gelen nazal kateterin uzunluğunu doldurmak için peristaltik pompanın yönünü tersine çevirin. Daha sonra, fare kafası için destek olarak kullanılacak üç santimetre genişliğinde bir yastık yapmak için bir emici doku tabakası katlayın. Isıtma yastığını emici doku tabakası ile örtün.
Ardından, fareyi ısıtma yastığının üzerine sırt üstü yatırın ve uzuvları ve kuyruğu pede bantlayın. Daha sonra, referans intravenöz kateteri bir arka uzuvun deri altı boşluğuna yerleştirin. İğneyi çıkarın ve silikon tüp konektörüne uyum sağlayın.
Kateteri ve konektörü krema karışımıyla doldurun. Daha sonra, pozitif ölçüm elektrodunu nazal katetere ve negatif referans elektrodu, hayvanın arka bacaklarındaki deri altı boşluğa yerleştirilen katetere bağlayın. Ardından, herhangi bir yer değiştirmeyi önlemek için kateteri ve elektrodu gerektiği gibi bantla sabitleyin.
Referans elektrodu ve köprüleri yerleştirdikten sonra, nazal kateterin ucunu IV kateterin konektörünün içindeki elektrot krem karışımına batırarak ölçüm elektrot köprüsü ofset değerini tekrar doğrulayın. Kararlı, son ofset değerini kaydedin. Şimdi, fare kulaklarını iki emici doku parçası arasındaki boş bir alana ısıtma yastığının üzerine bantla sabitleyin.
Gözlere dokunmadan canlılığı düzeltin. Ağız boşluğundan sıvıyı emmek için dili yana doğru hareket ettirin ve ağzın içine yaklaşık bir santimetre sivri uçlu bir filtre kağıdı fitili yerleştirin. Perfüze burun deliğinden akan sıvıyı emmek için, burnun ayak ucuna ikinci bir filtre kağıdı parçası yerleştirin.
Nazal kateter ucunu ağzın içine yerleştirerek epitel potansiyelinin pozitif kontrol değerini kontrol edin. İnce forsepslerle ve iyi bir doğrudan aydınlatma altında tutarak, burun kateterini burun ucundan dört ila altı milimetreye kadar bir burun deliğine hassas bir şekilde sokun. Anestezik ilaçları enjekte ettikten beş dakika sonra, ısıtma yastığını hayvan başı aşağı bakacak şekilde yaklaşık 30 derece hafifçe eğin.
Maksimum bazal PD değerini izleyin. 30 saniyenin üzerinde stabil olduğunda, nazal mukozayı art arda dört tamponlu çözelti ile dakikada 10 mikrolitre perfüze etmeye başlayın. İlk çözeltiyi 10 saniye ve sonraki her çözeltiyi beş dakika veya sabit bir voltaja ulaşılana kadar perfüze edin.
Geçici Forskolin yanıtı düşmeye başladığında Forskolin perfüze etmeyi bırakın. Değerlendirmeden sonra, fareyi ısıtma yastığından serbest bırakın. Anestezik antagonist karışımı ile uygulayın ve tam iyileşme sağlanana kadar ısıtma yastığı ile kurtarma kutusuna aktarın.
Burada, nazal PD parametreleri için elde edilen bireysel değerlerle birlikte, F508 delesyon CFTR mutasyonu için homozigot, normal bir fare ve bir fare homozigotundan alınan temsili nazal PD izlemeleri verilmiştir. Amilorid yanıtı, nazal mukozanın amilorid içeren bazal tamponlu tuz çözeltisi ile perfüzyonunun sonunda ve başında nazal PD değerleri arasındaki farktır. Klorürsüz yanıt, burun mukozasının klorür içermeyen tamponlu tuz çözeltisi ve amilorid ile perfüzyonunun sonundaki ve başlangıcındaki nazal PD değerleri arasındaki farktır.
Forskolin yanıtı, burun mukozasının klorür içermeyen tamponlu tuz çözeltisi ile birlikte Forskolin ve amilorid ile perfüzyonunun sonunda ve başlangıcında nazal PD değerleri arasındaki farktır. Toplam klorür tepkisi, sıfır klorür perfüzyonu altında elde edilen son iki parametrenin toplamıdır. Proje, faredeki taşıma kusurlarını araştırmak, sağlamak, aynı zamanda velette, büyükte ve gelincik kistik fibroz modelinde
de kullanılabilir.Ve hadım fare modelinde sodyum taşıma kusurları. Protokol kabul edilerek tüm taşıyıcılar incelenebilir. Kemirgenlerin burun boşluğunda çalışmak, nazal yüz bölgesinden gelen duyusal girdilerin temel duvarı nedeniyle son derece hassastır.
Anestezinin yeterli ölümü, özellikle fare burun boşluğunda çalışırken zor dozlanır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, transmembran iyon taşıyıcılarının fonksiyonunu nicelleştiren, farelerde nazal potansiyel farkının ölçümü için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, özellikle kistik fibrozis için geliştirilen yeni tedavilerin değerlendirilmesinde kullanışlıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Transgenik Modeller
Arka Plan
- Nazal potansiyel fark, transgenik farelerin karakterize edilmesi için kullanılan bir yöntemdir.
- Yeni kistik fibrozis tedavilerinin etkinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olur.
- Bu teknik, farelerin sürekli olarak üretilmesi açısından avantajlıdır.
- İlgili mortaliteyi minimize eder ve aynı hayvan üzerinde tekrarlanan testlere olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Farelerde nazal potansiyel farkı ölçmek.
- CFTR ve ENaC gibi iyon taşıyıcılarının fonksiyonunu değerlendirmek.
- Yeni kistik fibrozis tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çift lümenli nazal kateterin hazırlanması.
- Transgenik farelerde nazal potansiyel farkının ölçümü.
- İyon taşıyıcı fonksiyonunun değerlendirilmesi.
- Terapi etkinliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Sürekli olarak üretilen farelerden elde edilen güvenilir ölçümler.
- Test prosedürleriyle ilişkili mortalitede azalma.
- Testlerin aynı hayvan üzerinde tekrarlanabilme imkanı.
- Yeni kistik fibrozis tedavilerinin etkinliğine dair öngörüler.
Sonuçlar
- Nazal potansiyel fark, kistik fibrozis araştırmaları için değerli bir yöntemdir.
- Protokol, fare modellerindeki ölçümlerin güvenilirliğini artırır.
- Bu teknik, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini desteklemektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Farelerde nazal potansiyel fark (NPD) ölçümü, transepitelyal iyon transportunun fonksiyonel bir okumasını sağlayarak kistik fibrozis (CF) tedavilerinin preklinik değerlendirmesine olanak tanır. CFTR ve ENaC aktivitesini in vivo olarak nicelendiren bu yöntem, erken keşif aşamasında hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Aynı hayvan üzerinde tekrarlanan testler, değişkenliği azaltır ve CF terapi geliştirme sürecindeki karar verme aşamaları için öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: CF fare modellerinde fonksiyonel klorür ve sodyum taşınımını ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Doğrudan iyon taşınımı fenotiplemesi yoluyla CFTR modülatörlerinin biyolojik risklerinin azaltılmasını sağlar.
- Bilimsel Değer: Amilorid, klorürsüz ve forskolin yanıtları aracılığıyla CF ile vahşi tip fenotiplerini ayırt ederek öngörü güvenini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Çift lümenli nazal kateterler ve kontrollü perfüzyon kullanarak, analiz standardizasyonu için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Stabil elektrot ofset doğrulaması ve tutarlı solüsyon perfüzyon protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Bilimsel Değer: Amiloride, klorürsüz ve forskolin solüsyonlarına karşı iyon taşıyıcı yanıtlarını ölçerek güvenilir bileşik değerlendirmesi sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kendiliğinden nefes alan farelerde CFTR ve ENaC taşıyıcılarındaki fonksiyonel kusurları nicelendirerek hastalıkla olan ilişkisini korur.
- Operasyonel Değer: Hayvan başına birden fazla teste olanak tanıyarak hayvanlar arası değişkenliği azaltır ve translasyonel sürekliliği destekler.
- Bilimsel Değer: Genotiple korelasyon gösteren kantitatif PD izlemleri sağlayarak risk odaklı ilerleme kararlarına temel oluşturur.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
NPD yöntemi, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar keşif sürekliliğine entegre olarak, terapötik etkinlik değerlendirmelerine veri sağlayan fonksiyonel iyon taşıma verileri sunar.
- Keşif Biyolojisi: Transgenik farelerde bazal ve stimüle edilmiş nazal potansiyel farklarını ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tamponlanmış çözeltilerin standart perfüzyonu ve stabil voltaj okumaları ile analiz hazırlığı sağlar.
- Analizler: Koşul karşılaştırmaları için kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (amilorid yanıtı, klorürsüz yanıt, forskolin yanıtı, toplam klorür yanıtı) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Boylamsal tedavi etkilerini izlemek için aynı hayvanda tekrarlı testlere olanak tanıyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla terapötik iterasyon boyunca CF model karakterizasyonu için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kantitatif iyon transport fenotiplemesi yoluyla hedef doğrulamada öngörüsel güven.
- Operasyonel Değer: Kateter hazırlama, elektrot kalibrasyonu ve perfüzyon kontrolleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: CFTR ve ENaC modülatör etkinliğindeki mekanistik belirsizlikleri azaltarak daha iyi devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Klinik öncesi modellerdeki fonksiyonel transport defekt düzeltmesine dayalı riskle ayarlanmış önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Kemirgen anestezi yönetimi ve nazal kateterizasyon tekniklerinde uzmanlık.
- Yüksek empedanslı voltmetre, peristaltik pompa ve sıcaklık kontrollü ısıtma pedlerini içeren cihazlar.
- Çözelti hazırlama, elektrot ofset doğrulaması ve perfüzyon zamanlamasının ekipler arası standardizasyonu.
- Farklı kemirgen suşları ve CFTR mutasyon modelleri için adaptasyon değerlendirmeleri.
- Pratik sınırlamalar arasında, nazal kaviteye erişimin cerrahi hassasiyeti ve bronko-aspirasyonu önlemek için anestezi derinliğinin optimizasyonu yer almaktadır.
