Name: Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Keşfedin, sıçan retinasından arteriyol izolasyonu protokolünü; elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve basınç miyografisi çalışmaları için. Retinal kan akışı düzenlemesini anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu raporda açıklanan protokoller geliştirilmesi hibe aşağıdaki finansman kuruluşları tarafından desteklenen: BBSRC (1/I026359/BB), görme (1429 ve 1822), juvenil diyabet araştırma Vakfı (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), için mücadele İngiliz kalp Vakfı (PG/11/94/29169), HSC R & D bölümü (STL/4748/13) ve MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur an işçi-in Medtronic (Kardes sehirleri, Minnesota, ABD), şimdi onun mevcut çalışma değil çatışma burada sunulan ile.

Yukarıda açıklanan protokoller pratik gerektirir ama çok az sorun giderme adımları konusunda ulaşılabilir olmalıdır. Ortalama bir günde 6-8 kullanışlı arteriyoller izolasyonu elde etmek ve 3-4 başarılı deneyler ulaşmak. Karşılaşılan sorunlar, ancak, başarı oranlarını artırmaya yardımcı olmak için alınan bazı adımlar vardır. Zaman zaman biz bulduk, özellikle genç rats (< 8 hafta), kullanırken arteriyoller verimi düşük olabilir. Bu sorunu aşmak için her bir toz arasında retina dokusunun (10-30 s 500 x g) centrifuging içinde 1.12-1.14 adım öneririz. Bu kez damarları verimini artırmak için yardımcı olur ancak aynı zamanda hücre artıkları hazırlık içinde miktarını artırır.
Basınç myography çalışmalar kapları cannulating zaman arteriyoller yakın çatallanma site i ciddi herhangi bir yan dalları için dikkatli bir şekilde kontrol etmek önemlidir. Bu ortak bir neden kaçak ve basınç kaybı deneme sırasında temsil eder. [Ca2 +]ben iletişim kuralları ile ortaya çıkabilir ana konu yükleme boya düzeyidir. Zavallı boya yükleme düşük sinyal-gürültü oranı, normal Ca2 + homeostazı çalışmasının sonuçlarında aşırı yükleme sırasında yol açar. Ya bu sorunların olasılığını azaltmak için Retina homogenate küçük bir aliquot kaldırılabilir ve izole kaplar periyodik olarak yükleme iletişim kuralı sırasında kontrol. Girişim yama-kelepçe deneyler, gigaseal formasyonu başarı oranını olduğunda nasıl son derece bağımlı de bazal lamina sindirmek. Ne zaman başlangıçta bu protokol test veya yeni birçok enzim kullanarak bu enzim sindirim konsantrasyon/süresi ayarlamak gerekli olabilir. Dikkatle endotel ve düz kas katmanları ayrılması izleme yeterince bazal kaldırmak için yeterli sindirim sağlayacak laminal erişim kazanmak için. Dikkatli izlenmesi de gemi sıkmak başlar gibi meydana gelen aşırı sindirim, önlemek gereklidir. Bu durum ortaya çıkarsa, düz kas hücreleri sık sık düzeltme eki kelepçe kayıt için çok kırılgan. Enzimler uygularken DNaz eklemek önemlidir ben üzerinden kurtarılmış DNA iplikçiklerini kaldırılmasını sağlamak için yalıtım işlemi sırasında hücreler zarar görmüş. DNA parçalarının yapışkan ve Temizleme işlemi (adım 4.4), son aşamalarında arteriyol için uymaları forseps neden kez gemi kaybı sonuçlanan. Gemilerin temizlik Teknik olarak zor ve en yüksek büyütme oranını en iyi olası ucu çapının kapalı forseps (20 X) nazik süpürme hareketleri ile gerçekleştirilir. Temizleyicileri arasında laboratuvar rulo ile forseps temiz.
Vurgulanan daha önce bir anahtar motivasyon arkasında bu el yazması özetlenen protokolleri gelişimi daha iyi kan akımı retinal vasküler hastalıklar sırasında neden bozulur anlamak için oldu. En-in bizim iş bugüne Diyabetik göz hastalığı28,33üzerinde odaklanmıştır. Arteriyoller kemirgen modeller 1 bölümünde açıklanan yöntemleri kullanarak diyabetin Retina izole olabilir. Diyabetik hayvanlardan izole Retina arteriyoller üzerinde deney yakından tarafından damarları vivo içindedeneyimli hiperglisemik koşulları çoğaltmak denemek önemlidir. Bu nedenle, normalde yalıtım ve 25 mM deneysel çözümler D-glikoz seviyelerini yükseltmek. Vasküler Bodrum membranlar kalinlasma diyabet34,35sırasında Retina damarlarında iyi tanınan bir olgudur. Hayvanlar uzun süreli diyabet (> 1 ay hastalık süresi) kullanırken, artan enzim konsantrasyonları veya sindirim kez kez yama-kelepçe kayıt yöntemleri uygulamayı etkinleştirmek için gereklidir.
Ex vivo kullanmanın önemli bir sınırlama retinal vasküler Fizyoloji çalışması için Retina arteriyoller izole ve patofizyolojisi çevreleyen Retina neuropile kayıptır. Kaldırma Retina gliyal ve nöronal hücre hücre fizyolojisi çalışmaları retinal vasküler düz kas hücreleri için kolay erişim sağlar, ancak, gemilerin yanıt vazoaktif arabulucu olarak önemli ölçüde devamsızlık ve Retina varlığı değiştirebilirsiniz doku. Adenozin tri-fosfat (ATP), eylemler Örneğin, bu noktada iyi bir örnek sağlar. İçinde izole kaplar36sağlam bir daralma Retina arteriyoller, ATP Tetikleyicileri eklenmesi sıçan, sağlam bir neuropile varlığı ise37damarlar dilate. Bu nedenle, mümkün olan her yerde, biz genellikle izole arteriyol hazırlıklarımız Retina bütün bağlar- ex vivo ve in vivo ölçümleri damar çapı ve kan akışı16,37 kullanarak anahtar bulgular doğrulamayı deneyin . Belirtmek gerekirse, küçük arteriyoller ve kılcal domuz Retina bütün periosteum ex vivo38,39' eğitimi için yeni yöntemler son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Böyle hazırlıkları büyük ölçüde Retina neuropile Retina arterioler ve kapiller sesi nasıl düzenler ve nasıl nöronal aktivite retina Retina haemodynamics değişimler modüle anlayışımızı geliştirmek muhtemeldir.
Bu makalede açıklanan yordamlar anlama arterioler düz kas hücre fizyolojisi izole sıçan retina arteriyoller kullanımına odaklanmış olsa da, şu anda protokolleri de endotel hücre işlevinde çalışmanın etkinleştirmek için gelişmekte olan Bu gemiler. Ön çalışma, biz Ca2 + görüntüleme ve çalışmalar kayıt patchclamp mükellef bulunmaktadır uygun endotel hücre tüpleri vermeye Retina arterioler segmentlerinin enzimatik sindirim değiştirilmesinde başarılı olmuştur. Cannulation izole arteriyoller intraluminal teslim uyuşturucu sağlayarak her iki ucunda, gelecekte de bu gemiler araştırılması etkinleştir endotel bağımlı vasodilatory yanıt-e doğru olabilir.

Retinada kan akışını nasıl denetlenir en önemli noktadır önemli bir hedefi, anormal kan akımı görme tehdit eden çeşitli patogenezinde karıştığı olmuştur beri retina hastalıkları1,2,3, 4. İç retina sinir hücreleri ve Gliyal hücreler malzemeleri, retina dolaşım kan retina damarları ve kılcal damarlar geçen Retina venüller ve sonunda damarlar5arteriyoller tümünün bulunduğu bir bitiş arter düzenleme vardır. Kan akımı retina Retina arter ve arteriyoller sesi hem de retinal kapiller ve sonrası kapiller venüller6,7, duvarlarında yer alan perisitlerden contractile etkinliği tarafından düzenlenmiştir 8. retinal vasküler sesi kontrolünü karmaşıktır ve girişlerden dolaşım sistemi ve çevresindeki Retina dokusu, moleküller ve hormonlar, dolaşan kan gazı da dahil olmak üzere bir dizi tarafından modüle ve vazoaktif maddeleri yayınladı retinal vasküler endotel ve macroglia9,10,11. Retina arteriyoller retina küçük atardamar dallarında ve vasküler düz kas hücre tek bir tabaka oluşur ve bir iç astar boyuna endotel hücreleri12,13, düzenlenen 14. Bu gemiler vasküler direnç retina dolaşım içinde ana site oluşturmak ve bu nedenle retinal kan akımı yerel kontrol önemli bir rol oynamaktadır. Retina arteriyoller genişletici veya vasküler düz kas contractility10,15,16değişikliklerden aracılı onların luminal çapı constricting tarafından retina kılcal kan akışını düzenler. Moleküler mekanizmalar hangi Retina arteriyoller düzenleyen Retina perfüzyon bu nedenle nerede arterioler düz kas hücreleri erişilebilir ve koşulları olabildiğince fizyolojik olarak yakın Okulu'nu hazırlıklar gerektirir anlama.
Ex vivo hazırlıklar izole Retina kan damarlarının ederken hala onların işlevsellik ve altta yatan endotel ile Birleştiricisi koruyarak vasküler düz kas hücreleri erişim sağlar. İzole gemileri kullanan bugüne kadar en çalışmaları büyük sığır veya domuz arteryel gemilerin üzerinde (60-150 µm) odaklanmıştır. Bunlar piyasada bulunan tel veya vasküler düz kas hücre contractile mekanizmaları17,18farmakolojik sorgulama etkinleştirmek için basınç myograph sistemleri monte edilebilir. Böyle hazırlıkları büyük ölçüde normal şartlar altında retinal vasküler fizyoloji ile ilgili bilgilerimizi katkıda bulunmuştur. Kaç çalışmalar Retina arteriyoller küçük laboratuvar hayvan--dan onların daha küçük çapta izole kullandık (~ 8-45 µm) geleneksel myography sistemleri19,20,21,22bunların kullanımı engeller. Önemli bir avantaj, ancak, küçük Laboratuvar hayvanlarının gemileri genetik olarak değiştirilmiş, transgenik ve retina hastalığı modelleri geniş durumu kullanmaktır. Küçük Laboratuvar hayvanlarının da vivo içinde müdahale çalışmaları için daha fazla mükellef bulunmaktadır.
Burada izole ve sıçan retina arteriyoller basınç myography deneyleri için cannulating için basit iletişim kuralları açıklar. Bu gemiler kullanarak Ca2 + görüntüleme ve Elektrofizyoloji iletişim kuralları da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bunlar daha fazla vasküler düz kas contractility ve kan akımı retina Yönetmeliği kazandırabileceğini.

<table><tbody><tr><td>Beherler</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Kavisli Makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık plastik pipet / transfer</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL en iyisidir ancak diğer boyutlar kabul edilebilir; Açıklığı genişletmek için ucu çıkarın</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Brunel Mikroskoplar Ltd</td><td></td><td>Veya herhangi biri eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Herhangi bir eşdeğer ince forseps</td></tr><tr><td>Pasteur pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Sürtünmeyi azaltmak için ateşle parlatılmış, ancak ucu daraltmak için yeterli değil</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer 10 cm'lik ürün</td></tr><tr><td>Pipet emziği</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Veya herhangi biri eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Arıtılmış su temini</td><td>Merek</td><td>Milli-Q İntegral Su Arıtma Sistemi</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer sistem</td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı test tüpü</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tırtıklı forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tek kenarlı bıçaklar</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Veya herhangi biri eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Veya herhangi bir esnek yüzey&nbsp;</td></tr><tr><td>Test tüpü rafı</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Basınç miyografisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 eksenli mekanik manipülatör</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (veya herhangi bir eşdeğer ürün)</td></tr><tr><td>3 musluklar</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Hava tablası</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Temiz Tezgah</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Analiz yazılımı&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Ücretsiz görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Analiz eklentisi</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>imageJ için özel eklenti Ücretsiz olarak indirilebilir</td></tr><tr><td>Kanülasyon pipet camı</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>TW150F-4</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Dijital Termometre</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Fluo-4-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td> DMSO Forseps World Precision <td>Instruments'ta 1 mM stok yapın</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Dumont #7 14097</td><td>Herhangi bir eşdeğer ince forseps</td></tr><tr><td>Fura-2-</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>DMSO'da 1 mM stok yapın</td></tr><tr><td>Cam tabanlı kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Yardımcı pipet camı</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>IB150F-3</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Sıralı ısıtıcı</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Ticari eşdeğer SH-27B Çözümü Harvard'dan Sıralı Isıtıcı Aparat</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Manometre</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Mikroelektrot çektirme</td><td>Sutter aletleri</td><td>P97</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 mikroskop</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter aletleri</td><td>MP-285</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Çok kanallı dağıtım manifoldu&nbsp;</td><td>Bilimsel</td><td>Perfüzyon Kalemini Otomatikleştirin</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Pipet dolgusu&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>Şırınga ısıtılır ve pipetin iç çapına çekilir</td></tr><tr><td>Pipet tutucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-HL-U</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Emme pompası</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Körükleri ters çevirerek dönüştürülmüş havalandırma pompası</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>Advent</td><td>W558818</td><td>75&mu; m çaplı</td></tr><tr><td>Tygon Boru</td><td>VWR</td><td>çeşitli boyutlar</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>USB kamera</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Video yakalama yazılımı</td><td>Hypercam</td><td>sürüm 2.28.01</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x20 lens</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x4 lens</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Veya herhangi biri eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Y-konektörler</td><td>Dünya Percision Aletleri</td><td>14012</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Yama sıkıştırma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 musluklar</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>3 eksenli mekanik manipülatör</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Hava tablası</td><td>Teknik İmalat Şirketi&nbsp;</td><td>Temiz Tezgah</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg günlük 50 & mu'da çözülür; L of DMSO (çözünmek için sonikat)</td></tr> <tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axopatch 200a</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Analog dijital dönüştürücü</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891 & nbsp;</td><td>LCH içinde 0.1 mg / mL</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Dijital Termometre</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Çalışma stoğu 1 MU mL-1 (10 mL LCH içinde seyreltilmiş 10 MU)&nbsp;</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Herhangi bir eşdeğer ticari ürün</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Herhangi bir süper ince forsep</td></tr><tr><td>Cam tabanlı kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>CV203BU</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Sıralı ısıtıcı</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Ticari eşdeğer SH-27B Çözümü Harvard Apparatus'tan Sıralı Isıtıcı</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Mikroelektrot çektirme</td><td>Sutter aletleri</td><td>P97</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 mikroskop</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter aletleri</td><td>MP-285</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Çok kanallı dağıtım manifoldu&nbsp;</td><td>Bilimsel</td><td>Perfüzyon Kalemini Otomatikleştirin</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Yama yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Pclamp v10.2</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Pipet dolgusu&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>Şırınga ısıtılır ve pipetin iç çapına çekilir</td></tr><tr><td>Pipet tutucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-HL-U</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Proteaz Tip XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>LCH içinde 0.01mg / mL</td></tr><tr><td>Tek kanallı pipet camı</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>IB150F-3</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Emme pompası</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Körükleri ters çevirerek dönüştürülmüş havalandırma pompası</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m çaplı</td></tr><tr><td>Tygon Boru</td><td>VWR</td><td>çeşitli boyutlar</td><td>USB kameraya uyacak herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tam hücreli pipet camı</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x20 lens</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x4 lens</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x40 lens</td><td>Nikon</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Y-konektörler</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Ca2+ görüntüleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 musluklar</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>3 eksenli mekanik manipülatör</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Edinme yazılımı&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma Ltd.</td><td>Edinme Motoru V1.1.5</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>Hava tablası</td><td>Teknik İmalat Şirketi&nbsp;</td><td>Temiz Tezgah</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Konfokal görüntüleme için analiz yazılımı</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Ücretsiz görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer</td></tr><tr><td>ürün Konfokal mikroskop</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>Ya da herhangi bir eşdeğer ürün; konfokal</td></tr><tr><td>Dijital Termometre</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Herhangi bir süper ince forsep</td></tr><tr><td>Cam tabanlı kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Sıralı ısıtıcı</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Ticari eşdeğer SH-27B Çözüm Harvard'dan Sıralı Isıtıcı</td></tr><tr><td>Aparat Ters Çevrilmiş mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>Monokromatör ve nbsp;</td><td>Cairn Araştırma Ltd.</td><td>Optoscan</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>Çok kanallı dağıtım manifoldu&nbsp;</td><td>Bilimsel</td><td>Perfüzyon Kalemini Otomatikleştirin</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Pipet dolgusu&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>Şırınga ısıtılır ve pipetin iç çapına çekilir</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop yazılımı</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF sürüm 3.3.</td><td>Ya da herhangi bir eşdeğer ürün; konfokal</td></tr><tr><td>Emme pompası</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Körükleri tersine çevirerek dönüştürülmüş havalandırma pompası</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m çap</td></tr><tr><td>Tygon Boru</td><td>VWR</td><td>çeşitli boyutlar</td> Su banyosu Grant Sub Aqua 12 <td>Plus'a uygun herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>x100 lens</td><td>Nikon</td><td>x100 NA 1.3 yağ</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>x20 lens</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>x20 lens</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; konfokal</td></tr><tr><td>x4 lens</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; mikroflorimetri</td></tr><tr><td>x63 lens</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 YAĞ CS &infin;/0.17/E</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün; konfokal</td></tr><tr><td>Y-konektörler</td><td>Dünya Performansı Aletler</td><td>14012</td><td>Veya herhangi bir eşdeğer ürün</td></tr><tr><td><güçlü>Pipetler< ><</td><td></td><td></td><td>güçlü>Deney için pipet üretimi için özellikler ve ayarlar</güçlü></td></tr><tr><td>Yardımcı pipet</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>IB150F-3</td><td>İç çap: 0,86 mm Rampa: 261 Basınç: 300 Isı: 280 Çekme : 0 Hız: 56 Süre: 250 Döngü sayısı: 4 Uç çapı: 0.5-2 &mu; m Parlatma: evet Son Direnç: >10 M&Omega;</td></tr><tr><td>Kanülasyon pipeti</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>TW150F-4</td><td>İç çap: 1,17 mm Rampa: 290 Basınç: 300 Isı: 280 Çekme: 0 Hız: 58 Süre: 150 Döngü sayısı: 4 Uç çapı: 3-10 &mu; m Parlatma: no Son Direnç: < 1 M & Omega;</td></tr><tr><td>Hücre içi yama</td><td>Dünya Percision aletleri</td><td>IB150F-3</td><td>İç çap: 0,86 mm Rampa: 261 Basınç: 300 Isı: 280 Çekme: 0 Hız: 56 Süre: 250 döngü sayısı: 4 Uç çapı: 0.5-2 &mu; m parlatma: evet Son direnç: >5 M&Omega;</td></tr><tr><td>Tam hücre yama</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>İç çap: 1.17 mm Rampa: 296 Basınç: 200 Isı: 287 Çekme: 0 Hız: 50 Süre: 250 döngü sayısı: 4 Uç çapı: 2-3 &mu; m Parlatma: yardımcı olur ancak gerekli değildir Son Direnç: 1-2 M & Omega;</td></tr></tbody></table>

retina arteriyoller yalıtım ex vivo hücre fizyolojisi çalışmaları için

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Retina bir önemli kan akımı gerektirir yüksek metabolik olarak aktif bir dokudur. Photoreceptors choroidal damarları tedarik ederken iç retina retina dolaşım destekler. Retina perfüzyon değişiklikler diabetik retinopati dahil olmak üzere çok sayıda görüş tehdit bozuklukları için katkıda bulunmak, glokom ve Retina şube occlusions damar. Moleküler mekanizmalar yoluyla retina ve nasıl bunlar göz hastalığı sırasında değişmiş kan akışını kontrol dahil anlamak bu koşullar tedavisi için yeni hedefler tanımlaması neden olabilir. Retina arteriyoller ana direnç damarlarının Retina ve sonuç olarak, değişiklikleri luminal çapı ile retina hemodinami düzenlenmesinde anahtar bir rol oynamak. Son yıllarda, çeşitli hücre fizyolojisi çalışmaları da dahil olmak üzere uygulamalar için uygun olan arteriyoller sıçan retina dan izole için yöntemler geliştirdik. Bu hazırlık nasıl kan akımı retinada kontrol edilir ve bize bazı göz hastalığı sırasında oluşan anahtar değişiklikleri tanımlamaya izin verdi yeni anlayışlar vermeye başlamış durumda. Bu makalede, biz sıçan retina arteriyoller yalıtım için yöntemleri tarif ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalar bunların kullanımı için iletişim kuralları içerir. Bu gemiler de mükellef kullanılmak üzere PCR-, western blot ve immünhistokimya tabanlı çalışmalar bulunmaktadır.

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Diyabetik retinopati, glokom ve dal damar tıkanıklıkları gibi görmeyi tehdit eden çeşitli retina hastalıklarının gelişiminde anormal kan akışı rol oynadığından, retinada kan akışının nasıl kontrol edildiğini anlamak önemli bir hedeftir. Retinal arteriyoller, bu damarları çevreleyen düz kas hücrelerinin kasılma oranındaki değişikliklerin aracılık ettiği luminal çaplarını genişleterek ve daraltarak retinadaki kan akışının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, retina perfüzyonunun düzenlenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, retinal arteriolar düz kas hücrelerine mümkün olduğunca fizyolojik koşullara yakın koşullarda erişilebilecek ve çalışılabilecek hazırlıklar gerektirir.Bu videoda, yama klemp, kalsiyum görüntüleme ve basınç miyografisi çalışmalarında kullanılabilecek sıçan retinasından arteriyollerin izolasyonu için basit bir protokol gösteriyoruz. Son yıllarda, bu preparat hem sağlık hem de hastalıkta vasküler düz kas kasılma ve retinadaki kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılmıştır. Malzeme tablosunda gösterildiği gibi, Hanks'or LCH içeren bir litrelik düşük kalsiyum çözeltisi hazırlayın.Doku toplanmadan önce izolasyon ekipmanını monte edin. Cam Pasteur pipetinin pürüzsüz hale getirilmesi için ateşle parlatılması gerekir, ancak ucu daraltmamalıdır. Plastik bir pipeti yaklaşık beş ila yedi milimetre açıklığa kadar kesin.Gözleri LCH çözeltisine batırılmış diseksiyon kabına yerleştirin. Orbital kas eklerini veya optik siniri tutarak gözü tabağa sabitlemek için bir set forseps kullanın. Gözü stabilize etmek için ankraj noktasının skleraya mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.Bıçağı kullanarak, ora serrata boyunca korneayı kesin ve forseps ile skleraya hafifçe bastırarak lensi çıkarın. Bu görüntüde gözün arkasında gördüğümüz küçük, dairesel bölge optik sinirdir. Bıçağı kullanarak, vizör lastiğini optik diskten simetrik olarak ikiye bölün.Kapalı forseps kullanarak, optik diskte kalan ekleri çıkarmaya dikkat ederek, vizör lastiğinin iki yarısındaki retinaları nazikçe fırçalayın. İşlemi ikinci gözle tekrarlayın ve diseke retinaları plastik pipet ve küçük bir damla LCH ortamı kullanarak test tüpüne aktarın. Plastik pipeti kullanarak, test tüpünü LCH ile yaklaşık beş mililitreye kadar doldurun ve retinaların tüpün dibine yerleşmesine izin verin.Tüpten yaklaşık dört mililitre çözelti çıkararak ve plastik pipet kullanarak taze LCH ekleyerek dokuyu yaklaşık üç kez yıkayın. Gerektiğinde, yabancı doku çıkarılmalıdır. Dokunun pipete yapışmasını önlemek için cam Pasteur pipetinin içini cilalı uçlu LCH ile yıkayın.Aynı pipeti kullanarak, test tüpünden yaklaşık dört mililitre çözelti çıkarın ve yaklaşık iki mililitre taze LCH ekleyin. Dokuyu cam pipetin ucundan yavaşça çekerek retinaları nazikçe ayırın ve içeriği test tüpüne boşaltın. Bu aşamada baloncuklar sokmamaya çalışın ve retinalar yaklaşık iki ila üç milimetre kare boyutuna kadar parçalanana kadar işlemi tekrarlayın.Pipetin içini yaklaşık iki mililitre LCH ile yıkayın ve bunu test tüpüne boşaltın. İçeriğin beş ila 10 dakika içinde dibe çökmesine izin verin. Doku parçaları yaklaşık bir milimetre kare büyüklüğünde olana kadar öğütme işlemini daha önce tarif edildiği gibi biraz daha kuvvetle tekrarlayın.Dokunun oturmasına izin verin ve içerik tamamen homojen hale gelene ve hiçbir retina parçası kalmayana kadar bir kez daha kuvvetle tekrarlayın. Bu aşamadaki çözelti görünüşte sütlü görünmelidir. Bu teknik, izolasyon başına 200 ila 2.500 mikrometre uzunluğunda sekiz arteriyol segmenti verecektir.Arteriolün bir ucunun karşı ucun oklüzyonu ile kanülasyonu, miyojenik yanıt olarak da bilinen basınca bağlı vazokonstriksiyonun ölçülmesine izin verir. Arterioler basınç miyografisi şu şekilde yapılır. Bir retinal homojenat alikutu, ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş bir fizyolojik kayıt odasına aktarılır.Homojenatı en az beş dakika haznenin dibinde dinlenmeye bırakın. Uzunluğu 200 mikrometreden büyük ve damarın kanüle edilebileceği açık bir uca sahip arteriolleri belirlemek için kayıt odası boyunca görsel olarak tarayın. İnce forseps ve geminin üzerine yerleştirilmiş küçük bir tungsten tel kayma kullanarak geminin bir ucunu sabitleyin.Tungsten telin üst üste binen uçlarını kullanarak, açık uç basınçlandırma kanülü ile aynı hizada olacak şekilde kabı banyo boyunca yatay olarak hareket edecek şekilde manevra yapın. Hazneyi sıfır kalsiyum ile perfüze edin Hanks'at 37 santigrat derece. Kanülasyonlar cam pipetlerle yapılır.Kanül, ince bir mikromanipülatör kullanılarak damarın açık ucuna yerleştirilir. Uç, mikroskop üzerindeki odak düzleminin ayarlanmasıyla değerlendirildiği gibi, hem kabın ucu hem de kanül ucu aynı anda odakta olacak ve basınçlandırma kanülü damar açıklığına ilerleyecek şekilde açıklığın hemen yanına yerleştirilir. Kanülasyon işlemine yardımcı olmak için bir yardımcı pipet gereklidir ve kanül damar lümenine ilerletilirken aynı anda arteriyolu nazikçe dizginlemek ve arteriolar duvarı basınçlandırma kanülü üzerinde yönlendirmek için kullanılır.Bu prosedür, yüksek bir başarı oranı elde etmek için her iki manipülatörün eşzamanlı, kontrollü hareketini ve kapsamlı uygulamayı gerektirir. Sıfır milimetre cıvada bir dakikalık kayıttan sonra, intraluminal basınç 40 milimetre cıvaya yükseltilir ve damar hızla genişlemelidir, bu da başarılı kanülasyonu doğrular. Basınca bağlı vazokonstriksiyon, yani miyojenik yanıt, daha sonra yaklaşık 15 dakikalık bir süre içinde gelişecektir.Retinal vasküler düz kas hücrelerinden yapılan yama klemp kaydı, hücre içi kalsiyumu ve dolayısıyla hücresel kontraktiliteyi düzenleyen plazma membranı iyonik akımlarının araştırılmasını sağlar. Tam hücre ve tek kanallı kayıt, aşağıdaki gibi ana arteriyollerine gömülü olan bireysel düz kas hücrelerinden mümkündür. Retinal arteriyoller izole edilir ve tungsten tel kaymaları ile kayıt odasına sabitlenir.Yama pipeti ile arteriolar düz kas hücre zarı arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için bazal laminanın sindirilmesi gerekir. Arteriyoller, 37 santigrat derecede sıralı bir dizi enzim çözeltisi ile süper kaynaştırılır, bu da görüntüdeki oklarla gösterildiği gibi bitişik hücrelerin elektriksel olarak ayrılmasına neden olur. Sindirim seviyesi ilk olarak kollajenaz basamağı sırasında endotel ve düz kas tabakalarının görsel olarak ayrılması ile değerlendirilir.Kalan bazal lamina ve / veya periferik nöropil ipliklerinin çıkarılması, ince forsepslerin kapalı uçlarının damarın yüzeyi boyunca dikkatlice süpürülmesiyle sağlanır. Yama klempleme için, yama pipetinin ucu, ilgilenilen hücrenin üzerine dikey olarak yerleştirilir ve arteriolar düz kas zarı ile temas etmek için mikromanipülatörün ince, yavaş hareketi kullanılarak kademeli olarak indirilir. Bu, hücre hareketi ve pipet direncindeki bir değişiklik ile değerlendirilir ve edinim yazılımında bir hücre sızdırmazlığı test protokolü kullanılarak ölçülür.Pipet hücrenin üzerine indirildiğinde, sızdırmazlık direnci yaklaşık beş kat artacaktır. Pipetin arkasına geçici olarak negatif basınç uygulanır ve yavaş yavaş bir gigaseal oluşturulur. Bu, bir ila beş dakika boyunca tekrarlanan negatif basınç uygulamalarını gerektirir.Tüm hücre kaydı için, delikli yama-kelepçe yöntemi ağırlıklı olarak kullanılır. Daha önce tarif edildiği gibi, hücre içi benzeri çözelti ve amfoterisin B içeren bir pipet ile bir gigaseal oluşturulur. Erişim direnci, edinim yazılımındaki membran test protokolü kullanılarak izlenir. Erişim direnci 15 megaohm'un altına düştüğünde, seri direnç kompanzasyonu gerçekleştirilir.Tipik olarak, delikli yama modunda seri direnci yaklaşık% 75 oranında telafi etmek mümkündür. Voltaj adımları veya rampa protokolleri daha sonra tüm hücre akımlarını ölçmek için kullanılabilir. Retinanın ayrışmasını takiben, birincil, ikincil ve ön kılcal arteriyoller, kalibrelerine ve vasküler düz kas hücrelerinin düzenine göre tanımlanabilir.Birinci ve ikinci dereceden arteriyoller, parlak alan mikroskobu altında görsel olarak benzer görünür, ancak boyutlarına göre ayırt edilebilir. Pre-kılcal arteriyoller, hazırlıktaki en küçük arteriyel damarlardır ve vasküler düz kas hücrelerinin aralıklı düzenlenmesi nedeniyle kolayca tanınabilir. İzole edilen arteriyoller, izolasyon içindeki kılcal damarlardan ve venüllerden net bir şekilde ayırt edilebilir.Kılcal damarlar, yaklaşık dört ila 10 mikrometre çapında küçük kalibreli damarlardan oluşan bir ağ örgüsü olarak belirgindir, venüller ise ince duvarlıdır ve düz kas hücresi kapsama alanından yoksundur. Primer, sekonder ve pre-kapiller arteriyoller, basınç miyografisi, kalsiyum görüntüleme ve yama-klemp çalışmaları için uygundur. Basınçlı arterioller kullanarak, miyojenik yanıtın oluşumunda rol oynayan moleküler mekanizmaları araştırdık.Bu görüntüdeki fotomikrograflar, bir basınç miyografisi deneyi sırasında çeşitli zaman noktalarında bir sıçan retinal arteriolünü göstermektedir. Aşağıdaki zaman rotası grafiği, deneyin tüm seyri boyunca kap çapındaki değişiklikleri göstermektedir. Basınçlandırmadan hemen sonra, damar genişler ve bunu 15 dakika sonra sabit bir durum seviyesine ulaşan aktif bir miyojenik daralma izler.Deneyin sonunda sıfır kalsiyumlu Hanks çözeltisine wortmannin eklenmesi, normalizasyon amacıyla kabı pasif çapına genişletir. Bu slayt, membran gerilmesinden önce ve sonra bir retinal arteriol düz kas hücresinden tek kanallı bir yama klemp kaydının bir örneğini göstermektedir. Bu hücre üstü yama, yama pipetine negatif basınç uygulandığında aktivitesi artan, esneme ile aktive edilen iki TRPV2 kanalı içerir.Burada açıklanan protokoller pratik gerektirir, ancak en az sorun giderme ile gerçekleştirilebilir olmalıdır. İzole arteriyollerin izolasyon ile aynı gün kullanılmasını tavsiye ederiz. Yöntem, sıçan retinal arteriyolleri için optimize edilmiştir, ancak fare retinalarında kullanılabilir.Şimdi bu preparatı kapsamlı bir şekilde kullandık, ancak mümkün olduğunda, ex vivo retinal tam montajlar ve in vivo kan damarı çapı ve kan akışı ölçümleri kullanarak temel bulgularımızı doğrulamaya çalışıyoruz.

isolation-of-retinal-arterioles-for-ex-vivo-cell-physiology-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ex vivo ERG, hayvanların veya insanların izole edilmiş sağlam retinalarından doğrudan retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek için kullanılabilir. Burada, retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini incelemek için in vivo ERG sistemlerinin ex vivo ERG kayıtlarına ne kadar yaygın olarak uyarlanabileceğini gösteriyoruz.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

Vizyon tehdit eden birçok oküler hastalıklar işlevsel olmayan retina yüzdeki ile ilişkilidir. Bu nedenle, retina arteriyol yanıt ölçümü temel patofizyolojik mekanizmaları araştırmak önemlidir. Bu makalede fare retina arteriyol yalıtım ve damar çapı vazoaktif maddelerin etkilerini değerlendirmek için hazırlık için detaylı bir iletişim kuralı.

Fare retina arteriyoller Ex Vivo reaktivite ölçümü için hazırlık adımları

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Retina damar sisteminin oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabet/diyabetik retinopati ile ilişkili hakaretlerden ölüme karşı direncini izlemek için bir koruma testi geliştirilmiştir.

Farelerde Retina Damar Sisteminin Diyabete Bağlı Ölümden Korunmasını Saptamak İçin Bir Test

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Keşfedin, sıçan retinasından arteriyol izolasyonu protokolünü; elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve basınç miyografisi çalışmaları için. Retinal kan akışı düzenlemesini anlamaya katkı sağlar.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Daha fazla video keşfet