Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Diyabetik retinopati, glokom ve dal damar tıkanıklıkları gibi görmeyi tehdit eden çeşitli retina hastalıklarının gelişiminde anormal kan akışı rol oynadığından, retinada kan akışının nasıl kontrol edildiğini anlamak önemli bir hedeftir. Retinal arteriyoller, bu damarları çevreleyen düz kas hücrelerinin kasılma oranındaki değişikliklerin aracılık ettiği luminal çaplarını genişleterek ve daraltarak retinadaki kan akışının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, retina perfüzyonunun düzenlenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, retinal arteriolar düz kas hücrelerine mümkün olduğunca fizyolojik koşullara yakın koşullarda erişilebilecek ve çalışılabilecek hazırlıklar gerektirir.

Bu videoda, yama klemp, kalsiyum görüntüleme ve basınç miyografisi çalışmalarında kullanılabilecek sıçan retinasından arteriyollerin izolasyonu için basit bir protokol gösteriyoruz. Son yıllarda, bu preparat hem sağlık hem de hastalıkta vasküler düz kas kasılma ve retinadaki kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılmıştır. Malzeme tablosunda gösterildiği gibi, Hanks'or LCH içeren bir litrelik düşük kalsiyum çözeltisi hazırlayın.

Doku toplanmadan önce izolasyon ekipmanını monte edin. Cam Pasteur pipetinin pürüzsüz hale getirilmesi için ateşle parlatılması gerekir, ancak ucu daraltmamalıdır. Plastik bir pipeti yaklaşık beş ila yedi milimetre açıklığa kadar kesin.

Gözleri LCH çözeltisine batırılmış diseksiyon kabına yerleştirin. Orbital kas eklerini veya optik siniri tutarak gözü tabağa sabitlemek için bir set forseps kullanın. Gözü stabilize etmek için ankraj noktasının skleraya mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.

Bıçağı kullanarak, ora serrata boyunca korneayı kesin ve forseps ile skleraya hafifçe bastırarak lensi çıkarın. Bu görüntüde gözün arkasında gördüğümüz küçük, dairesel bölge optik sinirdir. Bıçağı kullanarak, vizör lastiğini optik diskten simetrik olarak ikiye bölün.

Kapalı forseps kullanarak, optik diskte kalan ekleri çıkarmaya dikkat ederek, vizör lastiğinin iki yarısındaki retinaları nazikçe fırçalayın. İşlemi ikinci gözle tekrarlayın ve diseke retinaları plastik pipet ve küçük bir damla LCH ortamı kullanarak test tüpüne aktarın. Plastik pipeti kullanarak, test tüpünü LCH ile yaklaşık beş mililitreye kadar doldurun ve retinaların tüpün dibine yerleşmesine izin verin.

Tüpten yaklaşık dört mililitre çözelti çıkararak ve plastik pipet kullanarak taze LCH ekleyerek dokuyu yaklaşık üç kez yıkayın. Gerektiğinde, yabancı doku çıkarılmalıdır. Dokunun pipete yapışmasını önlemek için cam Pasteur pipetinin içini cilalı uçlu LCH ile yıkayın.

Aynı pipeti kullanarak, test tüpünden yaklaşık dört mililitre çözelti çıkarın ve yaklaşık iki mililitre taze LCH ekleyin. Dokuyu cam pipetin ucundan yavaşça çekerek retinaları nazikçe ayırın ve içeriği test tüpüne boşaltın. Bu aşamada baloncuklar sokmamaya çalışın ve retinalar yaklaşık iki ila üç milimetre kare boyutuna kadar parçalanana kadar işlemi tekrarlayın.

Pipetin içini yaklaşık iki mililitre LCH ile yıkayın ve bunu test tüpüne boşaltın. İçeriğin beş ila 10 dakika içinde dibe çökmesine izin verin. Doku parçaları yaklaşık bir milimetre kare büyüklüğünde olana kadar öğütme işlemini daha önce tarif edildiği gibi biraz daha kuvvetle tekrarlayın.

Dokunun oturmasına izin verin ve içerik tamamen homojen hale gelene ve hiçbir retina parçası kalmayana kadar bir kez daha kuvvetle tekrarlayın. Bu aşamadaki çözelti görünüşte sütlü görünmelidir. Bu teknik, izolasyon başına 200 ila 2.500 mikrometre uzunluğunda sekiz arteriyol segmenti verecektir.

Arteriolün bir ucunun karşı ucun oklüzyonu ile kanülasyonu, miyojenik yanıt olarak da bilinen basınca bağlı vazokonstriksiyonun ölçülmesine izin verir. Arterioler basınç miyografisi şu şekilde yapılır. Bir retinal homojenat alikutu, ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş bir fizyolojik kayıt odasına aktarılır.

Homojenatı en az beş dakika haznenin dibinde dinlenmeye bırakın. Uzunluğu 200 mikrometreden büyük ve damarın kanüle edilebileceği açık bir uca sahip arteriolleri belirlemek için kayıt odası boyunca görsel olarak tarayın. İnce forseps ve geminin üzerine yerleştirilmiş küçük bir tungsten tel kayma kullanarak geminin bir ucunu sabitleyin.

Tungsten telin üst üste binen uçlarını kullanarak, açık uç basınçlandırma kanülü ile aynı hizada olacak şekilde kabı banyo boyunca yatay olarak hareket edecek şekilde manevra yapın. Hazneyi sıfır kalsiyum ile perfüze edin Hanks'at 37 santigrat derece. Kanülasyonlar cam pipetlerle yapılır.

Kanül, ince bir mikromanipülatör kullanılarak damarın açık ucuna yerleştirilir. Uç, mikroskop üzerindeki odak düzleminin ayarlanmasıyla değerlendirildiği gibi, hem kabın ucu hem de kanül ucu aynı anda odakta olacak ve basınçlandırma kanülü damar açıklığına ilerleyecek şekilde açıklığın hemen yanına yerleştirilir. Kanülasyon işlemine yardımcı olmak için bir yardımcı pipet gereklidir ve kanül damar lümenine ilerletilirken aynı anda arteriyolu nazikçe dizginlemek ve arteriolar duvarı basınçlandırma kanülü üzerinde yönlendirmek için kullanılır.

Bu prosedür, yüksek bir başarı oranı elde etmek için her iki manipülatörün eşzamanlı, kontrollü hareketini ve kapsamlı uygulamayı gerektirir. Sıfır milimetre cıvada bir dakikalık kayıttan sonra, intraluminal basınç 40 milimetre cıvaya yükseltilir ve damar hızla genişlemelidir, bu da başarılı kanülasyonu doğrular. Basınca bağlı vazokonstriksiyon, yani miyojenik yanıt, daha sonra yaklaşık 15 dakikalık bir süre içinde gelişecektir.

Retinal vasküler düz kas hücrelerinden yapılan yama klemp kaydı, hücre içi kalsiyumu ve dolayısıyla hücresel kontraktiliteyi düzenleyen plazma membranı iyonik akımlarının araştırılmasını sağlar. Tam hücre ve tek kanallı kayıt, aşağıdaki gibi ana arteriyollerine gömülü olan bireysel düz kas hücrelerinden mümkündür. Retinal arteriyoller izole edilir ve tungsten tel kaymaları ile kayıt odasına sabitlenir.

Yama pipeti ile arteriolar düz kas hücre zarı arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için bazal laminanın sindirilmesi gerekir. Arteriyoller, 37 santigrat derecede sıralı bir dizi enzim çözeltisi ile süper kaynaştırılır, bu da görüntüdeki oklarla gösterildiği gibi bitişik hücrelerin elektriksel olarak ayrılmasına neden olur. Sindirim seviyesi ilk olarak kollajenaz basamağı sırasında endotel ve düz kas tabakalarının görsel olarak ayrılması ile değerlendirilir.

Kalan bazal lamina ve / veya periferik nöropil ipliklerinin çıkarılması, ince forsepslerin kapalı uçlarının damarın yüzeyi boyunca dikkatlice süpürülmesiyle sağlanır. Yama klempleme için, yama pipetinin ucu, ilgilenilen hücrenin üzerine dikey olarak yerleştirilir ve arteriolar düz kas zarı ile temas etmek için mikromanipülatörün ince, yavaş hareketi kullanılarak kademeli olarak indirilir. Bu, hücre hareketi ve pipet direncindeki bir değişiklik ile değerlendirilir ve edinim yazılımında bir hücre sızdırmazlığı test protokolü kullanılarak ölçülür.

Pipet hücrenin üzerine indirildiğinde, sızdırmazlık direnci yaklaşık beş kat artacaktır. Pipetin arkasına geçici olarak negatif basınç uygulanır ve yavaş yavaş bir gigaseal oluşturulur. Bu, bir ila beş dakika boyunca tekrarlanan negatif basınç uygulamalarını gerektirir.

Tüm hücre kaydı için, delikli yama-kelepçe yöntemi ağırlıklı olarak kullanılır. Daha önce tarif edildiği gibi, hücre içi benzeri çözelti ve amfoterisin B içeren bir pipet ile bir gigaseal oluşturulur. Erişim direnci, edinim yazılımındaki membran test protokolü kullanılarak izlenir. Erişim direnci 15 megaohm'un altına düştüğünde, seri direnç kompanzasyonu gerçekleştirilir.

Tipik olarak, delikli yama modunda seri direnci yaklaşık% 75 oranında telafi etmek mümkündür. Voltaj adımları veya rampa protokolleri daha sonra tüm hücre akımlarını ölçmek için kullanılabilir. Retinanın ayrışmasını takiben, birincil, ikincil ve ön kılcal arteriyoller, kalibrelerine ve vasküler düz kas hücrelerinin düzenine göre tanımlanabilir.

Birinci ve ikinci dereceden arteriyoller, parlak alan mikroskobu altında görsel olarak benzer görünür, ancak boyutlarına göre ayırt edilebilir. Pre-kılcal arteriyoller, hazırlıktaki en küçük arteriyel damarlardır ve vasküler düz kas hücrelerinin aralıklı düzenlenmesi nedeniyle kolayca tanınabilir. İzole edilen arteriyoller, izolasyon içindeki kılcal damarlardan ve venüllerden net bir şekilde ayırt edilebilir.

Kılcal damarlar, yaklaşık dört ila 10 mikrometre çapında küçük kalibreli damarlardan oluşan bir ağ örgüsü olarak belirgindir, venüller ise ince duvarlıdır ve düz kas hücresi kapsama alanından yoksundur. Primer, sekonder ve pre-kapiller arteriyoller, basınç miyografisi, kalsiyum görüntüleme ve yama-klemp çalışmaları için uygundur. Basınçlı arterioller kullanarak, miyojenik yanıtın oluşumunda rol oynayan moleküler mekanizmaları araştırdık.

Bu görüntüdeki fotomikrograflar, bir basınç miyografisi deneyi sırasında çeşitli zaman noktalarında bir sıçan retinal arteriolünü göstermektedir. Aşağıdaki zaman rotası grafiği, deneyin tüm seyri boyunca kap çapındaki değişiklikleri göstermektedir. Basınçlandırmadan hemen sonra, damar genişler ve bunu 15 dakika sonra sabit bir durum seviyesine ulaşan aktif bir miyojenik daralma izler.

Deneyin sonunda sıfır kalsiyumlu Hanks çözeltisine wortmannin eklenmesi, normalizasyon amacıyla kabı pasif çapına genişletir. Bu slayt, membran gerilmesinden önce ve sonra bir retinal arteriol düz kas hücresinden tek kanallı bir yama klemp kaydının bir örneğini göstermektedir. Bu hücre üstü yama, yama pipetine negatif basınç uygulandığında aktivitesi artan, esneme ile aktive edilen iki TRPV2 kanalı içerir.

Burada açıklanan protokoller pratik gerektirir, ancak en az sorun giderme ile gerçekleştirilebilir olmalıdır. İzole arteriyollerin izolasyon ile aynı gün kullanılmasını tavsiye ederiz. Yöntem, sıçan retinal arteriyolleri için optimize edilmiştir, ancak fare retinalarında kullanılabilir.

Şimdi bu preparatı kapsamlı bir şekilde kullandık, ancak mümkün olduğunda, ex vivo retinal tam montajlar ve in vivo kan damarı çapı ve kan akışı ölçümleri kullanarak temel bulgularımızı doğrulamaya çalışıyoruz.