Optik Biyoalgılama
Optik biyosensörler, bir hedef molekülün bağlanmasını tespit etmek için ışığı kullanır. Bu sensörler, floresan gibi ölçülebilir bir sinyal üreten bir…
Optik biyosensörler, ışık kullanarak biyolojik bir hedefi veya ilgilenilen hedefleri tespit eden sensörlerdir. Bu cihazlar sağlık, ilaç, çevresel izleme, İç Güvenlik ve hatta savaş alanında uygulamalar bulmuştur. Optik biyosensörler genel olarak etiket tabanlı ve etiketsiz sensörler olarak ikiye ayrılır. Etiket tabanlı algılamanın bir örneği, amplifiye edilmiş hedef DNA'yı ölçmek için floresan etiketler veya floroforlar kullanan Polimeraz Zincir Reaksiyonu veya PCR'dir. Etiketsiz bir yönteme örnek olarak Yüzey Plazmon Rezonansı veya SPR verilebilir. Burada, sensör yüzeyi ile değiştirilmemiş biyomolekül etkileşimi, yansıma açısı gibi sensörün temel bir özelliği ölçülerek ölçülür. Bu video, hem bu tür optik biyoalgılama tekniklerinin hem de kritik bileşenlerinin temellerini, optik biyosensörlerin çalışma prensiplerini ve yaygın uygulamalarını gözden geçirmektedir.
İlk olarak, etiket tabanlı optik biyoalgılamanın genel ilkelerine bakalım. Tipik olarak, tamamlayıcı bir antikor gibi bir prob veya biyo-tanıma elemanı, geleneksel immobilizasyon kimyası kullanılarak sensör yüzeyine tutturulur. Numune çözeltisi daha sonra sensör yüzeyi üzerinden akıtılır. İmmobilize biyo-tanıma elemanına tamamlayıcı olan hedef molekül, karmaşık numune çözeltisinden seçici olarak yakalanır. Daha sonra fazla numune çözeltisi tampon veya su ile yıkanır. Daha sonra, bağlı hedef miktarını görselleştirmeye ve ölçmeye yardımcı olmak için, hedefe ek olan ve bir florofora bağlı ikincil bir molekül sistemden geçirilir. Bir süre sonra, ikincil molekülün hedefe bağlanması meydana geldiğinde, fazla bağlanmamış florofor yıkanır. Bağlı floroforun yoğunluğu daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak ölçülebilir. Bu yoğunluk ilk olarak, daha sonra bilinmeyen miktarda yakalanan hedefin doğrudan ölçülmesine izin veren bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için bilinen çeşitli hedef konsantrasyonları için çizilir. Bu nedenle, etiket tabanlı teknikler, ilgilenilen biyomolekülün konsantrasyonunu ölçmek için son derece hassas floroforların floresan yoğunluğunu kullanır.
Etiket tabanlı optik biyosensörlerin ilkelerini gözden geçirdiğimize göre, yaygın olarak kullanılan bir örneğe, DNA amplifikasyonu, Kantitatif PCR veya qPCR için mevcut standarda bir göz atalım. qPCR reaksiyon karışımı, gerçek zamanlı reaksiyon ölçümü için etiketli bir prob içerir. Prob dizisi hem floresan raportör hem de söndürücü moleküllerine bağlanır ve belirli bir DNA dizisine bağlanır. Söndürücü molekül, her ikisi de proba bağlıyken floroforun emisyonunu söndürür. PCR reaksiyonu sırasında, polimeraz enzimi prob DNA'sını bozar ve florofor raportörünü fiziksel olarak ayırır, böylece söndürmeyi önler ve floresansta bir artışa neden olur. qPCR gerçekleştirmek için, önce etiketli problar da dahil olmak üzere reaksiyonun tüm bileşenlerini bir PCR tüpüne veya kuyucuğuna ekleyin. Ardından, PCR kuyucuklarını özel bir termocycler'a yerleştirin ve her döngü için parametreleri ve döngü sayısını girin. qPCR için kullanılan termodöngüleyici, bir dalga boyu seçmek için gerekli optik bileşenlere sahip bir ışık kaynağı ve PCR reaksiyonu sırasında floresan yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak ölçmek için bir dedektör içerir. Her termal döngünün sonunda, salınan Floroforlardan kaynaklanan floresan yoğunluğu kaydedilir ve çizilir. Floresan yoğunluğu, reaksiyon kuyusundaki hedef konsantrasyonun logaritması ile doğru orantılıdır ve bu nedenle, bilinen bir floresan için bilinmeyen hedef konsantrasyon hesaplanabilir.
Şimdi, etiketsiz optik algılama tekniklerini kullanarak, floroforlar gibi herhangi bir raportör olmadan algılamanın nasıl sağlanabileceğine bakalım. Etiketsiz teknikler için, biyo-tanıma elemanının immobilizasyonu, etiket bazlı teknikle aynıdır. Bu sensörlerin yüzeyine bağlanan herhangi bir biyomolekül, optik cihazın hemen yakınındaki kırılma indeksini değiştirir. Hedef moleküller, işlevselleştirilmiş optik cihazın yüzeyine bağlanarak ince bir tabaka oluşturur ve kırılma indisini daha da değiştirir. Kırılma indisindeki bu değişiklikler, doğal titreşim frekansındaki veya sistemin rezonans frekansındaki değişiklik izlenerek izlenebilir. F kayması olarak adlandırılan hedef bağlanmadan önce ve sonra rezonans frekanslarındaki fark, yakalanan hedefin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Şimdi, yaygın olarak kullanılan etiketsiz bir optik algılama tekniği olan Yüzey Plazmon Rezonansı veya SPR'nin temel ilkelerine bir göz atalım. Tipik bir SPR cihazı, hareketli bir lazer kaynağını, yoğunluk kaymasını ölçmek için bir optik dedektörü ve bir tarafı altınla kaplanmış bir cam prizmaya sahip bir sensör çipini birleştirir. Altın kaplı prizma, bir akış işlemi sağlayan akışkan bir sistemle entegre edilmiştir. Bir deneyde, prob molekülü veya biyo-tanıma elemanı altın yüzeye tutturulur. Hedef eleman daha sonra yüzey üzerinde akar ve hareketsiz hale getirilmiş proba bağlanır. Algılama, SPR fenomenini kullanır. Bu, altın gibi metalin yüzeyinde belirli bir açıda, teta SPR'de polarize ışık gösterildiğinde meydana gelir. Bu, zıt işaretlerin geçirgenliklerine sahip iki malzemenin arayüzünde bulunan tutarlı elektron salınımları olan yüzey plazmonlarının üretilmesiyle sonuçlanır. Sensör yüzeyine bağlı kütle değiştiğinde, yüzey plazmonlarının rezonans durumu değişir. Sonuç olarak, yüzeye sadece biyo-tanıma elemanı bağlandığında, ışın tek bir açıyla, teta bir açıyla yansıtılır. Daha sonra, yakalanan hedef gibi yüzeye daha fazla kütle eklendiğinde, belirli açıda yansıyan ışığın yoğunluğunda bir azalma, yansıma açısı teta ikiye dönüştüğü için teta SPR gözlenir. Rezonans açısında yansıyan ışığın yoğunluğundaki değişim, teta SPR, daha sonra yansıyan ışığın açısının bir fonksiyonudur ve teta bir ve teta iki açılarındaki fark olarak ölçülebilir.
Artık optik biyosensörlerin arkasındaki ilkeleri ve prosedürü ele aldığımıza göre, araştırmacıların bugün bu teknikleri nasıl uyguladıklarını görelim. Akış hücresi sitometresi, hücreleri saymak ve çeşitli diğer hücresel özellikleri ve bileşenleri ölçmek için yaygın olarak kullanılan optik bir biyo-algılama sistemidir. Her biri benzersiz bir florofor ile etiketlenmiş çoklu hücre tiplerinden oluşan bir numune, bir süspansiyon içinde hazırlanır. Daha sonra numune, hücreler birer birer bir lazer ışınını geçecek şekilde akış sitometresinden geçirilir. Her hücre lazer ışınından geçerken, farklı floroforlar tarafından saçılan ve yayılan floresan ışığı ayrı ayrı ölçülür, bu da numunedeki çeşitli hücre tiplerinin doğrudan bir sayısını verir. Optik biyosensörlerin bir başka uygulaması, numunelerdeki bakterilerin tespit edilmesidir. Bunu yapmanın bir yolu, optik halka rezonatör sensörleri kullanmaktır. Işık giriş ve çıkış dalga kılavuzlarına bağlı kapalı bir döngüden oluşurlar. Giriş dalga kılavuzuna rezonans dalga boyunda ışık uygulandığında, döngüden geçirilir ve yapıcı girişim nedeniyle birden fazla gidiş dönüş boyunca bir yoğunluk oluşturur ve çıkış dalga kılavuzuna verilir. Bakteriyel yüzey proteinlerine özgü antikorlar, halka rezonatör yüzeyi üzerine immobilize edilir ve bir temel absorpsiyon spektrumu elde edilir. Daha sonra bakteri numunesi, hareketsiz hale getirilmiş gövdeye bakteri bağlanmasına izin vermek için rezonatör yüzeyine akar ve ardından ikinci bir absorpsiyon spektrumu elde edilir. İlgilenilen bakteri bağlanırsa, rezonans tepe noktalarında gözle görülür bir kayma gözlenir, bu da hedef bakterinin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Az önce JoVE'nin optik biyoalgılama ile ilgili videosunu izlediniz. Hem etiket tabanlı hem de etiketsiz optik algılamanın temel ilkelerini, bu yöntemlerin öne çıkan iki örneği ve tekniklerin bazı uygulamaları ile birlikte tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler.
Optik biyosensörler, ışık kullanarak biyolojik bir hedefi veya ilgilenilen hedefleri tespit eden sensörlerdir. Bu cihazlar sağlık, ilaç, çevresel izleme, İç Güvenlik ve hatta savaş alanında uygulamalar bulmuştur. Optik biyosensörler genel olarak etiket tabanlı ve etiketsiz sensörler olarak ikiye ayrılır. Etiket tabanlı algılamanın bir örneği, amplifiye edilmiş hedef DNA'yı ölçmek için floresan etiketler veya floroforlar kullanan Polimeraz Zincir Reaksiyonu veya PCR'dir. Etiketsiz bir yönteme örnek olarak Yüzey Plazmon Rezonansı veya SPR verilebilir. Burada, sensör yüzeyi ile değiştirilmemiş biyomolekül etkileşimi, yansıma açısı gibi sensörün temel bir özelliği ölçülerek ölçülür. Bu video, hem bu tür optik biyoalgılama tekniklerinin hem de kritik bileşenlerinin temellerini, optik biyosensörlerin çalışma prensiplerini ve yaygın uygulamalarını gözden geçirmektedir.
İlk olarak, etiket tabanlı optik biyoalgılamanın genel ilkelerine bakalım. Tipik olarak, tamamlayıcı bir antikor gibi bir prob veya biyo-tanıma elemanı, geleneksel immobilizasyon kimyası kullanılarak sensör yüzeyine tutturulur. Numune çözeltisi daha sonra sensör yüzeyi üzerinden akıtılır. İmmobilize biyo-tanıma elemanına tamamlayıcı olan hedef molekül, karmaşık numune çözeltisinden seçici olarak yakalanır. Daha sonra fazla numune çözeltisi tampon veya su ile yıkanır. Daha sonra, bağlı hedef miktarını görselleştirmeye ve ölçmeye yardımcı olmak için, hedefe ek olan ve bir florofora bağlı ikincil bir molekül sistemden geçirilir. Bir süre sonra, ikincil molekülün hedefe bağlanması meydana geldiğinde, fazla bağlanmamış florofor yıkanır. Bağlı floroforun yoğunluğu daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak ölçülebilir. Bu yoğunluk ilk olarak, daha sonra bilinmeyen miktarda yakalanan hedefin doğrudan ölçülmesine izin veren bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için bilinen çeşitli hedef konsantrasyonları için çizilir. Bu nedenle, etiket tabanlı teknikler, ilgilenilen biyomolekülün konsantrasyonunu ölçmek için son derece hassas floroforların floresan yoğunluğunu kullanır.
Etiket tabanlı optik biyosensörlerin ilkelerini gözden geçirdiğimize göre, yaygın olarak kullanılan bir örneğe, DNA amplifikasyonu, Kantitatif PCR veya qPCR için mevcut standarda bir göz atalım. qPCR reaksiyon karışımı, gerçek zamanlı reaksiyon ölçümü için etiketli bir prob içerir. Prob dizisi hem floresan raportör hem de söndürücü moleküllerine bağlanır ve belirli bir DNA dizisine bağlanır. Söndürücü molekül, her ikisi de proba bağlıyken floroforun emisyonunu söndürür. PCR reaksiyonu sırasında, polimeraz enzimi prob DNA'sını bozar ve florofor raportörünü fiziksel olarak ayırır, böylece söndürmeyi önler ve floresansta bir artışa neden olur. qPCR gerçekleştirmek için, önce etiketli problar da dahil olmak üzere reaksiyonun tüm bileşenlerini bir PCR tüpüne veya kuyucuğuna ekleyin. Ardından, PCR kuyucuklarını özel bir termocycler'a yerleştirin ve her döngü için parametreleri ve döngü sayısını girin. qPCR için kullanılan termodöngüleyici, bir dalga boyu seçmek için gerekli optik bileşenlere sahip bir ışık kaynağı ve PCR reaksiyonu sırasında floresan yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak ölçmek için bir dedektör içerir. Her termal döngünün sonunda, salınan Floroforlardan kaynaklanan floresan yoğunluğu kaydedilir ve çizilir. Floresan yoğunluğu, reaksiyon kuyusundaki hedef konsantrasyonun logaritması ile doğru orantılıdır ve bu nedenle, bilinen bir floresan için bilinmeyen hedef konsantrasyon hesaplanabilir.
Şimdi, etiketsiz optik algılama tekniklerini kullanarak, floroforlar gibi herhangi bir raportör olmadan algılamanın nasıl sağlanabileceğine bakalım. Etiketsiz teknikler için, biyo-tanıma elemanının immobilizasyonu, etiket bazlı teknikle aynıdır. Bu sensörlerin yüzeyine bağlanan herhangi bir biyomolekül, optik cihazın hemen yakınındaki kırılma indeksini değiştirir. Hedef moleküller, işlevselleştirilmiş optik cihazın yüzeyine bağlanarak ince bir tabaka oluşturur ve kırılma indisini daha da değiştirir. Kırılma indisindeki bu değişiklikler, doğal titreşim frekansındaki veya sistemin rezonans frekansındaki değişiklik izlenerek izlenebilir. F kayması olarak adlandırılan hedef bağlanmadan önce ve sonra rezonans frekanslarındaki fark, yakalanan hedefin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Şimdi, yaygın olarak kullanılan etiketsiz bir optik algılama tekniği olan Yüzey Plazmon Rezonansı veya SPR'nin temel ilkelerine bir göz atalım. Tipik bir SPR cihazı, hareketli bir lazer kaynağını, yoğunluk kaymasını ölçmek için bir optik dedektörü ve bir tarafı altınla kaplanmış bir cam prizmaya sahip bir sensör çipini birleştirir. Altın kaplı prizma, bir akış işlemi sağlayan akışkan bir sistemle entegre edilmiştir. Bir deneyde, prob molekülü veya biyo-tanıma elemanı altın yüzeye tutturulur. Hedef eleman daha sonra yüzey üzerinde akar ve hareketsiz hale getirilmiş proba bağlanır. Algılama, SPR fenomenini kullanır. Bu, altın gibi metalin yüzeyinde belirli bir açıda, teta SPR'de polarize ışık gösterildiğinde meydana gelir. Bu, zıt işaretlerin geçirgenliklerine sahip iki malzemenin arayüzünde bulunan tutarlı elektron salınımları olan yüzey plazmonlarının üretilmesiyle sonuçlanır. Sensör yüzeyine bağlı kütle değiştiğinde, yüzey plazmonlarının rezonans durumu değişir. Sonuç olarak, yüzeye sadece biyo-tanıma elemanı bağlandığında, ışın tek bir açıyla, teta bir açıyla yansıtılır. Daha sonra, yakalanan hedef gibi yüzeye daha fazla kütle eklendiğinde, belirli açıda yansıyan ışığın yoğunluğunda bir azalma, yansıma açısı teta ikiye dönüştüğü için teta SPR gözlenir. Rezonans açısında yansıyan ışığın yoğunluğundaki değişim, teta SPR, daha sonra yansıyan ışığın açısının bir fonksiyonudur ve teta bir ve teta iki açılarındaki fark olarak ölçülebilir.
Artık optik biyosensörlerin arkasındaki ilkeleri ve prosedürü ele aldığımıza göre, araştırmacıların bugün bu teknikleri nasıl uyguladıklarını görelim. Akış hücresi sitometresi, hücreleri saymak ve çeşitli diğer hücresel özellikleri ve bileşenleri ölçmek için yaygın olarak kullanılan optik bir biyo-algılama sistemidir. Her biri benzersiz bir florofor ile etiketlenmiş çoklu hücre tiplerinden oluşan bir numune, bir süspansiyon içinde hazırlanır. Daha sonra numune, hücreler birer birer bir lazer ışınını geçecek şekilde akış sitometresinden geçirilir. Her hücre lazer ışınından geçerken, farklı floroforlar tarafından saçılan ve yayılan floresan ışığı ayrı ayrı ölçülür, bu da numunedeki çeşitli hücre tiplerinin doğrudan bir sayısını verir. Optik biyosensörlerin bir başka uygulaması, numunelerdeki bakterilerin tespit edilmesidir. Bunu yapmanın bir yolu, optik halka rezonatör sensörleri kullanmaktır. Işık giriş ve çıkış dalga kılavuzlarına bağlı kapalı bir döngüden oluşurlar. Giriş dalga kılavuzuna rezonans dalga boyunda ışık uygulandığında, döngüden geçirilir ve yapıcı girişim nedeniyle birden fazla gidiş dönüş boyunca bir yoğunluk oluşturur ve çıkış dalga kılavuzuna verilir. Bakteriyel yüzey proteinlerine özgü antikorlar, halka rezonatör yüzeyi üzerine immobilize edilir ve bir temel absorpsiyon spektrumu elde edilir. Daha sonra bakteri numunesi, hareketsiz hale getirilmiş gövdeye bakteri bağlanmasına izin vermek için rezonatör yüzeyine akar ve ardından ikinci bir absorpsiyon spektrumu elde edilir. İlgilenilen bakteri bağlanırsa, rezonans tepe noktalarında gözle görülür bir kayma gözlenir, bu da hedef bakterinin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Az önce JoVE'nin optik biyoalgılama ile ilgili videosunu izlediniz. Hem etiket tabanlı hem de etiketsiz optik algılamanın temel ilkelerini, bu yöntemlerin öne çıkan iki örneği ve tekniklerin bazı uygulamaları ile birlikte tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.