Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Bu yöntem, drosophila melanogaster gibi bir hayvanın tercih ettiği çevre sıcaklığını seçme mekanizması olan somatosensasyon alanındaki önemli bir soruyu ele almak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sürekli bir sıcaklık aralığı ile karşı karşıya kaldığında larva grubunun tercih edilen sıcaklığını tek bir tahlilde belirleyebilmesidir. Drosophila larvalarının sıcaklık tercihleri hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, impress plakası solucan, C elegans gibi diğer model organizmalarla kullanım için de uyarlanabilir.

İlk olarak, bir haç için şişeler hazırlamak için maya macunu yapın. Maya granüllerini damıtılmış suda karıştırın ve bir havaneli ile bir macun haline getirin. Ardından, gıda yüzeyinin hemen üzerindeki standart drosophila şişelerinin iç duvarlarına yakın bir miktar maya ezmesi ekleyin.

Larvaları üretmek için 12 ila 35 dişi ve yarısına kadar erkek toplayın, ancak 10'dan fazla erkek toplayın. Bu grupları maya macunu içeren şişede birleştirin. Hazırlanan şişeleri 100 şişelik bir tepsiye yükleyin.

Nem sağlamak için tepsiye su dolu 20 açık şişe ekleyin. Ardından tepsiyi şeffaf bir plastik torbaya koyun ve 25 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. 48 saatlik beslenme ve çiftleşmeden sonra, yumurtaları toplamak için sinekleri yeni yiyecek şişelerine aktarın.

Üzerlerine dokunun. Karbondioksit kullanmayın. Ardından, sineklerin 25 santigrat derecede üç saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.

Daha sonra yetişkinleri çıkarın ve yumurtaları içeren şişeleri tekrar su şişelerinin bulunduğu tepsiye yerleştirin ve torbayı kapatın. Ardından, yumurtaları 25 santigrat derecede istenen larva aşamasına kadar geliştirin. Tek yönlü bir gradyan hazırlamak için, önce tahlil için bir insan ortam ortamı oluşturun.

Ayrı su banyolarına bağlı iki alüminyum bloğu 10 santimetre aralıklarla ıslak kağıt havluların üzerine yerleştirin. Su banyolarının önceden ısıtılması gerekir. Daha sonra, 100 mililitre% 1 agaroz yapın ve düz bir yüzeyde her bir tahlil plakasına 25 mililitre ekleyin.

Agaroz katılaştıktan sonra, yüzeyi biraz kaba hale getirmek için yüzeyi bir melamin süngerle hafifçe ovalayın. Ardından, verimli sıcaklık transferini teşvik etmek için, tahlil plakalarındaki alüminyum bloklar arasındaki boşlukları bir sprey şişesinden verilen suyla doldurun. Şimdi, tahlil plakalarını alüminyum blokların üzerine yerleştirin ve alüminyum blokların kenarlarıyla tam olarak eşleşmesi için sınırların her iki kenardan iki santimetre uzakta olduğundan emin olun.

Ardından, jellerin kurumaması için plakaların yüzeyine bir film su püskürtün. Ardından, buharlaşmayı azaltmak ve jel yüzeyinin sıcaklığını stabilize etmeye yardımcı olmak için sistemi bir karton kutu ile örtün. Sıcaklığın dengelenmesi için beş ila 10 dakika bekleyin.

Ardından, baştan sona eşit bir sıcaklık olduğundan emin olmak için plaka üzerindeki yüzey sıcaklığını en az 12 yerde kontrol edin, iki santigrat derece verin veya alın. Ardından, tahlil yapılana kadar kutu kapağını değiştirin. Temiz larvaları izole etmek için önce 50 mililitrelik bir test tüpüne yaklaşık 40 mililitre% 18 sükroz çözeltisi ekleyin.

Daha sonra larvaları yiyecek yığınlarından bir kepçe kullanarak çözeltiye aktarın. Daha sonra, larvaları kepçe kullanarak çözeltinin etrafında iyice karıştırın. Şimdi, larvaların tüpün üst tabakasına yüzmesi için 30 ila 60 saniye bekleyin.

Daha sonra larvalarla birlikte çözeltiyi 50 mililitrelik başka bir tüpe dökün ve taze% 18 sükroz ile doldurun. Yine larvaların yüzmesini bekleyin. Yiyeceklerin varlığı sonuçları etkileyebilir.

Bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, gıda ile kontaminasyonu en aza indirmek için larvaları iyice temizlemek önemlidir. Larvalara zarar vermemek için nazikçe yapın. Daha sonra, 50 mililitrelik bir tüpün üzerine 300 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin, ardından sakaroz çözeltisinin yüzeyindeki ölü yetişkin cesetlerini ve yüzen kalıntıları temizleyin.

Şimdi, larvaları süzgeçten geçirerek süzgeçten geçirin ve onları örgü elek üzerinde toplayın. Ardından, larvaları daha fazla temizlemek için süzgeçten iki kez yaklaşık 50 mililitre su akıtın. Daha sonra, 35 milimetrelik boş bir tabağa, larvaların çoğunu süzgeçten su kullanarak durulayın.

Kalan larvaları ağ üzerinde aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Ardından, bir mikro pipet kullanarak tabaktaki suyun çoğunu sifonlayın. Daha sonra kapağı tabağın üzerine baş aşağı yerleştirin, böylece larvalar kaçamaz.

Şimdi, testi başlatmadan önce larvaların 10 ila 20 dakika iyileşmesine izin verin. İlk olarak, jelin üzerindeki karton kutuyu çıkarın ve jel yüzey sıcaklığını hızlı bir şekilde kontrol edin. Yüzey kuruysa, yüzeye az miktarda su püskürtün.

Jel iyiyse, küçük bir boya fırçası kullanarak her plakanın ortasına 100 ila 200 larva yükleyin. Ardından, larvaları yakalamak için her bir tahlil plakasının üzerine bir kapak yerleştirin ve ışığa maruz kalmayı önlemek için kurulumu bir karton kutu ile örtün. Tahlil şu anda devam ediyor.

10 ila 30 dakika sonra karton kutuyu ve mikroplaka kapağını çıkarın. Ardından, larvaların konumunu kaydetmek için plakaları yukarıdan fotoğraflayın. Jelin yüzeyinde yansımayı önlemek için kutuyu kameranın üzerine yerleştirin.

Plakayı temizlemek için, dağılmış olabilecekleri her yerde tüm larvaları aspire edin. Şimdi, görüntü analiz yazılımı kullanarak her bölgedeki larvaların yüzde dağılımını hesaplayın. Tahlil plakasındaki sınırlara göre her iki santimetrede bir çizgiler yapın ve her bölgedeki larva sayısını sayın.

Sayarken, her kenardan 0,5 santimetre uzaklıktaki sırtlara dağılmış larvaları göz ardı edin, çünkü jel kalınlığı ve sıcaklık koşulları kenara yakın yerlerde eşit değildir. 18 santigrat derece ila 28 santigrat derece arasında, 16.8 santigrat derece ve 31 santigrat dereceye ayarlanmış su banyoları kullanılarak tek yönlü gradyan yapıldı. Gradyan boyunca sıcaklık dağılımının neredeyse doğrusal olduğu bulundu.

Kontrol larvaları çeşitli yaşlarda test edildi. Birinci, ikinci ve erken-üçüncü instar larvaları 24 santigrat derece bölgesi için en yüksek tercihleri gösterdi. Üçüncü yılın ortalarında, larvaların çoğu 18 santigrat derece bölgesinde birikmiştir.

Dolaşmayan geç üçüncü instar larvaları, 18 santigrat derece bölgesinde sıkı bir şekilde kümelenmiştir. Beyaz 1118 olan kontrol suşunda 18 santigrat derece bölgesinde birikme eğilimi, bir kenar etkisinden kaynaklanmadı, çünkü geç üçüncü instar larvaları hala çift yönlü bir gradyan kullanarak 18 derece Santigrat bölgesinde birikti. Sıcaklığı ayırt etmek için gerekli olan üçüncü instar larvalarının barındırdığı mutasyonları analiz ettiğimizde, sonuçlar değişti.

trpA1'de boş mutasyona sahip larvalar, 18 santigrat derece ila 28 santigrat derece gradyasının tamamına eşit olarak dağıtılır. Sadece A ve B izoformlarını veya trpA1'in C ve D izoformlarını eksik olan larvalar da ciddi bozulmalar göstermiştir. Fosfolipaz c beta, norpA'yı kodlayan iki genden birinde mutasyona sahip larvalar da bozulmuştur.

Bununla birlikte, diğer fosfolipaz c beta, plc21c'yi kodlayan bir gende mutasyona sahip larvalar normal davrandı. Bu videoyu izledikten sonra, yabani tip ve mutant drosophila larvalarının sıcaklık tercihlerini karşılaştırmanıza olanak tanıyan sürekli bir termal gradyan kullanarak tekrarlanabilir sonuçların nasıl elde edileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik tek bir tahlil için 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, sinek şişelerinin durumuna dikkat etmek ve larvaları kurumuşsa kullanmamak önemlidir. Bu teknik, drosophila larvalarının rahat aralıkta en sevdikleri sıcaklığı seçmek için ihtiyaç duyduğu yeni genlerin keşfini basitleştirir.