Name: Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Keşfedin, protein kompleksleri ve ligand bağlanmasını analiz etmek için yerel kütle spektrometrisi kullanımını. Bu yöntem, biyomoleküler karakterizasyon ve kompleks stabilitesi hakkında detaylı bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Karl-Peter Hopfner ve Robert Thomas Byrne ve deneysel tasarım onların yardımıyla nazikçe sağlayan HerA ve HerA-NurA protein örnekleri için teşekkür etmek istiyorum. Biz ayrıca el yazması yaptığı inceleme için Dr Eamonn okuma teşekkür ederiz. Finansman vücudumuzun minnetle anıyoruz: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] ve Royal Society [A.P. için RG150216].

1. Protein ve Protein-Ligand kompleksleri için yerel MS numune hazırlama
Not: bir protein kompleksi moleküler temeli bir anlayış ve ligand taşıması yerel MS kullanarak elde etmek için uygun numune hazırlama anahtarıdır. Bu bölümde temel örnek hazırlık adımları DNA ve nükleotid örnek olarak bağlayan HerA-NurA karmaşık kullanarak MS analiz önce vurgulamak için amaçtır.
<ol><li>20 µL aliquots konsantre saf protein (genellikle 15-30 µM) bir 1,5 mL Tüp hazırlayın.</li>
	<li>
ATP veya ADP bağlama analizi için Not: artan konsantrasyonları hydrolyzable ATP analog Adenozin 5 '-Oeklemek-(3-thiotriphosphate), tetralithium tuz (ATP-γ-S) veya Adenozin 5 '-nükleotittir (ADP). Sigara hydrolyzable ATP türevleri yakalanması ATP bağlı protein sağlayacak istikrarlı bir karmaşık oluşturur. Test olabilir diğer hydrolysable ATP analogları AMP PNP ve ATP-γ-S-Mg2 +içerir.<ol>
<li>HerA-NurA çalışmaları için 0-1 arasında konsantrasyonlarda ATP-γ-S ve ADP ile 5 mikron saf protein karışımı mM.</li>
		<li>Eşzamanlı ATP-γ-S ve ADP bağlama yakalamak için aynı veya farklı konsantrasyonları her iki nükleotid ekleyin.</li>
		<li>2 mM MgCl2 ekleyin ve kuru banyo kuluçka 1 h için 25 ° C'de kuluçkaya. Not: Yerel MS yüksek konsantrasyonlarda artefactual bağlama sonuçlanabilir nESI kullanarak nükleotit bağlama analizi, bu nedenle non-spesifik bağlama hesap29alınmalıdır. Non-spesifik bağlama araştırmak için nükleotit 2-5 mM arasında daha yüksek bir konsantrasyon ekleyin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA bağlama analizi için
	<ol>
<li>Protein-DNA karmaşık oluşumu için izin veren molar oranında protein ve DNA karıştırın. HerA ve HerA-tolga 5 mikron saf protein DNA ile 1:1 oranında karıştırın.</li>
		<li>HerA-NurA veya HerA - DNA karışımı bir kuru banyo kuluçka denge ulaşıncaya kadar 25 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Süre ve kuluçka sıcaklığını protein soruşturma altında bağlı olarak değişebilir.</li>
		<li>MS uyumlu arabellek arabellek Satım protein örnekleri. Yaygın olarak, sulu amonyum asetat çözüm pH 7-8 5 mM-1 M arasında kullanılır. Diğer MS uyumlu arabellek ethylenediammonium diacetate (EDDA) ve Triethylammonium asetat (TEAA)30içerir. HerA-NurA çalışmaları için 200 mM amonyum asetat pH 7 kullanın. Not: Orada bir spin yoğunlaştırıcı veya Kromatografi sütunları kullanarak gibi arabellek değişimi önce MS göre analiz için birkaç yöntem vardır. Yerel MS çoğunlukla arabelleğe alır ve adducts gibi arıtma sırasında kullanılan örnek kalitesi ile sınırlıdır. Bu nedenle, çözümlenmiş doruklarına elde etmek için yeterli desalting gerçekleştirmek için esastır.</li>
		<li>HerA-NurA ligand bağlayıcı çalışmaları için exchange örnekleri yoğunlaştırıcı kullanarak 200 mM amonyum asetat 6 - 8 kez tampon. Bu yöntem daha zaman alıcı olsa da, bu tepeler elde çözüldü sağlar ve ATP/ADP ilişkili tür doğru kitle belirlenmesi için sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yerel MS toplama ve Analizi araştırma Protein kompleksleri ve Protein-Ligand kompleksleri için
Not: MS koşulları doğru kitle ölçümler etkinleştirmek için son derece çözümlenmiş doruklarına ulaşmak için optimize edilmelidir. Bu bölüm ayrıntıları bir Q-ToF kütle spektrometre ile 32 k üst sınırı m/z quadrupole parametreleri en iyi duruma getirilmiş.
<ol><li>Kurum içi kılcal nano-electrospray için hazırlamak ve araç kitle kalibrasyon doğru kitle ölçümler Kirshenbaum vd tarafından detaylı olarak gerçekleştirmek 1.</li>
	<li>Duyarlılık, pozitif iyon edinme ve hareketlilik TOF modları seçin.</li>
	<li>Tuzak, API ve IMS gazlar üzerinde açın. IM ayırma, azot (60 mL/dak) ve argon (8.4 mL/dk'ya tuzak bölge) başlangıç noktası olarak kullanın ve sonra ayarlayın.</li>
	<li>Bir uygun m/z edinme aralığı ayarlayın. Bilinmeyen bir protein için 500-32,000 m gibi geniş bir ilk optimizasyonu adımları kullanmanız gerekir/z.</li>
	<li>2-3 µL bir altın kaplamalı kılcal damar çözümlenmesi ve kapiller tutucusuna eklemek için protein kompleksi çözüm yükleyin.</li>
	<li>Yavaşça kılcal sıkın ve kılcal electrospray kaynak aşamasında yer ve sahne alanı veri edinme başlatmak için pozisyon içine kaydırın.</li>
	<li>Düşük nano-akış gaz basınç uygulayın (0,00 0,05 Bar) kadar bir damla kılcal ucunda oluşur. Sprey korunur kadar nano-akış basıncı sonra kesilmesine.</li>
	<li>X, y kılcal hareket ettirerek kılcal koni ile ilgili olarak ayarlamak, z konumlandırır ve istikrarlı Ion geçerli elde etmek için mevcut iyon izlemek. 0,9-1.6 aralığında kılcal bir gerilim uygulamak kV.</li>
	<li>Örnekleme koni (50-120 V), kaynak Ofset (60.0), kaynak sıcaklığı (25 ° C) ve koni gaz akışı (0.0 L/h) ayarlayın. Bunlar başlangıç koşullarını ayarlanabilir önerdi.</li>
	<li>Bir de çözümlenmiş kitle spektrum elde etmek için ve iyon iletim en üst düzeye çıkarmak için MS parametrelerini ayarlamak ve spectra elde edilen değişikliği izlemek. Bu tuzak (2-8 mL/dk), o hücre (180 mL/dak) ve IMS hücre (90 mL/dk), en fazla iletim en iyi ayrılık ulaşmak için gaz akışını ayarlama içerir.</li>
	<li>Eğer gerilim uzaklıklar yetersiz tuzak çarpışma enerjileri ayarlayın. En iyi bir başlangıç noktası arasında 10-50 suyudur. Not: tuzak enerji artan Kaldır Sigara kovalent bağlı adducts. Ancak, indüklenen çarpışma ayrılma ve protein-ligand kompleksinin unfolding önlemek için dikkat ediniz. Enstrüman koşullar yerel katlanmış durumda (adım 3) protein korumak Eğer kontrol etmek için iyon hareketlilik ölçümleri gerçekleştirmek.</li>
	<li>Desolvation tuzak önyargı voltaj optimize ederek geliştirmek. En iyi bir başlangıç noktası 20-45 suyudur.</li>
	<li>Dalga hızı ve dalga yüksekliği en iyi hareket eden ayrılık elde etmek için en iyi duruma getirme. Burada ayrıntılı bir açıklama ve protokol31bulunabilir. HerA-NurA çalışmaları için dalga hızı (m/s) 40 ve dalga yüksekliği 550-650 (V) kullanın.</li>
	<li>Diğer tüm parametreleri enstrüman varsayılan değerler olarak kullanın.</li>
	<li>Ligand serbest örnek bir denetim her çalıştırmak (Şekil 1) olarak analiz için hazırlayın. Ligand bağlayıcı deneyler için en az üç bağımsız ölçümleri gerçekleştirmek.</li>
	<li>Masslynx yazılım oluşturulan tür kitlelerin ölçmek ve ligand taşıması, ATP ve ADP bağlama ve oligomeric Birleşik (Şekil 2 ve 3) gibi tanımlamak için kullanın. Diğer bilgisayar yazılımı elde edilebilir UniDec32, PULSAR33 ve Amphitrite34içerir.</li>
	<li>Tür göreli bolluk ölçmek için (örneğin ligand bağlı, farklı reaksiyonlar, vb.) ham ESI-MS spectra içinde gözlenen karşılık gelen iyon yoğunluklarda kullanın. Alternatif olarak, UniDec ve Massign35 (resim 1 ve 3 ) gibi özelleştirilmiş yazılım kullanılarak miktar gerçekleştirin.</li>
</ol>3. edinmek ve IM-MS analiz
Not: Sohbet-MS iyonları onların boyutu (kütle), şekil ve fiyat istemek dayalı gaz aşamasında ayırır. M/z spektrumunda çözüldü her bir drift zaman dağılımıyla ilgili bir özelliktir. IM-MS çarpışma kesit (CCS) hesaplamak için kullanılan bir iyon drift zamanı ölçer. Drift zaman değerleri alınan verileri bir drift-tüp doğrusal CCS değerleri36için ilişkili olabilir IM-MS kullanmasını ölçülür. Dalga IM-MS (TWIMS) ölçümleri seyahat için CCS değerlerinin hesaplanması protein standartları bilinen CCS değerleri37ile elde edilen bir kalibrasyon eğrisi gerektirir. Kompakt yapıları genişletilmiş daha hızlı seyahat veya arabellek gaz hareketlilik hücre38ile etkileşimleri uzun yapıları nedeniyle azalmış. Bu nedenle, IM-MS yerli katlanmış yapısı içinde gaz faz39,40muhafaza Eğer algılamak için kullanılabilir. Bu bölümde IM-MS ölçmek ve CCS protein TWIMS kullanarak hesaplamak nasıl belirleneceğini açıklar.
<ol><li>Enstrüman koşulları istikrarlı iletimi (Adım 2) için optimize sonra collisional enerji ve örnekleme koni mümkün olduğunca düşük ederken iyi spectra kalite koruyarak azaltmak.</li>
	<li>En iyi duruma getirilmiş dalga hızı ve dalga yüksekliği IM-MS (Adım 2) elde etmek için kullanmak.</li>
	<li>İyon drift ölçmek zaman IM-MS ile üç farklı dalga hızları (Örneğin, 550, 600 ve 650 m/s) aynı dalga yüksekliği (Örneğin, 40 V) muhafaza ederken.</li>
	<li>Protein iyonları CCS, ölçü protein calibrants protein soruşturma altında için kullanılan aynı araç koşullar altında belirlemek için. En iyi drift-zaman kalibrasyon ölçüm ile bilinen CCS proteinlerin gerektirir.<ol>
<li>Dört calibrants, iki bir kitle ile ve iki protein soruşturma37altında aşağıda bir kitle ile seçin. En önemlisi, dalga yüksekliği ve dalga hızı soruşturma altında protein için kaydedilen alanındakiyle aynı olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hesaplamak el ile41 CC veya PULSAR33 ve Amphitrite34 (Şekil 5) gibi özel bir yazılım kullanarak.</li>
	<li>Protein olup olmadığını denetlemek için yerel benzeri gaz aşamasında elde edilen karşılaştırma deneysel CCS teorik CCS için yüksek çözünürlüklü yapılardan. HerA-NurA, teorik CCS MOBCAL42yılında kullanılan projeksiyon yaklaşım (PA) yöntemini kullanarak hesaplayın. Diğer yöntemleri yörünge yöntemi (TM)42 ve tam zor küre (EHS)43saçılma içerir.</li>
</ol>4. yapı belirlenmesi Protein kompleksleri-çözüm bozulma yerel MS ve IM-MS için açtı
Not: Protein alt kompleksleri bazı durumlarda olduğu gibi karmaşık olarak aynı çözümden tespit edilebilir. Ancak, daha fazla yapısal bilgi arası alt birim bağlantı ve karmaşık montaj gibi protein etkileşimleri çözümünde, formu alt kompleksleri için kesintiye elde edilebilir. Bu organik çözücü, iyonik gücü artan veya pH manipüle eklenmesi gibi çeşitli şekillerde elde edilebilir. HerA-NurA karmaşık alt birim bağlantı ve karmaşık derleme bir anlayış kazanmak için alt kompleksleri alt birim etkileşimleri huzursuz çözücüler ekleyerek çözümde oluşturulan.
<ol><li>Amonyum asetat protein örnek ve tampon Exchange'e Adım 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Çözücü % 10-@ 10 artışlarla ekleyin. Genellikle kullanılan çözücüler metanol (MeOH), dimetil sülfoksit (DMSO) veya Asetonitril (ACN) vardır. Not: Bu bir polipropilen microcentrifuge tüp içinde yapılabilir.</li>
	<li>Karışımı 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>(Adım 2 ve 3) (Şekil 4) her koşul için bir IM-MS spektrum elde etmek.</li>
	<li>ZİRVE yazılım44 protein alt kompleksleri atamak ve protein etkileşim ağları oluşturmak için kullanın. Alternatif olarak, el ile teorik kitleler beklenen türlerinin bir listesini oluşturur.</li>
	<li>Subcomplexes katlanır emin olmak için alt kompleksleri için deneysel CCS değerleri hesaplamak ve Adım 3 ' te (Tablo 1, Şekil 5 ve Şekil 6) açıklandığı gibi teorik CCS karşılaştırın.</li>
</ol>5. Protein kompleksi çarpışma indüklenen Unfolding (UKÜ) kullanarak istikrar soruşturma
Not etmek-Ebilmek var kullanılmış UKÜ proteinler ve ligand taşıması üzerine kendi kompleksleri yapısal istikrarı sonda. Uzman yazılım paketleri PULSAR33, Amphitrite34 ve UKÜ Süiti9 gibi daha sonra gaz fazlı soruşturma ve ligand olmadan altında proteinin unfolding modellemek için kullanılabilir. Örnek olarak, bu bölümde özet bilgiler gaz fazlı izleme yordamı yörüngeleri unfolding ve HerA-NurA kompleksi DNA ve ATP bağlayıcı teskin etkisini araştırıyor.
<ol><li>200 V kademeli gaz fazlı protein açılmak için 2-10 V artışlarla 10 V tuzak ivme gerilim artan iken kayıt IM-MS veri. Not: daha küçük artışlarla sonuçları işlemek, ancak bu yaklaşım daha çözümlenmiş unfolding arsa, sağlar için daha fazla veri dosyalarında kayıt hangi katlanmış/gelişeceğini türler arasında geçiş noktaları analiz etmek için önemlidir.</li>
	<li>PULSAR33, Amphitrite34 veya UKÜ Süiti9 kullanarak alınan verileri çözümlemek ve iki boyutlu unfolding araziler CCS birimlerinde voltaj (Adım 3) hızlanan bir fonksiyonu olarak oluşturmak. Her şarj durum için bu yoğunluğu-normalleştirilmiş CCS dağılımları her hızlanan voltaj (Şekil 7 A-Bi), istifleme tarafından oluşturulur.</li>
	<li>Teorik bir açılım Arsa yazılım paketleri kullanarak oluşturun. Verileri için bir açılım modeli ile donatılmış. Bu collisional enerji unfolding geçişler oluşur ve proteinler ile ve ilişkili ligandlar33olmadan kararlılığını belirlemek ölçmek olanak sağlar. Bir açılım zaman bir tür geçişler (deneysel CCS değerlerine dayalı) bir durumdan daha büyük bir CCS ile başka bir duruma geçiştir.</li>
	<li>Geçişleri quantitate için algoritmalar ve PULSAR33gibi yazılımlar kullanarak devletler arasında geçiş midpoint(s) hesaplayın. Bu genellikle, bir özel durum % 50'si tükenmiştir çarpışma (tuzak) gerilim değeri olan CV50, bildirilmektedir.</li>
	<li>CV50 değeri kullanarak, toplam iç enerji bir iyon Kütle Merkezi çarpışma enerji (KECOM)45kullanarak hesaplayın. KECOM bir iyon unfolding geçiş için kullanılabilir toplam iç enerji tarafından tanımlanır ve kinetik enerji ve kitleler çarpışma partnerler (protein iyon ve nötr gaz) denklemi (1)10 ' açıklandığı gibi hesaplanır KEcom (eV) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57966/57966eq1.jpg"> (denklem 1). Z İyon şarj nerede MN nötr gaz kütlesi ve Miyon protein iyon kitle. Not: UKÜ proteinlerin ücret dependent46, 47 olmasıdır. Bu birden fazla şarj durumuna ( Şekil 7bütün) KECOM analizi yapmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>6. Integrative MS olarak kullanılan fark moleküler dinamiği simülasyonları için yordamlar modelleme
Not: model protein alt ya da gibi kompleksleri gelen kristal yapıları kullanarak, fark MD simülasyonları (protein kompleksi ve ligand olmadan) Örneğin ligand varlığı protein yapısı ve dinamik etkileri belirlemek için kullanılabilir. Bu bölümde bir iş akışı ve araçları Kurulum fark moleküler dinamiği simülasyonları için gerekli yordamlar modelleme için gerekli ayrıntıları.
<ol><li>Hangi kompleksi (Şekil 8A, Adım 2 ve 3) oluşturmak alt birimleri tanımlayın. Varolan modellerin alt birimleri, Örneğin, kristal yapıları RCSB veri Bankası (https://www.rcsb.org)--dan kaynak. Protein girdi listesi içerir UniProt crystallographic/NMR yapıları (http://www.uniprot.org) biliyorum. Bunlar yoksa, teorik sıra Homoloji modelleme (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) için uygun şablonları tanımlamak için bir patlama için giriş olabilir.</li>
	<li>Doğru topoloji (Şekil 8A-II) karmaşık bir araya getirin. Bu çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Bireysel alt birimleri (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/) olduğu gibi karmaşık bir araya EMDB üzerinde bulunan kullanılabilir elektron mikroskobu haritalar içine takılabilir. Pdb moleküler Dynamics esnek montaj (MDFF) kullanarak EM haritalar uydurma için a özel öğretmen-ebilmek bulunmak burada: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.</li>
	<li>(Şekil 8A-III) kompleks eksik bölgeleri tanımlayın. Çoklu dizi hizalaması (MSA) PDB ve teorik dizini içine kristal yapıları, ya da herhangi bir mutasyon crystallographic deneyler miras unfitted olabilir artıkları tanımlamak için arasında gerçekleştirin. MSA T-kahve (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) gibi webserverların kullanarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Eksik artıkları (Şekil 8A-IV) modelleme Homoloji üzerinden yeniden. Protein kompleksi artıkları eksik MODELLER programı (https://salilab.org/modeller/) kullanarak inşa edilebilir. MODELLER farklı rejenere yapılandırmalarında n modelleri bir topluluğu çıktısını alabilirsiniz. İyi modelleri onların ayrı optimize Protein Enerji (uyuşturucu) puanına göre göre tespit edilebilir. Kapsamlı bir eğitim yazılım web sitesinde (https://salilab.org/modeller/tutorial/) sağlanır.</li>
	<li>Belirli bir çevre değişikliği için Örneğin, varlığı bir ligand yanıt proteinler bölgelerinde tanımlamak için fark moleküler dinamiği (MD) simülasyonları protein kompleksi (Şekil 8B) gerçekleştirin. Böyle simülasyonları, simülasyon A davranış parametreleri (sadece protein) içinde olan bir referans olarak davranır simülasyon B (protein + ligand) çıkartılır. Simülasyonlar A ve B arasında hesaplanan fark kök ortalama kare dalgalanma (RMSF) hangi bir ligand bağımlı şekilde esneklik azaltmak veya artırmak bölgelerinde protein bilgilendirebilir.<ol>
<li>MD simülasyonları ve GROMACS (http://www.gromacs.org) kullanarak karşıdan akış çözümlemesi gerçekleştirin. Bir öğretici adreste bulunabilir: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Sürücü modeli önyargı, ligand-bağlı kompleks yapısı önce oluşturulmalıdır. Protein sonra bundan bir protein modeli ligand-bağlı kompleks aynı vermeye ligand, olmadan kopyalanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

MS stoichiometry, etkileşimleri ve protein kompleksleri mimarisini alt birim karakterize giderek önemli bir rol oynuyor. IM-MS veri alt birimleri uygulamasının kompleksleri içinde topolojik düzenlemelerin tanımlamak için kullanılabilir. Varolan diğer yapısal biyoloji yöntemlerine göre MS birçok avantajı vardır. Yerel MS hızlı ve son derece hassas teknik ve türdeş olmayan protein örneklerini incelemek için kullanılabilir. Çözüm bozulma deneyler ile birleştiğinde, protein derlemeler ayrılma yollar izlenebilir. İle birlikte kristal yapıları veya Homoloji modelleri, yapısal MS tarafından sunulan bilgi protein-ligand etkileşimleri soruşturma için bir araç sunar ve yerli yakınındaki modelleri ve derleme yolları11sağlar.
Burada, biz stoichiometry ve kompozisyon ile bir veya daha fazla ligandlar, protein-ligand etkileşimlerin analizi için gerekli deneysel yordamlar bütünleştirici MS kullanarak açıklar. Bu MS numune hazırlama, veri toplama, veri analizi ve hesaplama araçları kullanarak MS veri entegrasyonu içerir. Bunu yapmak için biz bizim model sistemi olarak üç ligandlar (DNA, ATP ve ADP) bağlı DNA-rezeksiyon HerA-NurA hetero-oligomeric protein kompleksi, kullanılır. İletişim kuralı veri analizi ve sunum yardım etmek için şu anda mevcut yazılımın kullanımını göstermektedir.
Bu nedenle, dikkatli örnek hazırlık adımları protein saflaştırma, ligand titrasyon ve arabellek değişimi de dahil olmak üzere kritik, yüksek kaliteli spectra edinme ligand bağlayıcı analiz için önemlidir. Bir sınırlama nESI ligand bağlayıcı okurken yerel MS non-spesifik bağlamadır. Spesifik olmayan bağlama damlacık desolvation electrospray sürecinde ortaya çıkar. Bu ligand konsantrasyonu artırır ve bu nedenle protein/Ligand oranı29değiştirir. Apo ve, iyonlaşma verimliliği50,51değiştirmeyen nükleotit bağlı protein arasında nispeten küçük bir kitle fark nükleotit bağlama sonuçlanır.
Biz Synapt G2-Si MS sistem bizim iş için kullanılan, ama iletişim kuralları diğer ticari olarak mevcut nano-electrospray kütle spektrometreleri kullanarak diğer protein-ligand komplekslerinin farklı araştırmalar için geçerlidir. Bütünleştirici yapısal MS giderek daha fazla karmaşıklık biyolojik sorunlarıyla ilgilenmeye önemli bir rol oynuyor. İş akışı ve burada açıklanan teknikleri yapısal sonuçları anlama ve protein kompleksi ve protein-ligand oluşumu Aksi takdirde konvansiyonel yapısal teknikleri kullanarak eğitim zor olan mekanizmaları bina için uygundur .

Sağlam proteinler ve kendi kompleksleri yerel kitle spektrometrik Analizi electrospray ve nano-electrospray iyonlaşma (nESI), protein katlanması korumak ve kovalent olmayan etkileşimleri iyonlaşma işlemi1sırasındakullanarak yapılır, 2. Yerel MS olarak proteinler ve kendi kompleksleri yapısını bir yerli yakınındaki devlet gaz-faz3,4korunur. Yerel MS algılar protein veya protein-ligand kitle izin verme oranı (m/z) şarj etmek için onların kitle göre ayrılmış birden çok dolu protein iyonları karmaşık hesaplanacak. Bu bilgi bozulmamış bir protein stoichiometry, alt birim oluşturmayı, ligand taşıması ve etkileşim ağları3,4,5,6tayini sağlar. Yerel MS için diğer tekniklerle karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır böyle x-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi5. İlk olarak, yerel MS bir hızlı ve son derece hassas, sadece bir kaç microliters (2-3 µL) gerektiren yüksek nM düşük µM Aralık6için nispeten düşük son karmaşık konsantrasyonlarda örneğinin tekniktir. İkinci olarak, yerel MS heterojen protein örnekleri aynı anda birden fazla protein ve oligomeric Birleşik analiz edinerek sorgulamak için kullanılabilir. Üçüncü olarak, yerel MS protein örnekleri analiz daha önce kimyasal çapraz ya da protein etiketleme tarafından değişiklik gerektirmez. Bu avantajları yapısal MS protein kompleksleri yapısal incelenmesi için güçlü bir araç yaptık.
Yerel MS, collisional kesit (CCS) belirlenecek etkinleştirme iyon hareketlilik (IM), protein iyon bir elektrik alanı ile seyahat süresini ölçer bir teknik ile birleştirilebilir. CCS topoloji ve konformasyon heterojenite bilgi edinilmesi proteinlerin sağlar düşük çözünürlüklü yapısal bilgi sağlar. Ayrıca, protein yapı modelleri Hesaplamalı yaklaşımlar tarafından üretilen incelenmesi sağlar.
Protein gaz fazlı istikrar indüklenen (UKÜ) unfolding ölçülen çarpışma kullanarak IM-MS tarafından soruşturma. UKÜ sürecinde protein iyonları hızlandırılmış ve bir inert arabellek gaz içinde bir kütle spektrometre7,8,9ile artan hızlanan çarpışma aracılığıyla harekete geçirmek. Bu collisional etkinleştirme işlemi CCS bir artış anlamına kısmen açılmak protein neden olur. CCS ve protein açılmak için gereken enerji bu değişiklik olabilir IM-Bayan kullanarak ölçülen bu yaklaşım, ligand bağlayıcı protein istikrar üzerindeki etkisi ölçülen10olabilir. Subcomplexes yerli benzeri topolojileri protein kompleksleri, izlemek için organik çözücüler eklenmesi gibi çözüm bozulma yöntemleri kullanarak çözümde oluşturulabilir. Protein kompleksleri bozulma esas olarak içi kovalent olmayan etkileşimleri bozulma nedeniyle 's. Alt kompleksleri yerli benzeri topolojileri korumak ve MS algılama arası alt birim bağlantı hakkında bilgi açığa.
Yapısal biyoloji İntegratif yaklaşımlar proteinler ve kendi kompleksleri3,4,5,6dinamiklerini ve yapısını incelemek için çeşitli yöntemleri birleştirir. Yerel MS ve IM-Bayan zorlu biyolojik sistemlerde moleküler ayrıntıları ortaya çıkarmak için kullanılır. Protein-protein etkileşim ağları15 eğitim protein derleme yolları11,12,13,14, çalışmanın da dahil olmak üzere uygulamaların çeşitli örnekler olmuştur , 16 , 17, membran proteinleri6,18,19,20,21ve nükleik asitler22,23 gibi protein-ligand etkileşimleri ,24.
Ancak, yerel MS de kendi sınırlamaları vardır. Yerel MS ölçümleri genellikle bazı proteinler onların katlanmış yerel devlet3,25tutulmaz sulu amonyum asetat gibi uçucu arabelleklerindeki gerçekleştirilir. Yine de, son iş bu sınırlama öyle ki protein ve protein kompleksi iyonlar daha iyi doğrudan geçici olmayan arabelleklerinden yüksek iyonik sağlam ile oluşturulması mümkündür iğne ucu çapı (0,5 mm ipuçları) püskürtme en iyileştirme tarafından üstesinden gelebileceğini göstermiştir fizyolojik çevre26taklit. Buna ek olarak, yerel MS iyonize ve kovalent olmayan derlemeler eriyik--dan gaz aşamaya aktarmak için electrospray kullanır; Bu nedenle, algılanan kompleksleri göreli bolluk tamamen bu çözüm5,27' temsil etmeyebilir. Ayrıca, çözüm karşılaştırma için gaz faz hidrofobik etkileşimler daha zayıf hale ve elektrostatik etkileşimler daha güçlü hale ve dolayısıyla3,28tercih.
Bu makalede, biz iletişim kuralları, veri analizi ve yorumu protein tanımlama ve ligand bağlayıcı kullanarak yerel MS, IM-MS, UKÜ, çözüm bozulma ve modelleme için sağlar. HerA-NurA, DNA onarım karmaşık bir modeli sistemi olarak kullanılır. DNA çift iplikçikli sonları (DSBs) bir DNA hasarı, genetik istikrarsızlık ve insanlarda kanser nihai gelişimi sonuçlanan en sitotoksik ve zararlı formları vardır. Homolog rekombinasyon DSBs, ATP bağımlı helikaz-nükleaz karmaşık, HerA-tolga22tarafından düzenledi bir işlemi gideriyor onarım düzenektir.
Yerel MS ve IM-MS ile fonksiyonel deneyleri birleştiren ve modelleme izin araştırılması: i) rolü NurA derleme, uyum ve istikrar tesis, II) dsDNA ve karmaşık arasındaki etkileşim ve üzerindeki genel etkisi karmaşık kararlılığını ve III) stoichiometry ve derleme22ATP bağlayıcı etkisi. Genel olarak, bu eser protein kompleksi konformasyon değişiklikler ve istikrar nükleotit bağlama ile bağlantı kurarak HerA-NurA karmaşık moleküler temeli geliştirilmiş bir anlayış için yol açtı. Bu iletişim kuralı için etkileşim herhangi bir protein complex(es) bir veya daha fazla ligand(s) türleriyle geneldir.

<table><tbody><tr><td>Adenozin 5&prime;-(3-tiyotrifosfat) tetralityum tuzu</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&prime;-difosfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin Kromatografi Sütunları</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin yoğunlaştırıcı</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Kılcal</td><td>Damarlar Harvard Aparatı</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

protein mimarileri ve protein-ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteinlerin hücresel işlevler gen ekspresyonu, metabolik reaksiyonlar, DNA tamiri ve çoğaltma katalizlerler dahil olmak üzere birçok önemli rol oynarlar biyolojik oluştururlar önemli bir sınıfıdır. Bu nedenle, bu işlemlerin ayrıntılı bir anlayış kritik bilgi sağlar hücrelerin fonksiyonu. Bütünleştirici yapısal MS yöntemleri protein kompleksi derleme, karmaşık bağlantılar, alt birim stoichiometry, protein Oligomerizasyonda ve ligand taşıması hakkında yapısal ve dinamik bilgi verirler. Bütünleştirici yapısal MS son gelişmeler büyük DNA bağlayıcı proteinler ve membran proteinlerinin zorlu biyolojik sistemleri karakterizasyonu için izin vermiş. Bu iletişim kuralı yerel MS ve iyon hareketlilik-kütle spektrometresi (IM-MS) moleküler dinamiği simülasyonları ile bir helikaz nükleaz DNA anlayışlar kazanmak için protein kompleksi onarmak gibi çeşitli MS veri tümleştirmek açıklar. Elde edilen yaklaşım ligand bağlayıcı önemli biyolojik süreçleri dahil diğer protein kompleksleri için ayrıntılı çalışmalar için bir çerçeve sağlar.

Yerel MS sonuçları ortaya koydu oligomeric durumu, kompozisyon ve topoloji HerA-NurA kompleks (Şekil 1). Kovalent olmayan etkileşimleri gaz aşamasında korunur gibi ATP-γ-S ve ADP titrations deneyler yerel MS HerA-tolga (Şekil 2) ikili nükleotit bağlamaya belirlenir ve ATP-γ-S konsantrasyon artmakta göreli artırır yoğunluğu hexameric HerA (Şekil 3). İlgili alt birim etkileşimleri çözüm bozulma yerel MS tarafından takip üzerinden elde edilmiştir ve taleplere ile yapısal bilgi ve teorik kitleler (Şekil 4 ve tablo 1).
Proteinler ve kendi kompleksleri deneysel CCS değerleri (Şekil 5) IM-MS deneylerden elde. Bu değerler rotasyonel ortalama gaz fazlı moleküler şeklinin kesitsel hesaplamalar ve protein boyutlu durumu açıklamak. CCS değerleri x-ışını kristalografisi teorik ölçümleri için karşılaştırılır ve iyi bir anlaşma yerel şeklinde gaz-faz (Tablo 1)muhafaza infers. Bu protein derleme48düşük çözünürlüklü modeli oluşturmak için CCS değerleri kullanarak doğrular.
Deneysel CCSs her sorumlu devlet iyon için hesaplanabilir. Bir yerli gibi protein conformer devlet iyonları benzer CCS değerleri ile şarj etmek için çıkmasına neden. Ancak, daha yüksek ücret devlet iyonları teorik CCSs göre protein gaz fazlı açılım ve daha büyük CCS değerleri yol açabilir coulombic repulsions arttı. İyonları bu nedenle genellikle en düşük ücret durumunda CCS değeri49kullanılmış. HerA-NurA, HerA ve HerA-NurA üzerinde çözüm bozulma deneyler ve DNA olmadan monomerleri ile başlayan daha sonra tüm hexameric HerA (Hera'nın6) şekillendirme bir derleme yol nesil-e sevketmek-dimerik NurA (tolga2) kompleks DNA'sını (Şekil 6).
UKÜ unfolding araziler apo (ligand-ücretsiz) ve bağlı ligand arasındaki farkları ligand taşıması üzerine karmaşık istikrar değişikliği tanımlamak için. Bir daha yüksek CV50 veya KECOM değeri gaz aşamasında daha stabil bir iyon anlamına gelir. UKÜ ve KECOM analiz DNA bağlı HerA-NurA DNA ücretsiz karmaşık (Şekil 7bütün) daha istikrarlı saptandı. İlgili ATP-bağlayıcı Birleşik Devletleri UKÜ-MS analizinden, gaz-faz ve tüm siteler nerede işgal altı -ATP-γ-S ilişkili devlet azaltılmış karmaşık istikrar en çok dört-ATP-γ-S ilişkili devlet (Şekil 7bıı) kararlı. Yerel MS Hera'nın Birleşik Devletleri bağlayıcı ayrık nükleotit ortaya çıkarabilir; Ancak, hangi Hera'nın alt birimleri ATP bağlayıcıdır ve nerede bu bağlama gerçekleşir ayırt edemez. Bu bilgileri açık solvent MD benzetimlerini hexameric HerA ve HerA-NurA özetledi iş akışı (Şekil 8) takip üzerinden elde edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Şekil 1. Oligomeric durumu, kompozisyon ve HerA-NurA kovalent olmayan karmaşık topoloji sorguluyor. (A) kitle spectra HerA, HerA-NurA ve HerA-NurA DNA (15,4 kDa 25 bp çift iplikçikli DNA) huzurunda. Hera'nın alt karmaşık bir hexamer ve bir heptamer bulunmaktadır. Tolga dimer bağlar ve oligomeric dönüşüm heybetli bir Hera'yı hexamer için. DNA kurulan HerA - NurA kompleksi (Z. Ahdash vd, 201722uyarlanmış sonuçları) bağlar. (B) göreli yoğunluklarda saptanan türlerin UniDec32kullanılarak hesaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Şekil 2. Yerel ESI-MS HerA-NurA nükleotit bağlama mekanizması ortaya koymaktadır. ATP-γ-S ve (ii) ADP (i) konsantrasyonları artan kitle spectra HerA NurA (A) ve (B) HerA-tolga-DNA. Ölçülen kitleler teorik kitleler ve ATP-γ-S miktar için karşılaştırılır veya bağlı ADP belirlenir. Ölçülen kitleler ve ilişkili nükleotit sayısı spectra üzerinde gösterilir. ATP-γ-S ve ADP titrations deneyler bir döngüsel tepki mekanizması (Z. Ahdash vd, 201722uyarlanmış sonuçları) gösteren DNA ile kompleks zaman içinde HerA-NurA yalnız ve ikili nükleotit bağlama belirledi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Şekil 3. HerA oligomeric durumuna ATP-γ-S konsantrasyonları artan etkisini ölçme. (A) kitle spectra HerA, ATP-γ-S. konsantrasyonları artan (B) yerel MS UniDec deconvolution yazılım32kullanılarak hesaplanan farklı türlerin göreli yoğunluklarda gösteren grafik. ATP-γ-S konsantrasyonu arttıkça, hexameric HerA göreli yoğunluğunu da artırır. ATP-γ-S molekülleri bağlı sayısı spectra (Z. Ahdash vd, 201722uyarlanmış sonuçları) gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Şekil 4. Spectra ve HerA (A) ve (B) HerA-tolga (i) alt karmaşık ayrışma ürünleri yalnız ve (ii) DNA aşağıdaki çözüm bozulma huzurunda kitle. Çözüm bozulma deneyler gerçekleştirilen Asetonitril, % 10-40'ını kullanarak metanol (MeOH) veya dimetil sülfoksit (DMSO) ve çeşitli subcomplexes oluşumunda sonuçlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Şekil 5. İyon hareketlilik varış saat dağıtımları CCS ekseninde kompleksleri ve oluşturulan alt kompleksleri için gösterilen. Bu Rakam4 spectra açıklamalı alt karmaşık her ilişkili için simge. Deneysel ve hesaplanan kitleler ve alt kompleksleri CCS değerleri Tablo 1 (tipik belirsizlik dalga iyon seyahat çözünürlükte dikkate sonra deneysel ve hesaplanan değerleri arasında bir anlaşma tüm bunların gösterdi listelenir hareketlilik kütle spektrometresi ±5 - %837). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Şekil 6. Derleme yolu yerel MS ve IM-Bayan renkli daireler gösterir nerede her alt karmaşık gözlenen koşulları çözüm bozulma oluşturulan HerA-NurA kompleks: yerli (yeşil, önceden kesintileri için), metanol (sarı), DMSO (mor) veya Asetonitril (kırmızı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Şekil 7. HerA-NurA ve HerA-tolga-DNA bağlanma (B) ATP (A) DNA'ın etkisi teskin araştırıyor. (i) gaz fazlı UKÜ-MS araziler ve (ii) merkezi-in-kütle çarpışma enerjiler (KEcom) hesaplama dsDNA varlığı HerA-NurA karmaşık stabilize ve altı ATP-γ-S devlet bağlı en kararlı olduğunu gösterin. Farklı ücret Birleşik için istikrar gösterilir. Araziler PULSAR 33kullanarak oluşturulan. (A) Z. Ahdash vd, 201722adapte sonuçlarından. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Şekil 8. Fark moleküler dinamiği simülasyonları için modelleme yordamlar için iş akışı. (A) karmaşık soruşturma altında alt birimleri mevcut ve eksik artıkları yeniden topoloji oluşturma tarafından oluşturuluyor. (B) moleküler dinamiği simülasyonları protein kompleksi ve ligand olmayan çalışan için iş akışı. Moleküler dinamiği simülasyonları vardır sadece bir referans olarak hangi eylemleri ve hangi protein artı ligand simülasyonu çıkarılır için protein koştu. Bu simülasyonlar arasındaki fark kök ortalama kare dalgalanma (RMSF) hesaplama ve ligand taşıması etkisini belirleme takip ediyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Karmaşık / alt karmaşık</td>
			<td>Teorik kitle (kDa)</td>
			<td>Deneysel kitle (kDa)</td>
			<td>Teorik CCS (Å2)</td>
			<td>Deneysel CCS (Å2) [ücret]</td>
			<td>Koşul HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'yı6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10- ACN, % 10-40 DMSO, % 10 MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'yı6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td> ACN, % 10 MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tolga1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-@ ACN, % 10 MeOH, % 20-40 DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tolga2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-@ MeOH, % 20-40 DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-@ ACN, % 40 DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>% 40 meth, 10-@ ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-@ MeOH, 10-@ CAN, % 40 DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın3 + DNA</td>
			<td>183,99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-0 ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-@ MeOH, 10-@ ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-0 ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-@ ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-@ MeOH, 10-@ ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>0 ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-@ MeOH, 10-@ ACN, % 10-40 DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hera'nın7 + DNA</td>
			<td>409,8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td> ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Deneysel ve hesaplanan kitleler ve HerA-NurA ve onun alt kompleksleri CCS değerleri form çözümü bozulma çalışmalar üretilen.

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Günümüzde kütle spektrometresi yapısal biyolojide önemli bir rol oynamaktadır. Bu yöntem, doğal durumları olan önemli biyolojik makromoleküller, özellikle proteinler ve protein kompleksleri ile ilgili anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Yerli kütle spektrometresi, multiprotein ve nükleik asit sistemleri de dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküler derlemeler için yaygın olarak uygulanabilir.Bu tekniğin en büyük avantajı hızlı ve son derece hassas olmasıdır. Heterojen protein örneklerini sorgulamak, aynı anda oligomerik durumda birden fazla proteinin analiz edilmesi mümkün kılmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Andy Lau, grubumda bir doktora öğrencisi olacak.Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi nanoelectrospray için şirket içi kılcal damarları hazırlayın. Amonyum asetat içine tampon değişimi her çalıştırmak için bir kontrol olarak ligand-free örnek hazırlayın. Ardından, duyarlılık, pozitif iyon edinimi ve mobilite TOF modlarını seçin.Bir sonraki açma da tuzak, API ve IMS gazları. IM ayırma için burada gösterilen azot ve argon başlangıç noktalarını kullanın ve gerektiği gibi ayarlayın. Uygun bir m/z edinme aralığı ayarlayın.Bilinmeyen bir protein için ilk optimizasyon adımları geniş bir yelpazede kullanmalıdır. Altın kaplı kılcal damarı bir kılcal tutucuya takın. Daha sonra kapiller içine ilgi protein kompleksi çözeltiiki ve üç mikrolitre arasında yükleyin.Kılcal damarı hafifçe sıkın ve elektrosprey kaynak aşamasına yerleştirin. Veri elde etmeye başlamak için sahneyi konuma getirin. Kılcal damarın ucunda bir damla oluşana kadar düşük nano akışlı gaz basıncı uygulayın.Kılcal damarı koniye göre hareket ettirin ve kararlı bir iyon akımı elde etmek için iyon akımını izleyin. 0,9 ile 1,6 kilovolt arasındaki aralıkta kılcal bir voltaj uygulayın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleme konisini, kaynak ofsetini, kaynak sıcaklığını ve koni gaz akışını ayarlayın.İyi çözülmüş bir kütle spektrumu ve maksimum iyon iletimi elde etmek için, MS parametrelerini ayarlayın ve spektrumdaki sonucu olan değişimi izleyin. Tuzak çarpışma enerjisini 10 ile 50 volt arasında bir başlangıç noktasına ayarlayın. Gerilim uzaklıkları yetersizse, tuzak çarpışma enerjilerini ayarlayın.20 ve 45 volt arasında bir başlangıç noktasına kendi gerilimi ile tuzak ayarlayın. Bu voltajı optimize ederek desolvasyonu artırın. Bundan sonra, en iyi hareketlilik ayrımı elde etmek için metinde belirtildiği gibi dalga hızı ve dalga yüksekliği optimize edin.HerA ve NurA içeren çalışmalar için saniyede 40 metre ve 550 ve 650 volt arasında bir dalga yüksekliği bir dalga hızı kullanın. DNA bağlayıcı analizi için, protein ve DNA'yı protein DNA kompleksi oluşumuna izin veren molar oranında karıştırın. Aşağıdakilerden herhangi birini artırarak ekleyin, 5'O-3-thio-trifosfat, tetralithium tuz, veya ADP.Uygun yazılım kullanarak üretilen türlerin kitleleri ölçmek ve ligand bağlayıcı, ATP ve ADP bağlayıcı ve oligomerik devletler gibi belirlemek. Daha sonra türlerin karşılık gelen göreceli bolluk ölçmek için ham ESI MS spektrumlarında gözlenen iyon yoğunluklarını kullanın. Kararlı şanzıman için alet koşullarını optimize ettikten sonra, çarpışma enerjisini ve örnekleme konisini mümkün olduğunca düşük bir şekilde azaltırken, iyi spektrum kalitesini korur.IM MS'i elde etmek için önceden belirlenmiş en iyi leştirilmiş dalga hızını ve dalga yüksekliğini kullanın. Aynı dalga yüksekliğini korurken iyon sürüklenme süresini üç farklı dalga hızlarında ölçün. Protein iyon CCS ölçmek için dört protein kalibrasyon ölçmek, araştırma altında protein yukarıda kütlesi ile iki ve aşağıdaki kitle ile iki, aynı enstrümantasyon koşulları kullanarak. İlk olarak, protein örneklerini hazırlayın ve tampon olarak metin protokolünde belirtildiği gibi amonyum asetat asetat içine değiştirin.İstenilen miktara ulaşana kadar %10'luk artışlarla çözücü ekleyin. Bir saat buzda kuluçkaya yat. Bundan sonra, her örnek için bir IM-MS spektrumu edinin.Summit yazılımını kullanarak, protein alt kompleksleri atayın ve protein etkileşim ağları oluşturun. Alternatif olarak, el ile beklenen türler için teorik kitlelerin bir listesini oluşturmak. Protein kompleksi stabilitesini araştırmaya başlamak için, tuzak ivme gerilimini artırırken IM-MS verilerini kaydedin ve tuzak ivme gerilimini 10 volttan 200 volta yükseltin, bu da protein ve gaz fazına aşamalı olarak açılacaktır.Verileri uygun yazılımı kullanarak analiz edin ve her bir şarj durumu için her hızlanan voltajda şiddeti normalleştirilmiş CCS dağılımlarını istifleyerek iki boyutlu açılma çizimlerini oluşturun. Yerli MS sonuçları HerA ve NurA kompleksinin oligomerik durumunu, bileşimini ve topolojisini ortaya koymaktadır. Gaz fazında kovalent olmayan etkileşimler korunduğundan, ATP gamma S ve ADP titrasyon deneylerinin yerli MS'i HerA ve NurA'daki çift yönlü nükleotit bağlanmasını belirlemek için kullanılır.HerA oligomerik hallerinin kütle spektrumları ATP gama S konsantrasyonunun artırılmasının hexameric HerA'nın göreceli yoğunluğunu artırdığını ortaya koymaktadır. Proteinler ve kompleksleri için deneysel CCS değerleri daha sonra IM-MS deneylerinden elde edilir. Bu değerlerin, düşük çözünürlüklü protein montaj modelleri oluşturmak için CCS değerlerinin kullanılmasını doğrulayan x-ışını kristalografisinin teorik ölçümleri ile iyi bir uyum içinde olduğu görülmektedir.CIU ve KEcom analizleri DNA'ya bağlı HerA-NurA'nın DNA içermeyen kompleksten daha kararlı olduğunu ortaya koymaktadır. CIU MS analizi ve ilgili ATP bağlama durumları, dört ATP gama S bağlı durumunun gaz fazında karmaşık stabiliteyi azalttığını göstermektedir. Ancak, tüm sitelerin işgal edildiği altı ATP gama S bağlı devlet, en kararlı olduğu görülmektedir.Bozulmamış bir kompleksin moleküler kütlesinin doğru ölçümleri biyomoleküler karakterizasyonuna dair değerli bilgiler sağlar. Karmaşık montaj yolları, protein oligomerizasyonu ve ligand bağlanması hakkında bilgi alabiliriz. Tüm bu bilgilerin birleştirilmesi fonksiyonel biyolojik derlemeler ayrıntılı modeller oluşturmak için izin verir.

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

İyon hareketliliği-kütle spektrometresi ve çarpışma kesiti ve kitle dayalı, iyonlar ayıran yeni ortaya çıkan bir gaz faz teknolojisi. Yöntemi protein komplekslerinin genel topoloji ve şekil üç boyutlu bilgi sağlar. Burada, araç ayarı ve optimizasyonu, sürüklenme kez kalibrasyon, ve verilerin yorumlanması için temel bir prosedürü anahat.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Burada, katı tozlardaki proteinler için katı hal amid hidrojen/döteryum değişim kütle spektrometrisi (ssHDX-MS) ve katı hal fotolitik etiketleme kütle spektrometrisi (ssPL-MS) için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Yöntemler, formülasyon tasarımında yararlı olabilecek amorf katı haldeki protein konformasyonu ve etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

Keşfedin, protein kompleksleri ve ligand bağlanmasını analiz etmek için yerel kütle spektrometrisi kullanımını. Bu yöntem, biyomoleküler karakterizasyon ve kompleks stabilitesi hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Daha fazla video keşfet