Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bu yöntem, otofagozom oluşumunun nasıl düzenlendiği ve çeşitli hücre tedavilerinin ve koşullarının toplu otofobiyi nasıl etkilediği gibi otofaji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, endojen yük sekestrasyonunu ölçmesidir. Bu nedenle, yöntem geniş çapta uygulanabilir ve yapay aşırı ekspresyondan veya kargo problarının tanıtılmasından bağımsızdır.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencileri Paula Szalai ve Morten Luhr olacak. Başlamak için, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 75 santimetre karelik doku kültürü şişelerinde kültür yapışkan hücreleri. Hücrelerin, birleşen bir hücre katmanına yakın bir hücre katmanına ulaşana kadar büyümesine izin verin.

Bundan sonra, hücreleri pH 7.4'te 37 santigrat derecede üç mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve üç mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile değiştirin. Hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Daha sonra,% 10 FBS içeren yedi mililitre kültür ortamında hücreleri yeniden süspanse edin ve steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. 0,5 ila 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir sayma haznesi sürgüsünü hemen doldurmak için aynı pipet ucunu kullanın ve hücreleri otomatik bir hücre sayacında sayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunun uygun seyreltmesini hazırlamak için% 10 FBS içeren kültür ortamı kullanın. Aseptik teknikler kullanarak, seyreltik hücre süspansiyonunun bir mililitresini 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna tohumlayın. İstenilen hücre yoğunluğuna ulaşılana kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

İstenilen deneysel tedavilerde, sedimantabl LDH'nin arka plan seviyelerini tanımlamak için bir set kuyu tedavi edilmeden bırakılmalıdır. Hasattan üç ila dört saat önce, her bir oyuğa doyurucu miktarda sekestrasyon sonrası inhibitör Bafilomisin A1 ekleyin. 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Tedavi süresinin sonunda, ortamı aspire etmek için emersiniz. Her oyuğa önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış 200 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her oyuğa %2 BSA içeren pH 7.4'te 500 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ekleyin. Bir pipet kullanarak, hiçbir hücre kümesi görünmeyene kadar her bir oyuğu yeniden süspanse edin. Bundan sonra, her bir oyuktaki hücre süspansiyonunu hemen buz üzerinde ayrı bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri çökeltmek için tüpleri beş dakika boyunca 400 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı iyice aspire etmek için emme kullanın ve hücre peletlerini mümkün olduğunca kuru bırakın. Ardından, her tüpe ultra saf suda% 10 sükroz içeren 400 mikrolitre çözelti ekleyin.

Bir pipet kullanarak, neredeyse tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre peletini yeniden askıya aldı. Bu süspansiyonu dört milimetrelik bir elektroporasyon küvetine aktarın. Küveti üstel bozunma dalgası elektroporatörüne yerleştirin ve 800 volt, 25 mikrofarad ve 400 ohm'da tek bir elektrik darbesini boşaltın.

Hücre bozulmasını 400 mikrolitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu sükroz çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın ve pipetleme ile kısa bir süre karıştırın. Her numune için bu yeniden süspansiyon, elektro bozma ve karıştırma işlemini tekrarlayın. Prosedürü ilk kez gerçekleştiriyorsanız, metinde açıklandığı gibi verimli ve seçici plazma membranı elektro-bozulmasını doğruladığınızdan emin olun.

Sedimantlı LDH fraksiyonları elde etmek için, her seyreltilmiş hücre bozucu çözeltiden 550 mikrolitre çıkarın ve bunu% 0.5 BSA ve% 0.01 Tween 20 ile 900 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu içeren kendi iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Karıştırmak için kısa bir süre pipetleyin. Tortulaşmış LDH içeren peletler üretmek için 45 dakika boyunca 18.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Emme kullanarak, peletleri mümkün olduğunca kuru bırakmak için süpernatanı iyice aspire edin. Sedimanta LDH örneklerini analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Toplam LDH fraksiyonları için, seyreltilmiş hücre bozucu çözeltilerin her birinden 150 mikrolitreyi kendi yeni tüpüne aktarın.

Bunları analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Hem çökelmiş LDH'yi hem de toplam LDH örneklerini buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra, toplam LDH numunelerine %1,5 Triton X-405 içeren 300 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin.

Numuneleri soğuk bir odada bir rulo üzerinde 30 dakika döndürün. Ardından, çökelmiş LDH numunelerine %1 Triton X-405 içeren 750 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Çözelti homojen olana kadar peletleri yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.

Çözünmemiş hücresel kalıntıları çökeltmek için tüm numuneleri beş dakika boyunca 18.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra numuneleri buzun üzerine koyun. Metinde açıklandığı gibi klasik bir enzimatik test veya ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli kitlerden herhangi birini kullanarak süpernatanlardaki LDH seviyelerini belirleyin.

Bu çalışmada, toplu otofajik sekestrasyon aktivitesi bir dizi farklı memeli hücre hattında izlenmiştir. Burada gösterildiği gibi, hem bazal hem de açlığa bağlı LDH sekestrasyonu ve LNCaP hücreleri, pan-PI3-kinaz inhibitörü 3MA tarafından tamamen ortadan kaldırılır. Seçici PI3-kinaz Sınıf üç inhibitörü, SAR-405 ve ER kalsiyum pompası inhibitörü, Thapsigargin.

HEK293 hücrelerinde, açlık koşulları altında LDH sekestrasyonu hem Thapsigargin hem de ULK inhibitörü MRT 67307 tarafından güçlü bir şekilde azaltılır. Ayrıca, açlığa bağlı LDH sekestrasyonunun, gözlemlenen diğer hücre hatlarında 3MA tarafından tutarlı bir şekilde inhibe edildiği gösterilmiştir. Daha sonra, otofagozom oluşumu için gerekli olduğu bildirilen otofaji ile ilgili genlerin LDH sekestrasyonu için gerekli olup olmadığını test etmek için çeşitli ATG gen nakavt MEF'leri kullanılır.

Görülebileceği gibi, ATG5 nakavt MEFS'de açlığa bağlı LDH sekestrasyonu kaldırılmıştır. Ayrıca, ATG7 ve ATG9A nakavt MEF'lerinde de körelmiştir. Son olarak, anahtar ATG gen transkriptlerinin RNAi aracılı susturulmasının etkileri belirlenmiştir.

ATG9A hedefleme siRNA ile veya ULK1 ve ULK2'nin kombine hedeflemesi ile transfeksiyonun, LNCaP hücrelerinde LDH sekestrasyonunu güçlü bir şekilde azalttığı görülmektedir. Bu prosedürü denerken, tüm pipetleme adımlarında doğru davranmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, otofajik bozunma aktivitesinde karşılaştırılabilir değişikliklerle sonuçlanan sekestrasyon aktivitesinde gözlenen değişiklikler olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için uzun ömürlü protein bozunma testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu yöntemi memeli hücre hatlarında kurduktan sonra, toplu otofajinin LC3 protein ailesinden bağımsız olduğunu ve bunun yerine GABARAP'lara ihtiyaç duyduğunu göstermek için kullandık. Bu, otofaji aktivitesini izlemek için LC3'ten bağımsız yöntemlerin kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.