Name: Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, laktat dehidrogenaz haciz tahlili ile memeli hücrelerinde toplu otofajik haciz etkinliğini ölçün. Bu yöntem, endojen kargo hapsedilmesini yapay problere gerek kalmadan güvenilir şekilde değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser mali Araştırma Konseyi Norveç, Oslo Üniversitesi, Anders Jahre Vakfı, Nansen Vakfı ve Henrik Homan anısına mirası tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Noboru Mizushima ATG5 için teşekkür ederim +/ + MEFs ve ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu ATG7 için +/ + MEFs ve ATG7/MEFs ve Dr. Shizuo Akira ATG9A için +/ + MEFs ve ATG9A/MEFs. Biz Frank Sætre teknik yardım ve Dr başına O. Seglen için yapıcı metodolojik tartışmalar için teşekkür ederim.

1. hücre tohum ve tedavi
<ol><li>
Kültür 75 cm2 doku kültürü şişe oksijen kuluçka söz konusu hücre türü için tercih edilen kültür ortamı kullanarak 37 ° C'de % 5 CO2 yapışık hücreleri. Hücreleri bir birleşmesi yakınındaki hücre katmanı ulaşana kadar büyümeye izin. Not etmek Kullanma ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) LNCaP, HEK293, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), BJ, takıma RPMI 1640 orta MCF-7 ve RPE-1 hücreleri.<ol>
<li>3 mL 37 ° C fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), pH 7.4 hücrelerle yıkayın. PBS yerine 3 mL %0.25 (w/v) tripsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) ve hücreleri (2-5 dk) ayırmak kadar oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
		<li>Müstakil hücreleri ile 7 mL kültür % 10 içeren orta resuspend FBS. 10 µL hücre süspansiyon aliquot ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir microcentrifuge tüp 0,5-20 µL pipet ucu kullanarak. Hemen bir sayım odası slayt doldurmak için aynı pipet ucu kullanın ve bir otomatik hücre Counter hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uygun bir hazırlamak seyreltme (aşağıdaki nota bakın) adım 1.1.2 kullanarak hücre süspansiyon kültür orta içeren FBS ve tohum seyreltilmiş hücre süspansiyon 12-iyi doku kültürü plaka (yüzey alanı ~3.8 cm2) kullanarak her şey aseptik 1 mL tekniği. İstenen hücre yoğunluğu ulaşana kadar Örneğin, <ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><ol><li><li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li></li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li><li><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg"></li></ol>

<ol><li>Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yoshinori+Ohsumi%27s+Nobel+Prize+for+mechanisms+of+autophagy%3A+from+basic+yeast+biology+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Coll+Physicians+Edinb%22%5BJournal%5D)">Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential.</a> J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exponential+growth+of+autophagy-related+research%3A+from+the+humble+yeast+to+the+Nobel+Prize%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize.</a> FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).</li>
<li>Seglen, P. O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25576638">Macroautophagic cargo sequestration assays.</a> Methods. 75, 25-36 (2015).</li>
<li>Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3743649">Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway.</a> Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).</li>
<li>Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+dependence+of+different+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelysosomal+convergence+of+autophagic+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways.</a> Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).</li>
<li>Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase-dependent+effects+of+okadaic+acid+on+hepatocytic+autophagy+and+cytoskeletal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity.</a> Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Szalai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+bulk+sequestration+of+cytosolic+cargo+is+independent+of+LC3%2C+but+requires+GABARAPs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs.</a> Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> J Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+human+cells+lacking+ATG8+proteins+uncovers+roles+for+GABARAPs+and+the+CCZ1%2FMON1+regulator+C18orf8%2FRMC1+in+macro+and+selective+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux.</a> Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonselective+autophagy+of+cytosolic+enzymes+by+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes.</a> J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).</li>
<li>Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins%3A+a+class+of+inhibitors+of+membrane+ATPases+from+microorganisms%2C+animal+cells%2C+and+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).</li>
<li>Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+assay+of+pyruvic+and+lactic+acids.+A+definitive+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure.</a> Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).</li>
<li>Bergmeyer, H. U., Bernt, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis+%282nd+English+ed%29%22">Methods of enzymatic analysis (2nd English ed)</a>. Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).</li>
<li>Engedal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intracellular+calcium+homeostasis+blocks+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation.</a> Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).</li>
<li>Luhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Cargo+Sequestration+Assay+for+Quantitative+Measurement+of+Nonselective+Autophagy+in+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells.</a> Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).</li>
<li>Mousavi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibitors+of+the+vacuolar+proton+pump+on+hepatic+heterophagy+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy.</a> Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Methyladenine%3A+specific+inhibitor+of+autophagic%2Flysosomal+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).</li>
<li>Ronan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+potent+and+selective+Vps34+inhibitor+alters+vesicle+trafficking+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy.</a> Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).</li>
<li>Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+j%22%5BJournal%5D)">Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+assays+for+mammalian+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Sequestration assays for mammalian autophagy.</a> Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).</li>
<li>Hurley, J. H., Young, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28301741">Mechanisms of Autophagy Initiation.</a> Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).</li>
<li>Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin%2C+a+tumor+promoter%2C+discharges+intracellular+Ca2%2B+stores+by+specific+inhibition+of+the+endoplasmic+reticulum+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).</li>
<li>Kuma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autophagy+during+the+early+neonatal+starvation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of autophagy during the early neonatal starvation period.</a> Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+starvation-induced+and+constitutive+autophagy+in+Atg7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice.</a> J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9a+controls+dsDNA-driven+dynamic+translocation+of+STING+and+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7140848">Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization.</a> Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>An, H., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+ribophagy+in+human+cells+reveals+bystander+flux+during+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy.</a> Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).</li>
<li>Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+support+production+of+starvation-induced+autophagosomes+but+not+their+targeting+and+fusion+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).</li>
<li>Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Atg2+proteins+are+essential+for+autophagosome+formation+and+important+for+regulation+of+size+and+distribution+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).</li>
<li>Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+activity+measured+in+whole+rat+hepatocytes+as+the+accumulation+of+a+novel+BHMT+fragment+%28p10%29%2C+generated+in+amphisomes+by+the+asparaginyl+proteinase%2C+legumain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain.</a> Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).</li>
<li>Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+cytoplasmic+enzymes+in+an+autophagic+vacuole-lysosomal+system+induced+by+injection+of+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin.</a> J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Ogier-Denis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotrimeric+Gi3-protein+controls+autophagic+sequestration+in+the+human+colon+cancer+cell+line+HT-29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29.</a> J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%5B3H%5Draffinose+as+a+specific+probe+of+autophagic+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration.</a> Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).</li>
<li>Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Long-lived+Protein+Degradation+Assay%3A+an+Efficient+Method+for+Quantitative+Determination+of+the+Autophagic+Flux+of+Endogenous+Proteins+in+Adherent+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines.</a> Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).</li>
<li>Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+protein+degradation+through+the+cell+cycle+of+human+NHIK+3025+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro.</a> Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+lysosomal+pathway+of+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes+by+ammonia%2C+methylamine%2C+chloroquine+and+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin.</a> Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valine+uptake+and+incorporation+into+protein+in+isolated+rat+hepatocytes.+Nature+of+the+precursor+pool+for+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis.</a> Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).</li>
<li>Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+of+autophagic+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assaying of autophagic protein degradation.</a> Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).</li>
<li>Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+of+cytoplasmic+bulk+cargo+does+not+require+LC3%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3.</a> Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Özetle, burada açıklanan protokol memeli hücreleri toplu autophagic haciz etkinliğini izlemek için güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem temsil eder. Orijinal yöntemi12,16için karşılaştırıldığında, biz gereksiz adımları bir dizi kaldırıldı, kalan adımları birkaç Basitleştirilmiş ve önemli downscaling tanıttı. Sonuç olarak, protokol maliyet ve zaman-verimliliği ile ilgili olarak, büyük ölçüde artırıldı ve örnekleri aynı miktarda şimdi özgün protokolü...

Autophagy (Yunanca "kendi kendine yemek" için) hücre içi malzeme katmaninin/lizozomal bozulması için evrimsel korunmuş bir süreçtir. Autophagy Maya ve insanlar için önemli olan autophagy ile ilgili ("ATG") genlerin keşfi üzerine ve gerçekleşme bu autophagy insan sağlığı ve hastalıkları (2016 yılında Nobel Tıp veya Fizyoloji için tarafından kabul önemli bir rol oynar Yoshinori Ohsumi), autophagy hızla hücre biyoloji1,2en yoğun okudu işlemlerden biri haline gelmiştir.
(Bundan sonra "autophagy" anılacaktır) Macroautophagy genişleme karakterize ve katlama hücre içi membran cisternae ("phagophores"), etkili bir şekilde çekilmek en kapalı, çift veya çoklu membrane yapılar ("autophagosomes") sitoplazma geri enwrapped malzemesi. Organellerin ile autophagosomes füzyonu, iç autophagosomal membran ve münzevi kargo bozulmuş ve geri dönüşümlü. Autophagosomes rasgele (non-selektif autophagy) ve seçici (seçici autophagy) görgü sitoplazmik malzeme çekilmek olabilir. Toplu autophagy büyük olasılıkla a karıştırmak-in non-selektif ve seçici autophagy temsil eder.
1960 ve 70 's ("morfolojik dönemi" autophagy araştırma) autophagic haciz ultrastructural analizler esas olarak değerlendirildi. 1980 yılında ve başında 1990 ("biyokimyasal dönemi") başına Seglen ve iş arkadaşları — kim okudu birincil fare tetkikine autophagy — kantitatif autophagic haciz aktivitesi3ölçmek için ilk yöntemleri geliştirilmiştir. Bu deneyleri kullanarak, Seglen tanımlanan ve lizozomal autophagic yolu4,5farklı adımları ile karakterize, keşfetti ve amphisome6 (endosome-autophagosome füzyon ürün) icat ve ilk için protein fosforilasyon autophagy yönetmelik7rolünü açıklar. Ancak, ATGs ("moleküler dönemi") 1990'ın keşfi ve bir memeli ATG8 protein ilk karakterizasyonu sonra Mikrotubul ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3) 20008, ATG proteinler için işaretleyici olarak kullanımı autophagic süreci hızla popülerlik kazandı ve büyük ve daha zahmetli biyokimyasal Yöntemler geride. Aslında, son 18 yıldır, Batı leke ve floresan mikroskopi analizleri LC3 farkla en popüler hale gelmiştir (ve birçok sadece durumda) autophagy memeli hücrelerinde okuyan anlamına gelir. Bu yöntemler tarafından gerçekleştirilebilecek göreceli kolaylığı avantajdır. Bunu bir sepeti bileşeni (LC3) yerine gerçek autophagic kargo okuyor dezavantajdır. Devletler ve/veya LC3 akı karşı haciz yolu ile ve akı kargo arasındaki ilişki son derece belirsiz olduğundan oldukça ciddi bir dezavantaj, budur. Aslında, biz toplu kargo akı koşullar altında yüksek düzeyde muhafaza edilmesi göstermiştir hücreleri9konjuge LC3 varlığı rağmen hiçbir LC3 akı olduğu. Ayrıca, bu toplu autophagy verimli LC3 tükenmesi tarafından etkilenmez ve bu nedenle büyük olasılıkla LC3 bağımsız9gösterdi. Bu bulgu da Parkin bağlı mitophagy (mitokondri seçici autophagy) LC310,11 bağımsız olduğunu belirtmek LC3 knock-out çalışmalar10,11tarafından daha sonra doğrulanmıştır .
Özet olarak, açık bir işte deneyleri için kargo tabanlı autophagic etkinliğini izlemek gerekir. En iyi şekilde bu tür deneyleri geniş uygulanabilir, iyi tanımlanmış ve gerçekleştirmek kolay olmalıdır. Son birkaç yıl içinde biz 1980 's12' başına Seglen tarafından geliştirilmiş ve sitozolik karaciğer aktarmak sedimentable, autophagic çarpıtması içeren hücreye ölçme üzerinde dayanır karaciğer haciz tahlil özel bir ilgi almış kesirler. Karaciğer phagophores sitoplazmik kargo enwrap yükleyen kolayca ortak münzevi bir istikrarlı, çözünür sitozolik protein var. Haciz karaciğer, bu nedenle autophagic haciz genel bir ölçüsüdür. Karaciğer lizozomal autophagic yolu12tarafından özel olarak düşer. Böylece, huzurunda lizozomal bozulması inhibitörleri, Örneğin, bafilomycin A1 (Baf)13, deneysel tedavi etkileri doğrudan autophagic haciz etkinliğinde değişiklikleri yansıtmak. Bozulma inhibitörleri yokluğunda, karaciğer tutma ve yıkımı net etkisi ölçülebilir.
Karaciğer haciz tahlil geniş uygulanabilir, çünkü karaciğer son derece ve ubiquitously tüm hücre tiplerinde ifade edilir ve karaciğer düzeyleri doğru bir enzimatik tahlil14,15tarafından sayısal. Ancak, orijinal protokol12 — birincil fare tetkikine kurulan — oldukça zaman alıcı ve malzeme gibi bir ısmarlama elektrik deşarj kapasitör başlayan yüksek bir miktar gerekli. Step-wise bir şekilde yavaş yavaş kolay ve çok yönlü bir yöntem tahlil dönüştürdü. İlk olarak, özgün iletişim kuralını kullanmak üzere memeli hücre hatları16uyarlanmıştır. İkinci olarak, Yöntem önemli ölçüde downscaled3,9yaşındaydım. Üçüncü, zahmetli yoğunluğu hava yastığı da dahil olmak üzere17adım, protokol birkaç adımda elendi. Bu aynı anda bir daha da bir 10 cm tabak örnek16 başına 12-şey plaka (yaklaşık 15-fold daha az başlangıçyani, örnek başına tek bir kuyu kullanmaya kullanarak özgün başlangıç noktasından Yöntem downscaling etkin malzeme)17. Dördüncü olarak, özel yapım elektrik deşarj kapasitör17yerini alabilir bir ticari Elektroporasyon aparatı tespit edilmiştir.
Burada bizim en güncel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında daha önce yayımlanmış17 yönteminin bazı daha fazla basitleştirme içerir karaciğer haciz testin sunulur. Ayrıca, farklı hücre türleri bir dizi elde edilen tipik sonuçlar kümesi gösterilir ve önemlisi, farmakolojik hem de genetik nakavt ve nakavt yaklaşımları kullanarak yöntemi deneysel doğrulamaları birkaç satırlık sağlanmaktadır. İçin genel bir akış düzeni tüm iletişim kuralı bkz: Şekil 1.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 ve 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plakalar&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax&nbsp; hücre ayırma çözümü</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>A7089</td><td>Alikotları -20 °C'de tutun; C yıllarca ve buzdolabında birkaç ay</td></tr><tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>BJ hücrelerinde</td> çözün <td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>geçişte kullanım < 30</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Burker sayma odası</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Burker sayma odası</td> <td>için kapak camıFisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Kriter Tris-HCl Jel, 4&ndash; %20, 26 kuyulu, 15 ve mikro; U, 13,3 cm x 8,7 cm (G x U)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Earle'ün dengeli tuz çözeltisi (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>conatainler %0.1 glikoz</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Üstel bozunma dalgası elektroporatörü</td><td>BTX Harvard Aparat</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F7524</td><td>RPMI 1640 orta HEK293 hücrelerinde% 10 nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>65 mM'lik bir çözelti otoklavlayın ve aylarca buzdolabında saklayın</td></tr><tr><td>İnkübatör; Autoflow IR Doğrudan Isı CO2 inkübatörü</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>LNCaP hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>geçişte kullanım < 30</td></tr><tr><td>3-Metil Adenin (3MA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>-20 ° C.&nbsp; Stoku 65 °C'ye ısıtın; 10 dakika boyunca C ve 10 mM son konsantrasyonda kullanın</td></tr><tr><td>Buzdolabına Dayanıklı Mikrosantrifüj</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak mod fonksiyonlu Buzdolabına Dayanıklı</td><td>Mikrosantrifüj Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307 hidroklorür (ULKi)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>ULK kinaz aktivitesini inhibe eder. DMSO'da çözün.</td></tr><tr><td>MaxMat Multianalyzer cihazı</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları 3 (0,5-20 &mikro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART Bariyer uçları</td></tr><tr><td>Pipet uçları (1-200 ve mikro; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2207 & nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları</td></tr><tr><td>Pipet uçları (100-1.000 & mikro; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2355 ve nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları</td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kiti</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>Steril H2O'da 1 mg/mL stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm -20 ° C'de stabildir; C en az 1 yıl.</td></tr><tr><td>Pirüvat</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 hücreleri (hTERT RPE-1)ATCC</td><td></td> <td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>Fosfoinositid 3-kinaz sınıf III'ü (PIK3C3) inhibe eder. DMSO'da çözün.</td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi Negatif Kontrol #1 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi ATG9 hedefleme siRNA (siATG9A)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi FIP200 hedefleme siRNA (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi ULK1 hedefleme siRNA (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi ULK2 hedefli siRNA (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi GABARAP hedeflemeli siRNA (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi GABARAPL1 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi GABARAPL2 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik dihidrat (NaH<alt>2</alt>PO4 ve boğa; 2H<alt>2</alt>O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat (Na2HPO4 & boğa 2H2O )&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>Suda% 10 nihai konsantrasyon; 0.45 ve mikrodan süzün; m filtre edin ve aylarca buzdolabında saklayın</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td>, <td>SERCA ER Ca2+ pompasını engeller. DMSO'da çözün.</td></tr><tr><td>Triton X-405 ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>%1 final</td></tr><tr><td>Tripan Mavi leke %0,4</td> <td>Moleküler Problar</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25 w/v Tripsin)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>%0,01 final</td></tr></tbody></table>

laktat dehidrogenaz haciz tahlil — toplu autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir yöntem

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Toplu autophagy sitoplazma büyük bölümlerini haciz autophagosomes olarak adlandırdığı çift/multi-membrane yapılar ile karakterizedir. Bu işlem izlemek için basit bir protokol burada açıklanmıştır. Ayrıca, tipik sonuçları ve deneysel doğrulama yönteminin çeşitli kültürlü memeli hücreleri autophagy indükleyici koşullarda temin edilmektedir. Toplu autophagy sırasında sitozol ve böylece aynı zamanda diğer autophagic kargo yanında çözünen sitozolik protein autophagosomes çekilmek. Karaciğer bir istikrarlı ve son derece seçici olarak sigara autophagosomes gizlediği bol, çözünür sitozolik enzim var. Karaciğer haciz miktarını bu nedenle toplu autophagic haciz miktarını yansıtır. Verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde karaciğer haciz hücreleri belirlemek için çalışan sayımız sitozolik karaciğer, ölçüm enzimatik sedimentable faaliyete ardından etkili sedimentable ayıran bir electrodisruption tabanlı ayırma iletişim kuralı Bütün hücre örnekleri karşı kesirler. Autophagic haciz sedimentable karaciğer içinde bu işlem görmüş hücreleri tedavi edilmezse hücrelerdeki oranı çıkarılarak belirlenir. Karaciğer haciz tahlil bu ya haciz probları veya yarı kantitatif proteaz ektopik ifade dahil diğer yöntemleri karşı endojen kargo autophagic haciz nicel bir ölçü verir avantajdır koruma analizleri autophagy işaretleri veya reseptörleri.

İletişim kuralını kullanarak açıklanan burada, birkaç farklı memeli hücre satır, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, dahil olmak üzere toplu autophagic haciz etkinliğinde MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ ve LNCaP hücreleri ölçülür. Haciz (tam, besin açısından zengin ortamda) Bazal koşullar altında değerlendirilen veya hücrelerin içinde akut serum ve amino asitler (bir bona fide autophagy indükleyici koşulu<sup ...

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Bu yöntem, otofagozom oluşumunun nasıl düzenlendiği ve çeşitli hücre tedavilerinin ve koşullarının toplu otofobiyi nasıl etkilediği gibi otofaji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, endojen yük sekestrasyonunu ölçmesidir. Bu nedenle, yöntem geniş çapta uygulanabilir ve yapay aşırı ekspresyondan veya kargo problarının tanıtılmasından bağımsızdır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencileri Paula Szalai ve Morten Luhr olacak. Başlamak için, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 75 santimetre karelik doku kültürü şişelerinde kültür yapışkan hücreleri. Hücrelerin, birleşen bir hücre katmanına yakın bir hücre katmanına ulaşana kadar büyümesine izin verin.Bundan sonra, hücreleri pH 7.4'te 37 santigrat derecede üç mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve üç mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile değiştirin. Hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.Daha sonra,% 10 FBS içeren yedi mililitre kültür ortamında hücreleri yeniden süspanse edin ve steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. 0,5 ila 20 mikrolitrelik bir pipet ucu ku

the-lactate-dehydrogenase-sequestration-assay-simple-reliable-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, laktat dehidrojenaz enzimi kullanılarak hücre lizatlarında laktat ölçümü için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır. Bu enzim, NAD'nin tetrazolyum boyalarla reaksiyona giren NADH'ye dönüştürülmesiyle birlikte laktatı piruvata dönüştürür ve laktatı kantitatlamak için spektrofotometrik olarak ölçülebilen renkli bir ürün verir.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Video, memeli hücrelerinde toplu otofajik sekestrasyon aktivitesini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Laktat dehidrojenaz (LDH) dahil olmak üzere sitozolik proteinleri serbest bırakmak için elektroporasyon kullanır. Sekestre LDH ve toplam hücresel LDH fraksiyonları, LDH sekestrasyonunu değerlendirmek için belirlenir ve genel toplu sekestrasyon aktivitesi hakkında bilgi sağlar.

Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol...

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Pyrosequencing (R) polimorfizmleri analiz için kullanılan, bugüne kadarki en kapsamlı ama basit yöntemlerle biridir. Bu yöntem, birçok klinik olarak ilgili polimorfizmleri dahil olmak üzere, hızlı ve verimli bir tek nükleotid polimorfizmi değerlendirme yol açmıştır. Pyrosequencing tekniği ve metodoloji açıklanmıştır.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Öğrenin, laktat dehidrogenaz haciz tahlili ile memeli hücrelerinde toplu otofajik haciz etkinliğini ölçün. Bu yöntem, endojen kargo hapsedilmesini yapay problere gerek kalmadan güvenilir şekilde değerlendirir.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem (Video) | JoVE Journal

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Daha fazla video keşfet