Name: N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h+ Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin, Raphanus sativus çeşitlerinden N-glukanların PNGase H+ ile hızlı hazırlanması ve analizi için basit bir yöntem. Bu teknik, tampon değişimi gerektirmeden enzimatik salınım ve türevleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen Çin doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (sayı 31471703, A0201300537 ve 31671854 J.V. ve ll, G.Y. için sayı 31470435 izni grant) ve 100 yabancı yeteneklerini planı (grant sayıya JSB2014012 J.V.).

1. örnek koleksiyonu
<ol><li>Taze turp (Raphanus sativus L.) farklı çeşitlerin satın.</li>
</ol>2. izolasyon-in Protein turp
<ol><li>10 dakika için bir mutfak blender ile yaklaşık 100 gr taze turp lunaparkçı.</li>
	<li>Bulamaç 50 mL santrifüj tüpü ve santrifüj 14.000 × g çözünmez malzeme çıkarmak 20 dk için 4 ° C'de de aktarın.</li>
	<li>Süpernatant dikkatli bir şekilde yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarmak ve 2 M trichloroacetic asit (TCA) çözüm eşit bir hacmi ekleyin. Not: TCA ekleme çözünür (glyco) proteinler çökelti.</li>
	<li>14.000 × g 30 dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant pelleted (glyco) proteinler kaldırın.</li>
	<li>14.000 × g çözünür oligosakkaritler ve polisakkaritler kaldırmak 5 min için 4 ° C'de, Pelet 20 mL deiyonize su ve santrifüj ile yıkayın.</li>
	<li>2.5 arasındaki adımları yineleyin. dört kez.</li>
	<li>Granül 1 ml deiyonize su ve taze 1,5 mL santrifüj tüpü transfer yeniden askıya alma.</li>
</ol>3. N- glukanlardir hazırlanması
<ol><li>Mix 50 µL protein çözüm adım 2.7. (5 g taze turp eşit) 0.2 mU rekombinant PNGase h+ 10 mM asetik asit ile.</li>
	<li>Reaksiyon karışımı için 12 h 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka sonra santrifüj kapasitesi 14.000 × g ekstra protein ve enzim kaldırmak 5 min için de.</li>
	<li>Süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
</ol>4. N- glukanlardir arınma
<ol><li>N- glukanlardir zenginleştirmek ve N- glycan için fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) etiketleme Aracısı selectivity artan tepki karışımından tuzları ve diğer kirleri çıkarmak için katı fazlı ayıklama (SPE) sütun hazırlamak derivatization.<ol>
<li>3 mL deiyonize su sütun yıkamak için ekleyin.</li>
		<li>Trifluoroacetic asit (TFA, % 0,1 v/v) etkin içeren % 80 Asetonitril çözüm 3 mL SPE-sütun ekleyin.</li>
		<li>3 mL deiyonize su SPE-sütun equilibrate ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek adım 3.3 sütuna aktarmak ve akışı aracılığıyla atın.</li>
	<li>1.5 mL deiyonize su sütun yıkayın ve akışı üzerinden atmak için ekleyin.</li>
	<li>Yayımlanan N- glukanlardir 1.5 mL %0,1 içeren sulu % 20 Asetonitril çözüm kullanarak sütundan elute TFA (v/v) 2 mL santrifüj tüpü içine.</li>
	<li>Çözücü, oda sıcaklığında santrifüj buharlaşma çıkarın. Örnek tamamen kuru olana buharlaşır.</li>
</ol>5. floresan Derivatization, N- glukanlardir
<ol><li>1 mL dimetil sülfoksit/asetik asit solüsyonu (7:3, v/v) 35 mM 2-AB ve 0.1 M sodyum cyanoborohydride oluşan 2-AB çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>2-AB çözüm kurutulmuş örnekleri (adım 4.5.) 5 µL altı farklı turp türetilmiş ekleyin. Girdap her örnek kadar tamamen dağıldı.</li>
	<li>65 ° C'de 2 h için karışım kuluçkaya</li>
	<li>5 min için örnek soğumaya aşağı oda sıcaklığına ve 5 µL deiyonize su ve Asetonitril 40 µL ekleyin. 14.000 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>48 µL süpernatant 300 µL yüksek-kurtarma HPLC şişe aktarın. Derivatized N- glycan örnekleri-20 ° c ilâ bir ay için saklayın.</li>
</ol>6. HILIC UPLC N- glukanlardir profil oluşturma
<ol><li>Bir online floresan detectorset 330 nm/420 nm, uyarma/emisyon dalga boylarında, sırasıyla bağlı standart bir UPLC sistem kullanarak örnekleri analiz.</li>
	<li>Hidrofobik etkileşim sıvı kromatografi (HILIC) kullanın-60 ° c analizi için bir sütun ısıda UPLC glycan sütun.</li>
	<li>Çözelti A hisse senedi çözüm (1 M amonyum Formiat çözüm, pH 4.5) 50 mL sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LCMS) 950 mL ile sulandrarak hazırlamak-sınıf su. Hisse senedi çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın:<ol>
<li>Formik asit 43 mL LCMS-grade H2o 700 mL için eklemek</li>
		<li>PH 4.5 için dropwise buna ek olarak sulu amonyak çözüm (% 25 w/w) tarafından ayarlayın.</li>
		<li>Çözücü bir ölçüm silindir aktarmak ve 1000 mL 3 aya kadar LCMS-grade H2o mağaza 4-6 ° c ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LCMS-grade Asetonitril solvent B. kullanın</li>
	<li>N- glukanlardir ile aşağıdaki degrade elüsyon ayırın:<ol>
<li>Çözücü B % 95'i solvent A. küme akış hızı 0.5 mL/dk 0 ile 44,5 min için ekleyerek başlayın.</li>
		<li>6 dk 0 dk yavaş yavaş çözücü B doğrusal degrade to78% oranını azaltmak.</li>
		<li>44,5 dk 6 dk yavaş yavaş çözücü B %55.9 doğrusal gradyan ile oranını azaltmak.</li>
		<li>44,5 min 46,5 dk dan hızla çözücü B %0 %55.9 doğrusal gradyan ile oranını azaltmak ve %0 2 min için tutun ve çamaşır sütun başlatın. 0.25 mL/dk akış oranını 44.5 üzerinden 55 dk. için azaltmak.</li>
		<li>Çözücü B %95 50,5 dk 48,5 dk dan artırarak daha fazla sütun yıkama ve %95 4,5 dakika tutun.</li>
		<li>Sütun % 95 çözücü B 0.5 mL/dk başlangıç koşulları 50,5 57 dk dan yeniden equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek 45 µL UPLC sistemi içine enjekte.</li>
	<li>15 ila 40 dk arasında saklama süreleri ile N- glukanlardir UPLC tarafından elute.</li>
	<li>2 mL santrifüj tüpleri kullanarak her gözlenen UPLC tepe kısmını toplamak ve örnekler santrifüj buharlaşma tarafından kuru.</li>
	<li>2-AB dextran standart (2−20 glikoz birimleri) bitki -N- glycan profil oluşturma kalibre ve onların elüsyon kez standart glikoz birimlerine atamak için etiketli yaklaşık 1 pmol enjekte.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS Analizi
<ol><li>Adım 5 6,8 µL LCMS, örneklerinden çözülür-sınıf su. Mix 1 µL örnek çözümü ve 6-aza-2-thiothymine (ATT) çözüm (% %0,3 70 v/v sulu Asetonitril içinde w/v) ve pipet MALDI-TOF örnek taşıyıcı üzerine karışımı 1 µL.</li>
	<li>Başlat düğmesine basarak pozitif iyon modunda bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre enstrüman kullanarak örnekleri analiz.</li>
	<li>Kitle spectra eşlik eden MALDI-TOF-Bayan analiz yazılımı kullanarak analiz.</li>
	<li>Bir açık kaynak glycan yorumu yazılım19kullanarak spectra yorumlamak. 2-AB [M + Na]+, etiketleme, arama parametrelerini belirlemek ve 2.0 Da doğruluk parametresini ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz burada sundu iletişim kuralı turp çeşitli çeşitlerin N- glycan profilleri karşılaştırmasını sağlar. Varolan iletişim kurallarına göre bu yöntemin önemli bir avantaj enzimatik serbest bırakmak-in N- glukanlardir ve derivatization reaksiyon 2-AB ile arasında hiçbir arabellek değişiklikleri gerekli olmasıdır. N- glukanlardir tuzları kaldırmak için başarısızlık olarak SPE sütun kullanarak arıtma, bu yordamın en önemli adımdır veya diğer kirleri tepki karışımı floresan derivatization verimliliği...

Önceki araştırma N- glukanlardir Alerjik yanıt-e doğru1,2 kışkırtmak immünolojik cross-reactions potansiyel bir kaynak vurgulanmış bulunmaktadır olarak N- glukanlardir tesislerinde son yıllarda artış dikkat çekiyor . N- glukanlardir bitki glikoproteinlerin üzerinde katalitik aktivitesi3,4, thermostability ve katlama5,6 veya hücre altı yerelleştirme etkileyebilir daha önce kanıtlanmıştır ve salgı7. Glycan yapıları ile ilgili işlevleri ilişkilendirmek için N- glukanlardir ilk glikoproteinlerin kimyasal veya enzimatik yayımlanması gerekir. N- ve O- glukanlardir serbest bırakmak için klasik kimyasal yöntem β-hangi azaltma borhidrür alditol8verim ile alkali örnek tedavi eşlik eder, ortadan kaldırılmasıdır. Ancak, bu yordamı bir fluorophore ile etiketleme önler ve yaşam üniteleri önemli çürüme azaltmak glycan yapısı sonundan itibaren neden olur. Kimyasal deglycosylation amonyum hidroksit/karbonat tedavisine göre de yaygın olarak kullanılan alternatif yöntem9' dur. Bu kimyasal ürün yöntemlerin hiçbiri sağlam proteinler, aynı kitle aralıkta etiketlenmemiş glycan havuzları peptid parçaları müdahale olmadan kitle spektrometrik analizi sağlayan alçaltır. Ancak, bu yöntemlerin bir dezavantajı artan bozulma α1, 3-fucosylated N- glukanlardir, ortak bir karbonhidrat yapısı bitkiler10içinde bulunan oranıdır. Alternatif olarak, peptid kullanarak tekrar tekrar enzimatik yayın yöntemleri:N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) de yaygın olarak uygulanan. Rekombinant PNGase F (dan Flavobacterium meningosepticum) en yaygın seçim ve N- glukanlardir, taşıyan bir çekirdek α1, 3 fucose11,12yapıları dışında her türlü yayın izin verir. Bu nedenle, PNGase A (badem tohumları izole) genellikle bitki N- glukanlardir13analizi için kullanılır. Ancak, bu enzim deglycosylates sadece proteolytically elde edilen glycopeptides ve deglycosylate yerel glikoproteinlerin14' e değiştiremiyor. Bu nedenle, bir çok adımlı örnek testleri daha geniş glukanlardir, özellikle de düşük bereket15kaybolmasına neden analiz daha önce gereklidir. Yöntem genel amacı basit ve sağlam bir şekilde etiketleme floresans ve N- glycan sürümü için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sunmaktır. PNGase H+, geçtiğimiz günlerde Terriglobus çevresi keşfedilmiştir ve recombinantly E. coliifade edilebilir, N- glukanlardir doğrudan doğruya--dan içinde asidik protein iskele hidrolize temel mantığı olduğunu koşullar16. PNGase H+ üzerinde alternatif yöntemler kullanarak bir anahtar tepki arabellekleri17,18değiştirmeden floresan etiketleme tepkiler aynı tepki tüp içinde gerçekleştirilebilir bir avantajdır. Bu yöntem basit hazırlık koşulları ve yüksek düşük-bereket oligosakkaritler kurtarılması N- glukanlardir analizinde değerli bir araç olun. Bu iletişim kuralı, N- glukanlardir çeşitli bitki türleri üzerinden analizi için uygundur.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Kimyasallar: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Trikloroasetik asit & nbsp;</td><td>SCR, Şanghay</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit buzul</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Genel reaktif</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Enerji kimyasal</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamid</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborohidrit</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB etiketli dekstran merdiven, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-tiyotimin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Araçlar / Malzemeler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mutfak blender</td><td>Ayı, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Techcomp</td><td></td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Evaporatör</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE sütunu</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE sütunu</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF kütle spektrometresi</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Analizi: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek geri kazanımlı HPLC flakon</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sistemi</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>HPLC için Floresan Dedektörü</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sütun fırın</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sütun</td><td>Suları</td><td>Doğruluğu UPLC BEH glikan sütunu</td><td>2.1 & kez; 150 mm, 1.7 & mu; m parçacık boyutu</td></tr><tr><td>LCMS dereceli Su</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS dereceli Asetonitril</td><td>Merck Millipore</td> <td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak çözeltisi</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

n- glukanlardir raphanus sativus çeşitlerin kullanarak pngase h+ analizi

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Onlar cross-reactive, Anti kışkırtan bağışıklık yanıtı potansiyel bir kaynak olarak son yıllarda büyük ilgi, bitkilerin karbonhidrat moieties aldık. Buna ek olarak, karbonhidrat yapıları da bitki metabolizmasında kritik bir rol oynamaktadır. Burada, hazırlama ve N- glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden bir N- glycanase özel bitki kaynaklı karbonhidrat yapılarının sürülmesi kullanarak analiz için basit ve hızlı bir yöntem mevcut. Bunu başarmak için ham trichloroacetic asit precipitates turp homogenates, PNGase H+ile tedavi ve 2-aminobenzamide floresan etiket olarak kullanarak etiketli. Etiketli N- glycan örnekleri daha sonra ultra performans sıvı kromatografi (UPLC) ayırma ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma-uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi detaylı yapısal için süreyi tarafından analiz edildi değerlendirme ve N- glycan turp elde edilen yapıların göreli abundancies ölçmek için. Bu protokolü de N- glukanlardir diğer çeşitli bitki tür analizi için kullanılabilir ve daha fazla araştırma yapılması işlev ve N- glukanlardir insan sağlığı üzerindeki etkileri için yararlı olabilir.

Şekil 1 açıklanan protokol yalıtım proteinlerin (glyco-) turp, N- glukanlardir hazırlanması, UPLC analiz ve bu bileşenleri MALDI-TOF-Bayan analizi de dahil olmak üzere, şematik bir dökümünü gösterir. Şekil 2 derivatized N- glukanlardir analiz turp çeşitlerin temsilcisi UPLC chromatograms gösterir. Şekil 3 2AB-derivatized N- glycan yapıları MALDI-TOF-Kütle spektrometresi kul...

Biz hazırlık ve N- glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden analizi için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h+ Analizi

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Bu yöntem, bitki kökenli N-glikanların nasıl hızlı bir şekilde analiz edilebileceği ve karakterize edilebileceği gibi bitki Glikobilimi alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, N-glikanların enzimatik salınımı ile 2-aminobenzamid ile türevlendirme reaksiyonları arasında herhangi bir tampon değişikliği gerektirmemesidir. Prosedürü gösteren Bayan Ya-Min Du ve Bayan Shen-Li Zhen olacak; Nanjing Ziraat Üniversitesi'ndeki Glikomik ve Glikan Biyomühendislik Araştırma Merkezi'nden iki yüksek lisans öğrencisi.Proteinleri izole etmeye başlamak için, yaklaşık 100 gram taze turpu on dakika boyunca homojenize etmek için bir mutfak blenderi kullanın. Elde edilen bulamacı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Çözünmeyen malzemeyi çıkarmak için 20 dakika boyunca dört santigrat derecede yerçekiminin 14.000 katında santrifüjleyin.Bundan sonra, süpernatanı dikkatlice 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Eşit miktarda iki molar trikloroasetik asit çözeltisi ekleyin. 30 dakika boyunca dört santigrat derecede 14.000 kez yerçekiminde santrifüjleyin.Ve sonra süpernatanı çıkarın. Peleti 20 mililitre deiyonize su ile yıkayın. Çözünür oligosakkar

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz, memeli hücrelerinde biyosentezi sonra glikoproteinler erken ömrü boyunca N-bağlı glukanlardır değişiklik analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu darbe-kovalamaca metabolik etiketli glukanlardır, glikoproteinler ve HPLC ile incelenmesi enzimatik serbest analizi ile elde edilir.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Öğrenin, Raphanus sativus çeşitlerinden N-glukanların PNGase H+ ile hızlı hazırlanması ve analizi için basit bir yöntem. Bu teknik, tampon değişimi gerektirmeden enzimatik salınım ve türevleme sağlar.

N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h⁺ Analizi

Daha fazla video keşfet