Name: Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Keşfedin fare birincil motoneuron izolasyonu ve transfeksiyonu yöntemini, Charcot Marie Tooth hastalığı modellemesi için. Bu teknik nörodejeneratif mekanizmaları incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

"Derneği pour le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquier'ın bursu ve AFM-Telethon için MyoNeurAlp stratejik planı ile verdiği destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul ve Doktor Georg Haase, geliştirme ve teknik geliştirme katılan ve onların bilgi yaymak teşekkür etmek istiyorum.

Hayvanları içeren tüm işlemleri kurum etik kurul tarafından kabul edildi.
1. çözüm hazırlık
<ol><li>10 mL % 4 BSA L-15 ortamda diyaliz hazırlayın.<ol>
<li>Sığır serum albümin toz % 4 (w/v) 10 mL L-15 orta geçiyoruz.</li>
		<li>20 mL diyaliz kaset 20 kDa kesme ile çözüm ekleyin. Ajitasyon 4 ° C'de altında 3 gündür L-15 orta karşı 500 mL diyaliz L-15 orta her gün değiştirin.</li>
		<li>Çözüm bir 0,22 µm membran ve aliquot 15 mL tüpler aracılığıyla filtre. Tüpler-20 ° C'de depolayın Not: Bu iletişim kuralı aşağıdaki başvuru kullanır: değiştirilmemiş ham L-15 orta L-15 orta, asidik L-15 orta = pH L-15 ve temel L-15 orta = bikarbonat L-15 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 mL pH L-15 hazırlayın.<ol>
<li>L-15 orta pH ayarlama: önce yıkama şişe bazı parçalarını kuru buz ile doldurun. Turuncu rengi yaşına gelene kadar gaz (CO2) L-15 orta enjekte (~ pH 6.4 ve ~ 40 baskılar). Standart pH metre ile pH da ayarlanabilir.</li>
		<li>Orta bir 0,22 µm membran ve mağaza 4 ° C'de aracılığıyla bir ay için filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bikarbonat L-15 100 mL hazırlayın.<ol>
<li>L-15 orta için 97,5 mL 2.5 mL % 7 sodyum bikarbonat ekleyin ve 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPCS (insülin Putrescin Conalbumin selenit) takviyeleri hazırlayın.<ol>
<li>İnsülin 0.5 ml 0.1 M HCl. Ekle'yi çift distile su 4.5 mL 2.5 mg geçiyoruz.</li>
		<li>Putrescine 5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) 8 mg geçiyoruz.</li>
		<li>100 mg conalbumin 10 ml PBS çözülür.</li>
		<li>1 mg Sodyum selenit 19.3 mL su içinde dağıtılması, pH 7.4 için ayarlamak ve çözüm 10 kat oranında seyreltin.</li>
		<li>1 mL insülin çözeltisi, 1 mL putrescine çözeltisi, conalbumin 1 mL ve 0.1 mL Sodyum selenit çözeltisi 3.1 mL IPCS ek çözüm elde etmek için birleştirir. Çözüm-20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,02 mM progesteron çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Progesteron % 80 etanol 1.6 ml 1 mg geçiyoruz.</li>
		<li>Çözüm 100-fold içinde % 100 etanol sulandırmak ve -20 ° C'de saklayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mL tam L-15 orta hazırlayın.<ol>
<li>1,8 mL D-glukoz çözeltisi (200 mg/mL) pH 3.5 mg/mL nihai bir konsantrasyon glikoz elde etmek için L-15 92 mL için ekleyin.</li>
		<li>1 mL / 100 birleştirmek penisilin-streptomisin x (10.000 U/mL), ısı inaktive at serum 2 mL, 3.1 mL IPCS mix ve 0.1 mL progesteron çözeltisi (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Orta 0,22 µm membran üzerinde filtre ve 4 ° C'de saklayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL yoğunluğu degrade çözeltisi (% 5.5 son konsantrasyonu) deney başına hazırlayın.<ol>
<li>476 µL ticari % 60 yoğunluk gradient orta L-15 4524 µL için Ekle (interfaz; adlı görsel kontrastı arttırmak için mümkünse, kırmızı fenol olmadan 1:10. 5 seyreltme oranı).</li>
		<li>-20 ° C'de dondurmak veya çözüm 4 ° C'de 2 hafta boyunca saklayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL kültür ortamının hazırlayın.<ol>
<li>Ek orta 200 µL nöron hücre kültür ortamının 9,6 mL ekleyin.</li>
		<li>(Hangi gliyal hücreye öncüleri ve işleri yayılmasına karşı ayrım eğilimi) ısı inaktive at serum 200 µL glutamin 25 µL ve 2-mercaptoethanol 10 µL ekleyin.</li>
		<li>Medya 0,22 µm filtre.</li>
		<li>Aşağıdaki Nörotrofik faktörler ekleyin: silier nörotrofik faktör (CNTF) 10 ng/mL, son bir konsantrasyon ve beyin türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) ve 1 ng/ml son konsantrasyonlarda gliyal hücreye türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF).</li>
		<li>Medya 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL diseksiyon ortam hazırlamak.<ol>
<li>Glikoz (200 mg/mL) 2,25 mL HBSS için 47.05 mL ekleyin. 1 M HEPES 700 µL pH 7.4 ile ekleyin. Medya 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>% 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlamak.<ol>
<li>İngiltere'de yılın 20 g 500 ml PBS çözülür.</li>
		<li>Kimyasal bir başlık altında çözüm 60 ° c ısı ve çözüm açık hale gelinceye kadar 1 M NaOH birkaç damla ekleyin.</li>
		<li>Bir filtre kağıdı ile çözüme filtre ve pH 7.2 için ayarlayın. -20 ° C'de depolayın Not: Alternatif olarak, diğer ticari İngiltere'de yılın çözümleri kullanılabilir ve PBS % 4 oranında sulandırılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon araçları forseps, makas ve silikon yemekler ile kullanmadan önce % 70 etanol ve sabunla temiz ve berrak su kullanımdan sonra.</li>
</ol>2. poly-ornitin/Laminin (Po/L) çanak kaplama
Not: Birimleri kat 24-şey plaka adapte olmuşlardır.
<ol><li>Gerekirse, steril 12 mm coverslip kuyuda koymak.</li>
	<li>Suda 10 µg/mL Poly-L-Ornithine çözeltinin 500 µL Wells'le kat.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için yerleşmek wells izin.</li>
	<li>Poly-L-Ornithine çözümü kaldırmak ve kuruması için 30 dk.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de 3 µg/mL laminin bikarbonat L-15 içinde 500 µL ile kuyu kat. Not: Wells kuluçka makinesi 7 günde 37 ° C'de depolanabilir. Uzun incubations için steril PBS kuyular arasında eklemek orta buharlaşma önlemek için yardımcı olabilir.</li>
</ol>3. diseksiyon
<ol><li>Embriyo embriyonik evre at E12.5 ne zaman hamile bir fare kurban. % 70 etanol göbekle temiz.</li>
	<li>İki oviducts ve vajina kesim tarafından rahim kaldırmak ve (olmadan Ca2 + Mg2 +) soğuk PBS ile dolu bir Petri kabına koydum.</li>
	<li>Tüm embriyoların toplamak ve taze, transfer (olmadan Ca2 + Mg2 +) soğuk PBS bir petri içinde.</li>
	<li>Bir embriyo silikon ile kaplanmış ve tam diseksiyon medya (HBSS, 4,5 g/M glikoz ve 7 mM HEPES pH 7,4 ile) bir tabak koyun. Not: Embriyo diseksiyon temiz iyi forseps ve makas kullanma mikroskop altında gerçekleştirilir. Alternatif olarak, düzenli bir petri silikon olmadan diseksiyon için kullanılabilir.</li>
	<li>Baş, kuyruk ve iç organlar, forseps makas kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Silikon karşı göbek ile embriyo forseps ile koruyun.</li>
	<li>Forseps ikinci bir çifti ile uçlarından birini rostral Medulla Spinalis merkezi kanalı içine yerleştirin.</li>
	<li>Dorsal doku birkaç milimetre gözyaşı forseps kapatın.</li>
	<li>Tüm omurilik açık olana kaudal yana doğru bu işlemi yineleyin (Şekil 1B).</li>
	<li>Vücuttan spinal kord (serebral gövde) rostral parçası bağlantısını kesin.</li>
	<li>Açık spinal kord silikon karşı korumak için embriyo açın.</li>
	<li>Rostral Medulla Spinalis parçası pinch ve embriyo omurilik ayıklamak için kafanı tarafından çıkar. Not: Meninkslerde ve dorsal kök gangliyon (DRGs) embriyo için bağlı kalması gerekir. Aksi takdirde, dikkatlice uzakta kalan meninkslerde ve hala bağlı spinal kord DRGs çek. Bu adımda, DRGs aynı zamanda hassas nöron kültürü için toplanan (konuya bakın).</li>
	<li>Omurilik silikon üzerinde dümdüz ve neşter kullanarak her iki tarafın ortasında boyunca keserek göbek bağını dorsal yarısı kaldırın. Orta bölüm bir neşter kullanarak 10 parçalar halinde kesilmiş ve parçaları için yeni bir tüp aktarın.</li>
</ol>4. Spinal kord hücre süspansiyon
<ol><li>6-8 spinal halatlar için bu diseksiyon yordamı yineleyin.</li>
	<li>Omurilik adet tüp alt kısmında toplamak ve HBSS ile 1 mL Ham-F10 orta yerine izin.</li>
	<li>Tripsin (% 2,5 w/v; son konsantrasyonu % 0,025) 10 µL ekleyin. Tüp 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
	<li>Enzimatik sindirim durdurmak için 800 µL tam L-15 orta, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) içeren yeni bir 15 mL tüp parçaları aktarın.</li>
	<li>İki kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. toplamak süpernatant bir taze 15 mL tüp razı parçaları izin.</li>
	<li>Parçaları için tam L-15 orta 900 µL, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) ekleyin.</li>
	<li>6 kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. 15 mL tüp süpernatant 4.5. adımda elde Ekle razı parçaları izin.</li>
	<li>Parçaları için tam L-15 orta 900 µL, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) ekleyin.</li>
	<li>10 kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. 15 mL tüp süpernatant 4.5. adımda elde Ekle razı parçaları izin. Süpernatant ile devam edin.</li>
	<li>P1000 damlalıklı kullanarak, yavaşça süpernatant tüp alt kısmında 2 mL BSA (w/v) % 4 yastık yerleştirin. 470 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve tam L-15 orta 2 mL ile hücre Pelet resuspend.</li>
</ol>5. MN zenginleştirme degrade yoğunluğu tarafından
<ol><li>Hücre süspansiyon iki 15 mL tüpler (1 mL her) içine bölünmüş. O zaman, tam L-15 orta 2 mL ekleyin. 6 embriyo ile başlayan, orta 3 mL tüp başına 3 embriyo denk kullanın.</li>
	<li>2 mL yoğunluk gradient çözeltisi yavaş yavaş çözüm keskin bir arabirimi her tüpün dibine ekleyerek.</li>
	<li>Vasıl 830 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi. MNs gibi büyük hücreleri yoğunluk gradient çözüm/orta arayüzü olmalıdır, ancak bu adımdan sonra Tüp, alt kısmında küçük hücre olmalıdır.</li>
	<li>Arayüz hücreleri toplamak ile 1 ya da 2 mL alıyorum ve bir taze 15 mL tüp aktarabilirsiniz. Ses seviyesini L-15 pH orta ile 10 ml.</li>
	<li>%4 BSA yastık 2 mL tüp ve oda sıcaklığında 5 min için 470 x g, santrifüj dipleri ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL tam L-15 orta resuspend.</li>
	<li>5.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 2 mL tam kültür orta resuspend. Cep telefonu numarasını ve canlılığı bir hemasitometre faz kontrast mikroskop altında saymak. Not: 6 spinal kordonlar için cep numarası 1 x 10-5 MNs olması bekleniyor.</li>
</ol>6. MN kültür
<ol><li>MNs kültür orta 24-şey plaka bir kuyu başına 500 µL genellikle 5.000-10.000 hücrelerde için uygun yoğunluğu oranında seyreltin. Not: yoğunluk tohum 30.000 ve 1.500 hücreler için 6-96-iyi ve levha, sırasıyla civarındadır.</li>
	<li>Bir P1000 laminin çözümle kaldırın.</li>
	<li>Hemen kurutma önlemek için kültür ortamında kaplama kalıplara seyreltilmiş MNs aktarın.</li>
	<li>Kültür 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya</li>
</ol>7. MNs Magnetofection
Not: aşağıdaki adımlarda, bir 24-şey plaka bir şey transfection için kullanılan miktarlar içindir. Lütfen başka bir biçimi için üreticinin iletişim kuralı bakın.
<ol><li>DNA 1 µg 50 µL nöronal kültür orta ve 5 için girdap içinde için DNA hazırlık, resuspend s.</li>
	<li>Boncuk tüp için hazırlık, boncuk 1,5 µL nöronal kültür orta 50 µL içinde resuspend.</li>
	<li>50 µL boncuk çözüm 50 µL DNA çözüm ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya (toplam hacmi 100 µL =).</li>
	<li>Bu kuluçka sırasında 100 µL kültür orta transfected kuyudan geri alıyorum. Not: 37 ° C'ye ısıtmak için kuluçka Manyetik plaka koymak</li>
	<li>DNA/boncuk Mix 100 µL kuyuya aktarmak ve plaka kuluçkaya 20-30 dk 37 ° C'de Manyetik plaka üzerinde</li>
	<li>CDNA ifade tespiti önce en az 24 saat bekleyin.</li>
</ol>8. fiksasyon ve boyama
<ol><li>Kültür 2 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kültür, oda sıcaklığında %4 20 dk için kuluçkaya PFA/PBS.</li>
	<li>Kültür 2 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabelleği (PBS, % 4 BSA, % 2 normal serum, %0.3 Triton X-100, 0.1 M glisin) 500 µL kültüründe kuluçkaya. Not: Normal serum ikincil antikor (Örneğin, Normal keçi Serum) aynı türlerden elde edilen.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de kültür ile birincil antikor engelleme arabellek 250 µL içinde seyreltilmiş kuluçkaya. Not: Örneğin, 1/1000 TUJ1 kullanıldığında, SMI32 1/1000 kullanılır ve Lc3b 1/200 olarak kullanılır.</li>
	<li>Kültür 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikorlar fluorophore Birleşik oda sıcaklığında 1 saat engelleme arabellek 250 µL içinde seyreltilmiş ile kültür kuluçkaya.</li>
	<li>Kültür 3 kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Cam slaytlara montaj orta kullanarak bağlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li>
<li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li>
<li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li>
<li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+ALS%3A+from+genes+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li>
<li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287465251_Purified_embryonic_motoneurons">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li>
<li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF%3A+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alsin%2FRac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li>
<li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas%2C+Daxx%2C+and+FasL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li>
<li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wildtype+motoneurons%2C+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li>
<li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li>
<li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li>
<li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li>
<li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li>
<li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+spinal+motor+neuron+diversity%3A+a+long+quest+for+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı kritik noktaları fare embriyo sırasında geliştirme (E12.5) sonunda elde edilen un miktarı optimize etmek için bir kesin zaman penceresinde disseke biridir. Buna ek olarak, en iyi verim için diseksiyon sabah ya da öğleden sonra erken yapılmalıdır. Daha önce E12.5 (Örneğin, E11.5 adlı), diseksiyon meninkslerde kaldırılması ile ilgili özellikle zordur. E12.5 sonra elde edilen MNs sayısı önemli ölçüde düşer. Gelişiminin embriyo aşamasında denetlemek için yetişkin kadın ve erkek ilk birlikte günün ...

A değişiklik-in kas ve/veya sinir sisteminin değiştirilmesini tarafından karakterize klinik ve genetik olarak farklı patolojiler nöromüsküler hastalıklar kapsamaktadır. Sıralama teknolojik gelişmeler nedeniyle, son on yılda genlerin bu nadir hastalıklar için sorumlu yüzlerce tespit edilmiştir (liste Neuromuscular hastalığı Merkezi, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Tek bir gen farklı mutasyon farklı fenotipleri ve hastalıkları1,2,3 neden olabilir ve farklı genlerdeki mutasyonlar benzer fenotipleri üretebilir saptanan mutasyon çeşitli gösterir 4 , 5. Bu bağlamda, mutasyon sonuçları ve patolojik mekanizmalarını analiz etmek için güçlü araçlar olabilir hücresel modellerinin geliştirilmesi için çaba vardır.
Omurilik MNs ventral boynuzları omurilik, iskelet kas lifleri hedef ve nöromüsküler kavşak, asetilkolin serbest yoluyla gönüllü hareketler için izin vermek için form uzun aksonlar yer alan büyük somas var. MNs nöromüsküler hastalıklar gibi amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı (CMT), etkilenen ve spinal kas atrofisi, Dr Henderson ve arkadaşları ekimi için izin verilen ilk Protokolü6 geliştirilmiş Tüp bebek spinal MNs ve keşif nörotrofik faktör GDNF7 (gliyal hücreye türetilmiş Nörotrofik faktörü). O zamandan beri teknik ayrıntılandırmaları spinal MNs ve FACS8kullanarak kendi alt türlerinden daha doğru arıtma için izin vermiş, ancak güçlü ve yaygın olarak kullanılan birincil spinal MNs ile çalışmakta laboratuarlarında zenginleştirme yoğunluk gradient tarafından kalır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. daha sonra immunopanning bir daha yüksek MN arıtma sınıfa yüzey işaret p75(NTR)15,16,17yararlanarak elde etmek mümkündür.
Omurilik boyun, göğüs ve bel MNs yanı sıra ön boynuz dorso-ventral ekseninde konumlarında arasında farklılık medyan ve yanal motor sütunları farklı alt türlerinden içerir ve hedefler arasında onlar8, innervate 18. birincil MN kültürleri tüm fizyolojik oranlarda bu MN türlerinden kurtarabilirsiniz. Ana bu teknik MNs yordamın bitiminde elde edilen az sayıda kısıtlamasıdır; Aslında, yaklaşık 105 MNs mikroskobu ama Biyokimya deneyler için sınırlama için uygun olan altı embriyolar elde etmek için beklenebilir. Deneyler daha standart alt türlerini ve bol MNs gerçekleştirmek için (> 106 hücreler), embriyonik kök hücre kaynaklı MNs18düşünülmelidir.
Birincil MNs içine vahşi-türü/mutant transgenes veya devirme endojen genlerin transfection özellikle fare modelleri kullanılamaz olduğunda fizyopatolojik yolları, deşifre için hızlı ve yararlı bir araçtır. Magnetofection için transfecting birincil nöronlar, lipofection ilgili nörotoksisite olmadan benzer bir tekniktir. Ayrıca, transfection olgun nöronlar üzerinde birkaç gün vitro, adım9tarihinde temel teknikleri aksine sonra gerçekleştirilebilir. Ancak, bu tekniğin bir dezavantaj boncuk DAPI etiketleme gürültü neden kültür, nükleik asitler bağlamak olduğunu. Viral enfeksiyon büyük olasılıkla transfecting MNs için en etkili tekniktir; Ancak, magnetofection viral üretim ve hücresel enfeksiyon için gerekli bazı güvenlik prosedürleri gerektirmez.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Silikon diseksiyon kabı</td><td>Canlı sistemler enstrümantasyonu</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>yuvarlak lamel</td><td>NeuVitro, Örgü cam</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slayt a Lyzer kasetleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20.000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Filtre ünitesi</td><td>Millipore SCGVU02RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GP Steril Şırınga Filtreleri</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu plaka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta ile işlenmiş plaka</td></tr><tr><td>forseps</td><td>Dumont tarafından FST</td><td>11252-20</td> <td># 5 forseps</td></tr><tr><td>makas</td><td>Dumont</td><td>14060-10</td><td>ince makas</td></tr><tr><td>FST</td><td>Dumont tarafından FST</td><td>10035-20</td><td>kavisli bıçaklı</td></tr><tr><td>neşter</td><td>FST by Dumont</td><td>10316-14</td><td>mikro bıçaklı neşter</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>15 mL polipropilen tüp</td><td>Falcon</td><td>352096</td> filtre kağıdı Watman 1001125 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>daire, 125 mm çapında</td></tr><tr><td>cam hazneli sürgü</td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 odacıklı</td></tr><tr><td>Plazmid pCAGEN</td><td>Addgene</td> <td># 11160</td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Çözeltiler ve ortamlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 orta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 orta, kırmızı fenol içermez</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Konalbümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poli-DL-Ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>tripsin %2.5, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td> içermeyen <td>PBS, Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>sodyum bikarbonat</td> içermez <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Nöron hücre kültürü ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobazal Plus ortamı</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyant ortam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>ek ortam</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>At serumu ısısı inaktive</td><td>edilmiş ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U / mL</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar< / strong</td></tr><tr><td>>Immuno floresan< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> olmadan <td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>normal keçi serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Kolin Asetil Transferaz (CHAT)</td> <td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Nörofilament H fosforile olmayan (SMI32)</td> <td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF 1/1000</td></tr><tr><td>Adacık-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Adacık-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 tübülin (Tuj1 klonu)</td>1<td>/1000'de IF</td><td>801201</td> <td>Biyoefsaneler</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td> <td># 2775</td><td>IF 1/200'de</td></tr></tbody></table>

fare birincil motoneurons transfecting tarafından charcot marie tooth hastalığı vitro modelleme

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Spinal motoneurons (MNs) ateş içinde nörolojik bozukluklar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı ve spinal kas atrofisi, kas atrofisi ile ilişkili tüm olan da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı. Omurilik MNs birincil kültürleri belirli genler gibi hastalıklar tutulumu göstermek ve onların mutasyonların hücresel sonuçları karakterize yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu iletişim kuralı modelleri birincil MN kültür Henderson ve arkadaşları seminal işten daha fazla yirmi yıl önce türetilmiş. İlk olarak, bir fare embriyo Medulla Spinalis ön boynuzları anatomi ve hücreleri bir yoğunluk gradient kullanarak komşu gelen MNs izole bir yöntem ayrıntı. O zaman, biz verimli bir şekilde transfecting MNs magnetofection kullanarak ifade Plasmid'ler ile yeni bir yol mevcut. Son olarak, biz nasıl düzeltmek için ve immunostain MNs. Charcot Marie Tooth hastalığı tip 2 neden neurofilament mutasyon kullanarak, bu iletişim kuralını proteinler ilgi ifade ve onların katılımı eğitim nitel bir yaklaşım gösteriyor birincil göstermek MN büyüme, bakım ve hayatta kalma.

Kültür 24 saat sonra motoneurons (MNs) zaten önemli aksonal büyüme (soma boyutundan en az 6 kat daha uzun) göstermelidir. Takip eden günlerde, akson büyümek ve dallanma (Şekil 2) görüntülemek devam etmelidir. Alt tür özelliklerine nedeniyle farklı türleri morfoloji olacak. Örneğin, ortalama sütun Aksiyel kasları innervate MNs daha kısa ve daha dallı aksonlar bacak kasları18innervate yanal motor sütun MNs daha var.
<p class="jove_co...

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Bu yöntem nörobiyolojide motor nöron polaritesi, akson rehberliği, akson ticareti ve nörodejeneratif mekanizmalar gibi önemli soruları nöralize etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, nakavt proteinimizi dakika sevgiyle ifade ederken yüksek oranda zenginleştirilmiş bir motor nöron kültürü elde etmektir. Bu prosedüre başlamak için, silikon ile kodlanmış diseksiyon ortamı bir çanak bir embriyo yerleştirin.Mikroskop altında, karın ile embriyo tutun forceps ile silikon karşı. İkinci çift forceps ile, rostrad omuriliğin merkezi kanalına uçlardan birini yerleştirin. Daha sonra, biraz dorsal doku yırtmak için forceps kapatın.Tüm omurilik açılana kadar connell tarafına doğru bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, açık omurilik silikon karşı böylece embriyo konumlandırın. Daha sonra, vücuttan omurilik rostrad kısmını ayırmak.Omuriliğin rostrad kısmını çimdikle ve omuriliği çıkarmak için embriyoyu kafasından çekin. Omurilikte kalan menenjleri ve DRG'leri dikkatlice çekin. Silikon üzerinde omurilik düzleştirmek ve bir neşter kullanarak, her iki tarafın ortasında boyunca keserek kordon dorsal yarısını çıkarın.Orta kısmı on parçaya ayırın ve yeni bir tüpe aktarın. Omurilik hücre süspansiyon hazırlamak için, tüpün altındaki omurilik parçaları toplamak. HBSS'yi bir mililitre Ham F-10 orta ile değiştirin ve on mikrolitre tripsin ekleyin.Tüpü 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Enzimatik sindirimi durdurmak için, parçaları tam L-15 orta 800 mikrolitre, 4% BSA 100 mikrolitre ve 100 mikrolitre DNA ve titrat içeren yeni bir 15 mililitre tüp, iki kez aktarın. Parçaları taze bir 15 mililitrelik tüp içinde supernatant toplamadan önce iki dakika razı olsun.Yavaşça supernatant tüp altında% 4 BSA iki mililitre ekleyin. Centro onu 470 x yerçekiminde 5 dakika kaynaştırır. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve tam L-15 orta 2 mililitre ile hücre paletyeniden askıya.Motonöron zenginleştirme için, iki 15 mililitre tüpler halinde hücre süspansiyon bölün. Daha sonra, her tüp e iki mililitre L-15 PH orta ekleyin. Altı embriyo ile başlayarak, tüp başına üç embriyo eşdeğer kullanın, ve orta üç mililitre.Keskin bir arayüz elde etmek için her tüpün altına 2 mililitre yoğunluk gradience çözeltisi ekleyin. Sonra, centro oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 830 x yerçekimi sigorta. Bu adımdan sonra, küçük hücreler tüpün alt kısmında, motoneuron gibi büyük hücreler ise yoğunluk gradyan çözüm/orta arabirimde olmalıdır.Arayüzdeki hücrelerin 1 ila 2 mililitreasperae ve taze bir 15 mililitre tüp aktarın. L-15 PH orta ile on mililitre ses ayarlayın. Daha sonra, iki tüpün altına %4'lük BSA yastığının iki mililitresini ekleyin.Ve oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekiminde centro sigorta. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve palet ve tam L-15 orta 3 mililitre yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekimi nde santrifüj tekrarlayın.Sonra, supernatant çıkarın ve hücre palet ve tam kültür orta iki mililitre askıya. Kültür motor nöronlar için, 5, 000-10, 000 hücreleri 500 mikrolitre kültür orta başına 24 kuyu plaka onları seyreltin. Daha sonra, P-1, 000 pipet ucu ile lamina çözeltisi çıkarın.Hemen kültür ortamda seyreltilmiş motor nöronları aktarın. kurumasını önlemek için kodlama plakalarına. DNA hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1 mikrogram DNA'yı yeniden askıya alın.Ve 5 saniyelik girdap. B tüpünü hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1,5 mikrolitre boncuk askıya alın. 50 mikrolitre DNA çözeltisine 50 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bu kuluçka sırasında, 100 mikrolitre kültür ortamını nakledilecek kuyudan çekin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre DNA boncuk karışımı aktarın. Ve 24 kuyu plakasını kuluçkaya yatırın, manyetik plakada 20-30 dakika 37 santigrat derecede.Burada gösterilen, endojen non-fosforile nörofilament ağır zincir dört gün sonra ayakta tarafından ortaya modem nöron morfolojisi. Bu görüntülerde, modem nöron morfolojisi dört gün in vitro sonra göstermek ve ikinci gün magnetofection tarafından EGFP trans geni için transfected. Motto nöronlar smi-32 veya pan-nöro marker TUJ-1 ile karşı-lekeli ve oklar nöronların soma gösterir.Bu manyeto dışkılı motor nöronlar onların konfokal görüntüleri, yabani tip veya mutant EGFP NEFH yapıları ifade ve otofajik marker LC-3B için lekeli. Oklar mutant EGFP NEFH protein agregaları da LC-3B pozitif bu prosedürü takip eden göstermek, montoholda curcha akson ticareti görselleştirmek ve bazı rehberlik eklemek için video mikroskobu ile analiz edilebilir. Nöral biyolojideki temel soruları ele almak için ilk gelişiminden sonra, bu teknik aynı zamanda toksik şok sendromu hastalığı, samuel trofik lateral skleroz veya spinal müsküler atrofi gibi motonöron bozukluklarının spektrumunu kapsayan fizyopatolojik mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamaktadır.

modeling-charcot-marie-tooth-disease-vitro-transfecting-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kültür kas hücreleri innerve kas özetlemek için yetersiz bir modeli...

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Bu protokol, biz optimize C2C12 hücre bakım, gen transfeksiyon / transdüksiyon ve miyosit farklılaşma dahil miyotonik distrofi 1 myoblast modelleri, kurulması prosedürleri sunuyoruz.

C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Sinir iletim ölçümü ateş fare modelleri değerlendirmek için yararlı bir araçtır ama sık sık öyle yalnızca hindlimbs siyatik sinir uyarmak için geçerlidir. Burada, bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP) vivo brakiyal pleksus tarafından innervated fare forelimb kaslarda ölçmek için bir teknik açıklayın.

Vivo Bileşik kas aksiyon potansiyeli Motor nöron hastalığı, fare modellerinde ön ayakları üzerinden elektrofizyolojik ölçümü

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Burada insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) in vitro NMJs oluşturmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, olgun morfolojisi ve fonksiyonu ile NMJs neden olabilir 1 ay içinde tek bir kuyuda. Ortaya çıkan NMJ'ler potansiyel olarak ilgili hastalıkları modellemek, patolojik mekanizmaları incelemek veya tedavi için ilaç bileşiklerini taramak için kullanılabilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden İndüklenen İn vitro Nöromüsküler Kavşak

fonksiyonel olarak aktif nöromüsküler kavşakların oluşumuyla sonuçlanan insan primer mezoangioblast türevli miyotüplerle birlikte insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi motor nöronları birlikte kült haline getirmekle ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlarda insan motor üniteleri üretmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mikroakışkan Cihazlarda Fonksiyonel Nöromüsküler Kavşaklara Sahip İnsan Motor Ünitelerinin Üretimi

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Keşfedin fare birincil motoneuron izolasyonu ve transfeksiyonu yöntemini, Charcot Marie Tooth hastalığı modellemesi için. Bu teknik nörodejeneratif mekanizmaları incelemeye olanak tanır.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Daha fazla video keşfet