Name: Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin fare pankreatik endokrin hücrelerinin tek hücre RNA dizileme ile izolasyonunu ve transkriptomik analizini. Bu yöntem diyabet ve pankreas hastalıkları araştırmalarında hücre farklılaşmasını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Ulusal Merkezi Protein Bilimler, Pekin (Pekin Üniversitesi) ve Pekin-Tsinghua Merkezi için hayat bilgisi Computing Platform için teşekkür ederim. Bu eser Bakanlığı Bilim ve teknoloji Çin (2015CB942800), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31521004, 31471358 ve 31522036) ve Pekin-Tsinghua Merkezi'nden Yaşam Bilimleri için c-R.X. için finansman tarafından desteklenen

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016).</li>
<li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için tek hücreli ifade profilleri pankreas β hücrelerinin eğitim için etkili ve kullanımı kolay bir yöntemi gösterdi. Bu yöntem embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases endokrin hücrelerden izole etmek ve tek hücreli transcriptomic analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.
En önemli adım tek β hücrelerinin yalıtım iyi durumda değil. Tam derin pancreases daha iyi sonraki sindirim için cevap. Genellikle dorsal pankreasta oluşur, yetersiz perfüzyon bir düşük adacık verim ne...

Pankreas memelilerde yaşamsal metabolik bir organdır. Pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri oluşur. Pankreatik endokrin hücreleri insülin üreten hücrelerin β ve glukagon üreten α hücreleri de dahil olmak üzere, birlikte adacıkları of Langerhans küme ve coordinately sistemik glikoz homeostazı düzenler. Disfonksiyon endokrin hücreleri sonuçlar diyabet mellitus, dünya çapında bir önemli halk sağlığı sorunu haline gelmiştir.
Endokrin pankreas hücreleri Ngn3 elde edilen+ ataları embriyogenez1sırasında. Daha sonra perinatal dönemde endokrin hücreleri için formu olgunlaşmamış adacıkları çoğalırlar. Bu olgunlaşmamış hücreleri devam geliştirmek ve yavaş yavaş zengin kan glikoz homeostazı yetişkin2düzenleyen skarların haline olgun adacıkları haline gelir.
Transkripsiyon faktörleri bir grup, β hücre farklılaşması düzenleyen tespit rağmen β hücrelerinin hassas olgunlaşma yolu hala belli değil. Ayrıca, β hücre olgunlaşma süreci de hücre sayı genişleme3,4 düzenlenmesi ve hücresel heterojenite5,6nesil içerir. Ancak, düzenleyici mekanizmaları bu süreçlerin de incelenmiştir değil.
Tek hücreli RNA-sıralama hücre altgrupları profil ve hücre lineage gelişim yolları7iz güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknoloji, pankreas adacık geliştirme sırasında meydana gelen olayları tek hücre düzeyi8' de deşifre anahtar yararlanarak. Tek hücreli RNA-sıralama protokolleri arasında geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk ve daha düşük maliyet9standart reaktifler kullanımı tam uzunlukta cDNA nesil akıllı-seq2 sağlar. Akıllı-seq2 sıralama10için bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için yaklaşık iki gün alır.
Burada, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak bir yöntem pancreases, fetal floresans etiketli β hücrelerinden yetişkin Ins1-RFP transgenik fareler11, yalıtım için önerdiğimiz ve transcriptomic performans analizleri tek hücre düzeyi, akıllı-seq2 teknolojisiyle (Şekil 1). Bu iletişim kuralı tüm pankreatik endokrin hücre tiplerinin normal, patolojik ve yaşlanma Birleşik Devletleri transcriptomes analiz etmek için genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD İğnesi 1/2" Uzunluk</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeç Kapaklı Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu PCR Mikroplaka</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Sızdırmazlık Matı</td><td>Axygen</td><td>-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>İnce Kuyu PCR Tüpü</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal pipet</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td></td><td></td>Damıtılmış</tr> su <tr><td>4456740</td><td></td><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant RNaz İnhibitörü</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Üst Simge II ters transkriptaz</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Birinci iplikçik tamponu (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Temiz Boncuklar XP</td><td>boncukları Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr>Illumina <td>Vazyme</td><td>TD502</td> <td>için TruePrep DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti V2</td><td>Illumina Vazyme TD203 için 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>TruePrep İndeks Kiti V3'ü</td><td></td><td></td><td>içerir 16 N6XX ve 24 N8XX</td></tr><tr><td>içerir Yüksek Hassasiyetli NGS Parça Analiz Kiti</td><td>İleri Analitik Teknolojiler</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ ve Mg2+</td><td></td><td></td> <td>olmadan 1x HBSS138 mM NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO<alt>3</alt>; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>İzolasyon tamponu</td><td></td><td></td><td>1 ve kez; 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glikoz, pH 7.4</td></tr><tr><td>FACS tamponu</td><td></td><td></td> 1 ve kez içeren HBSS<td>; 15 mM HEPES, 5.6 mM Glikoz, %1 FBS, pH 7.4 NaCl içeren HBSS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN astar</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>primerleri</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh İleri astar</td><td></td><td></td><td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Ters astar</td><td></td><td></td><td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 İleri astar</td><td></td><td></td><td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Ters astar</td><td></td><td></td><td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre transcriptomic analizleri

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Adacıklar içinde kümelenir, pankreatik endokrin hücreleri kan glikoz istikrar ve enerji metabolizmasını düzenler. Adacıkları, insülin salgılayan β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ortak endokrin ataları embriyonik evre sırasında farklı. Olgunlaşmamış endokrin hücreleri hücre proliferasyonu ile genişletin ve gelişimsel bir uzun postnatal dönemde olgun. Ancak, bu işlemlerin altında yatan mekanizmaları açıkça tanımlı değil. Tek hücreli RNA-sıralama farklı hücre popülasyonlarının ve izleme hücre lineage farklılaşma yollar karakterizasyonu için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, tek hücreli RNA-sıralama izole pankreas β hücre embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases için bir yöntemi açıklanmaktadır.

Pancreases embriyonik, yenidoğan ve postnatal fareler disseke (Şekil 2A ve 2B). Doğum sonrası gün 18 büyük fareler için sindirim etkisi perfüzyon derecesine bağlıdır; Bu nedenle, enjeksiyon adacık yalıtım için en önemli adımdır (Şekil 2C-2E ve Tablo 6). Kadar collagenase pankreas bu adımı sırasında doldurmak mümkün olduğu kadar enjekte ettiler. Tam şişirilmiş pa...

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Bu yöntem pankreas adacık soy farklılaşması hakkında pankreas adacık alanında anahtar sorulara cevap olabilir, olgunlaşma, ve rejenerasyon. Bu tekniğin ana avantajı yüksek kaliteli tek hücreli RNA sıralama veri üretimi için tek pankreas adacık hücrelerinin toplanması sağlar. Bu tekniğin uygulanması patolojik koşullar üzerinde pankreas endokrin tek hücrelerin transkripsiyonomik analizi ile diyabet ve diğer pankreas endokrin ile ilgili hastalıkların tedavisi doğru uzanır.Perfüzyon için pankreasDar safra kanalına iğne nin takılması zor olabilir gibi bu yöntemin görsel gösteri zordur. Embriyonik gün 17.5 embriyolar için. Karın boşluğu açıldıktan sonra, soğuk PBS içeren altı santimetre siyah alt çanak visseral doku aktarmak için dirsek cımbız kullanın.Visseral doku dan pankreas ayırmak için forceps kullanın. Ve pankreas dokusunu 20 mililitrelik bir şişeye yerleştirin beş mililitre soğuk kollajenaz solüsyonu. Doğum sonrası gün sıfır dan 15 fareiçin, dikkatle kollajenaz içine doku yerleştirmeden önce pankreas tüm lobları incelemek.Doğum sonrası gün için 18-60 fareler, ilk ksifoid kaldırmak ve karın boşluğunun sağ tarafında bağırsak ayıklayın. Safra kesesi ve ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için her iki tarafa karaciğerin sol ve sağ medial loblar itin. Ve çift°yoleni, safra kanalının duodenuma girdiği yeri kuşatmak için üst ve alt konumlardaki bir çift küçük damar kelepçesiyle kenetle.Daha sonra, soğuk kollajenaz çözeltisi ile 30 gauge iğne ile donatılmış bir 5 mililitreş yükleyin. Ve safra kesesi içine iğne ucu eklemek için mikroskop kullanın. Dikkatle ve sorunsuz ortak safra kanalı ile iğne işlemek.Ve farenin boyutuna göre kollajenaz çözeltisi bir ila beş mililitre ile pankreas perfuse için piston depress. Çözeltinin tamamı perfüzyon edildiğinde, pankreası hemen beş mililitre taze soğuk kollajenaz çözeltisi içeren 20 mililitrelik bir şişeye aktarmak için forseps kullanın. Tüm pankreas dokusu toplandığında, üç dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu nda şişe yerleştirin, nazik sallayarak üç ila beş dakika takip.Daha sonra sindirilmiş ürünü 0,25 milimetrelik naylon süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Ve iyice süzgeç yıkamak için buz gibi PBS içeren 20 mililitrelik şırınga kullanın. Doğum sonrası gün için 18-60 pankreata, filtreli örnek santrifüj ve soğuk PBS 30 mililitre doku resuspend.Sonra altı santimetre siyah alt çanak içine doku süspansiyon decant, ve soğuk PBS küçük bir hacim içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine transfer için adacıkları almak için 200 mikrolitrelik pipet ve bir diseksiyon mikroskop kullanın. Embriyonik gün için 17.5 doğum sonrası gün 15 pankreata, filtrelenmiş pankreas dokusu santrifüj ve 37 derece santigrat su banyosunda dört dakikalık kuluçka için tripsin-EDTA çözeltisi pelet resuspend. Kuluçka sonunda, yavaşça 200 mikrolitrelik pipet ile bir dakika için pelet oranı deneyin, sindirim durdurmak için nazik bir girdap ile soğuk fetal sığır serum 0,5 kat hacmi nin eklenmesi izledi.Sonra santrifüj tarafından sindirimi toplamak ve akış sitometri tarafından sıralamak için 5 mililitreLIK FACS tüp FACS tampon 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Tek hücre toplama ve lysis için, aliquot taze hazırlanmış hücre lisis tampon sekiz şerit PCR tüpleri içine, ve her içine tek bir hücre aktarın. RNA'nın salınımı için hücreleri dinlendirmek için örnekleri girdap, ardından 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj ve buzda hemen depolanma.Ters transkripsiyon için, 72 santigrat derece üç dakika boyunca lysates kuluçka ve buz üzerinde bir dakika. Numuneleri kısaca 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve her numuneiçin toplam hacmi 10 mikrolitreye çıkarmak için her numuneye 5,7 mikrolitre ters transkripsiyon karışımı ekleyin. Nazik girdap ve santrifüjden sonra, örnekleri bir termocycler'a yükleyin ve ters transkripsiyon programını başlatın.Polimeraz zincir reaksiyonu preamplifikasyonu veya PCR için, ilk iplikçik reaksiyonlarını içeren her numuneye 15 mikrolitre PCR karışımı ekleyin ve ardından nazik girdap ve santrifüj ekleyin. Daha sonra numuneleri termocycler'a yükleyin ve PCR programını başlatın. PCR arınması için, her numuneye 25 mikrolitre resuspended DNA saflaştırma boncukekleyin ve girdap ile iyice karıştırın.Daha sonra boncukların yerleşmesini önlerken sıvıyı toplamak için numuneleri oda sıcaklığında hızlıbir şekilde döndürün. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, numuneleri uygun bir manyetik standa yerleştirin, çözelti temizolduğunda süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanolte iki 30 saniyelik yıkama ile yıkayın.Ve ikinci yıkamadan sonra kalan etanol atın. Boncuklar hava kuruduktan sonra, 11 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve ardından dna hedefini boncuklardan uzaklaştırın ve ardından girdap lar ekleyin. Daha sonra numuneleri hızlı bir şekilde santrifüj edin, çözüm temizolana kadar numuneleri manyetik standa geri verin ve her numunenin 10 mikrolitresini yeni bir PCR tüpüne aktarın.Başarıyla güçlendirilmiş cDNA 500 baz çiftleri üzerinde tam uzunlukta olmalı ve 1,5 ila iki kilo baz çiftleri zenginleştirilmiş olmalıdır. Ayrıca, genellikle insülin bir RFP artı hücrelerde gözlenen cDNA 500-600 baz çifti zenginleştirme vardır, hangi insülin transkript temsil edebilir. Ancak, 100 baz çiftine yakın cDNA parçaları genellikle aşırı astarlardan kaynaklanan ve DNA arınma adımı tekraredilerek çıkarılması gereken astar dimerlerdir.100 ile 500 baz çifti arasındaki cDNA parçaları genellikle bozulmuş cDNA'yı temsil eder, bu da rnase kontaminasyonu gibi kötü hücre durumu veya bölge sorunlarının neden olduğu ve dışlanması gereken cDNA'yı temsil eder. CDNA kütüphanelerinin diziliş için saflaştırılmasından sonra, 250 ile 450 baz çifti arasında değişen cDNA, dna arınma boncuklarının birinci ve ikinci tur saflaştırmaya eklenmesiyle elde edilebilir. DNA boncuk arınması sonra, sıralama kalite puanı sıralama kalite değerlendirmesi sırasında 30'dan büyük olmalıdır.Downstream analizleri için yüksek kaliteli hücreler elde etmek için, 0,5 milyondan az eşlenen okumaya veya 4.000'den az tespit edilmiş gene sahip hücreler dışlanır, bu da farklı hücre gruplarının karakterizasyonunu ve temel bileşen analizi ve hiyerarşik kümelenmeden sonra farklı gruplarda heterojen olarak ifade edilen genlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu prosedürü çalışırken, bu sindirim üzerinde adacık önlemek ve tek hücreli işlemler sırasında RNase ücretsiz bir ortam korumak için kollajenaz sindirim önce hızlı bir şekilde pankreas perfüzyon hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, adacık yapısının görselleştirilmesini kolaylaştırmak ve hücresel yanıtları ve ilaç stimülasyonunun incelenmesi için adacık görüntüleme ve kültür gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.Geliştirme den sonra, bu teknik adacık soy gelişimi ve rejenerasyon mekanizmaları keşfetmek için pankreas araştırma alanında araştırmacılar için yol açtı, memelilerde diyabet ilerlemesi gibi.

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Sanal kesit görüntüleme için aşağıdaki protokol pankreas diseksiyonu sürecini özetliyor ve sonraki tüm pankreas tüm GFP etiketli beta-hücrelerinin kantifikasyon.

Farelerde, pankreatik beta-hücre Kütle yerinde Niceleme

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Pankreas metaplastik hücreleri, pankreas tümörlerine yol açan kötü huylu hücrelerin öncüleridir. Bununla birlikte, sağlam canlı pankreas hücrelerini izole etmek zordur. Burada pankreas dokusu ayrışması için etkili bir yöntem sunuyoruz. Hücreler daha sonra tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) veya iki veya üç boyutlu birlikte kültürleme için kullanılabilir.

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

Bu protokol, yakın fizyolojik koşullar altında hücre fonksiyonunu incelemek için ölen organ bağışçılarından insan pankreas dilimlerinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu yenilikçi yaklaşım, normal ve yapısal olarak hasar görmüş adacıkların araştırılmasını ve endokrin ve ekzokrin kompartmanlar arasındaki karmaşık etkileşimi sağlar.

Endokrin ve Ekzokrin Pankreas Fizyolojisini İncelemek için İnsan Pankreas Dokusu Dilimlerinin Oluşturulması

Bu protokol, fare endotel hücrelerinin tüm pankreastan izolasyonunu tanımlar.

Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin fare pankreatik endokrin hücrelerinin tek hücre RNA dizileme ile izolasyonunu ve transkriptomik analizini. Bu yöntem diyabet ve pankreas hastalıkları araştırmalarında hücre farklılaşmasını incelemeye olanak tanır.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Daha fazla video keşfet