Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

Bu yöntem, viral enfeksiyon belirtileri olan hastaların bakım noktası teşhisi yapılırken yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, laboratuvar ekipmanı ve elektrik olmadan yapılabilmesi ve dolayısıyla bir hastane koğuşunda yapılabilmesidir. Kan alma prosedürünü gösteren, her ikisi de laboratuvarımdan Tıp Doktoru Anders Fomsgaard ve Bilim Adamı Morten Rasmussen olacak.

Kan alma tüplerini hazırlayarak başlayın. 4 ML EDTA vakum tüpüne 1.6 ML ticari bir lizis tamponu enjekte etmek için 3 ML'lik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir inç iğne kullanın. Kan alma için kan alma tüpündeki vakumun korunması çok önemlidir.

Bu nedenle, lizis tamponunu kan alma tüpüne enjekte etmek için her zaman bir iğne kullanın. Daha sonra, 960 mikro litre hacminde manyetik cam parçacıklarını veya MGP'leri tamamen yeniden askıya alın ve etiketli bir 1.8ML tüpe aktarın. Sonraki pipet: 4 ML yıkama tamponu, biri WB-1.1.5ML etiketli 4.5 ML'lik bir tüpe, ikisi WB-2 etiketli 3.6 ML'lik bir tüpe ve 3 ML yıkama tamponu, üçü WB-3 etiketli 4.5 ML'lik bir tüpe.

Son olarak, EB etiketli 1.8 ML'lik bir tüpe 100 mikro litre elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri kullanılana kadar oda sıcaklığında bırakın. Hastadan intravenöz tam kan almak için, küçük delikli bir uzatma borusu olan bir kelebek iğne ve lizis tamponu içeren önceden hazırlanmış kan alma vakum tüplerinden birini kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru pozisyonda dinlendirin.

Kelebek iğneyi hastanın damarına sokun ve kan alma vakum tüpünü küçük delikli uzantıya takın. Kan alındıktan sonra, tüpü beş ila on kez çevirerek tüpün içeriğini karıştırın. Tüpün dışını %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.

Daha sonra virüs inaktivasyonu için tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Toplanan kandan nükleik asitleri saflaştırmak için, vakum tüpünü elle beş ila on kez çevirerek tüpün içeriğini tekrar karıştırın. MGP'lerin hazırlanan alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün.

Numuneyi içeren tüpün üzerine kullanılmayan bir kan alma tüpünden yeni bir kapak yerleştirin. Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için kapağın üzerine bir parmak yerleştirin ve tüpün içindekileri beş ila on kez çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağın üzerinde tutun.

Ardından, MGP'leri mıknatısla birlikte tüpün yanında toplanmadan önce dağıtmak için manyetik tutucuyu tüple birkaç kez çevirin. Tüpün kapağını çıkarın ve tüpün içeriğini tek kullanımlık bir pipet kullanarak 50 ML'lik bir toplama tüpüne atın. Hazırlanan WB-1 alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün ve tüpün kapağını kapatın.

İçeriği elle beş ila on kez karıştırın. Daha sonra mıknatısı kullanarak tüpün yan tarafındaki boncukları toplayın ve sıvıyı daha önce olduğu gibi çıkarın. Boncukları hazırlanan WB-2 alikotunda tekrar süspanse edin, ardından çözeltiyi atın ve prosedürü hazırlanmış bir WB-3 alikotu ile tekrarlayın.

Son olarak, tüpü manyetik tutucudan çıkarın ve hazırlanan EB alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün. Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve parmağınızla beş ila on kez dokunarak MGP'leri yeniden askıya alın. Son olarak, yeniden süspanse edilmiş MGP'lerin bir damlacığını aşağı akış nükleik asit amplifikasyon reaksiyonu karışımına aktarmak için 1.5 ML'lik tek kullanımlık bir pipet kullanın.

PCR reaksiyonuna yalnızca bir damlacık aktarmadan önce MGP'leri tamamen yeniden askıya aldığınızdan emin olun. Kavramın kanıtını göstermek için, negatif tam kan, güney Gine'deki son salgından hazırlanan Ebola virüsü standardının 10 kat seyreltilmesi veya üç farklı Epstein Barr virüsü konsantrasyonu ile çivilendi. Ekstrakte edilen nükleik asitler, kurum içi virüs spesifik R2 qPCR veya qPCR ile analiz edildi.

Geçiş eşiği veya BT ne kadar düşükse, viral genom kopya sayısı o kadar yüksek olur. Burada, farklı konsantrasyonlarda Ebola virüsü ile sivri uçlu tam kanlar, Ebola virüsüne özgü bir lamba ile tespit edildi. Çivili tam kan örneğindeki son virüs konsantrasyonu X ekseninde görülür ve pozitife giden dakikalar Y ekseninde görülür.

Burada, tam kan, HCV'ye özgü RT qPCR ile tespit edilen bir hepatit C WHO standardize serum örneğinin 10 kat seyreltilmesiyle çivilendi. Son olarak, bu görüntü, Epstein Barr virüsü pozitif tam kan üzerinde Epstein Barr virüsüne özgü bir lamba reaksiyonunun sonuçlarını göstermektedir. Bu prosedürü denerken, belirtilen lizis bağlama tamponunu kullanmak önemlidir.

Bu çok önemli bir adımdır ve yöntem için çok önemli bir reaktiftir. Bu lizis bağlama tamponu, numunedeki virüsü etkisiz hale getirecektir. Bu tekniği takiben lamba ve PCR gibi farklı moleküler tespit yöntemleri uygulayabilir ve böylece ayırıcı tanı yapabilirsiniz.