Name: Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Öğrenin, tam kan örneklerinden hızlı virüs nükleik asit çıkarma yöntemini. Bu el ile başucu protokolü, laboratuvar ekipmanı ve elektrik gerektirmeden viral tanı yapılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.

Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Başkent Bölgesi onay verdi ve tüm yöntem tanımlamak burada bir inceleme tahlil kalkınma projeleri üzerinde Danimarka yasa uyarınca etik kurul sistemi tarafından muaf.
1. virüs Inactivation ve hızlı NA çıkarma için kan toplama camlı hazırlanması
Dikkat: Bu iletişim kuralı için kullanılan arabellek guanidinium thiocyanate (GITC) ve iyonik olmayan yüzey aktif, tahriş edici içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. Arabellek döküldü, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Önce emici doku ile dökülen tampon kadar Sil. Daha sonra ve daha sonra su ile % 70 etanol ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın.
<ol><li>Kan toplama camlı hazırlamak için belirli ticari lizis arabelleği 1.6 mL tüp 25 G x 1 iğne ve 3 mL şırınga kullanarak kapak delme tarafından 4 mL EDTA Vakum tüpün içine enjekte et. Not: vakum tüpü kapağını çıkarmak değil. Vakum muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Camlı oda sıcaklığında arabellek kullanımı kadar içeren depolar. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 yıl boyunca stabildir.</li>
</ol>2. NA çıkarılması için arabellekleri hazırlanması
<ol><li>Arabellekleri bir NA çıkarma için hazırlamak için iki 1,8 mL, iki 4.5 mL ve bir 3,6 mL tüpler bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, manyetik cam parçacıkları (MGPs) bir temiz 1,8 mL tüp ve bununla MGPs. Resuspend MGP süspansiyon tamamen pipetting önce etiket için 960 µL tarafından. Not: MGPs hızlı tüp alt kısmında toplamak için eğilimindedir.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, yıkama arabellek 4 mL ben temiz 4.5 mL tüp tarafından ve WB-1 olarak etiketleyin. Dikkat: Yıkama arabellek ben tahriş edici guanidinium klorür içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından bir temiz 3.6 mL tüp yıkama arabelleğe II 1,5 mL ve WB-2 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından yıkama arabelleğe III temiz 4.5 mL Tüp 3 mL ve WB-3 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, elüsyon arabelleği için bir temiz 1,8 mL tüp 100 µL tarafından ve EB etiketleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bölünmemeli arabellekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 ay boyunca stabildir.</li>
</ol>3. kan koleksiyonundan işaret ve bir virüs enfeksiyonu olan hastalarda
Dikkat: tam kan hastadan toplarken uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak. Eldiven ve gözlük giymek. Hasta yalıtım modunda ise, Biyogüvenlik seviye 4 yordamları izleyin.
<ol><li>Hastanın intravenöz tam kan toplamak için bir kelebek iğne ile küçük uzantısı boru ve bir kan toplama vakum tüpü lizis/bağlama arabellek içeren kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru bir konumda dinlenme ve kelebek iğne alt toplama tüp getirin. Kelebek iğne hastanın damar içine yerleştirin ve kan toplama vakum tüpü küçük uzantısı ekleyebilirsiniz. Not: Bu geri akış engeller.</li>
	<li>Kan toplama sonra 5 - 10 kez tüp saygısız tüp içeriği karıştırın. Not: otomatik olarak 1.6 mL lizis/bağlama arabellek içeren kan toplama tüp kalan boşlukta nedeniyle toplanan örnek hacmi 1.6 mL olacaktır.</li>
	<li>% 70 etanol kullanarak tüp dýþýna dezenfekte.</li>
	<li>Tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve tam kan toplama tüpler-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C veya 37 ° C en az 1 ay7için saklanabilir.</li>
	<li>Doğrudan Basitleştirilmiş NA ayıklama yönteme geçin.</li>
</ol>4. tam kan çıkarılması NA Basitleştirilmiş
<ol><li>NA lizis/bağlama arabellek inaktive toplanan kandan, mix arındırmak için vakum saygısız tarafından tüp içeriğini el ile 5-10 x tüp.</li>
	<li>Tüpün kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın ve boşaltma kapağı.</li>
	<li>MGPs (1 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Yeni bir kapak bir kullanılmayan kan toplama tüp örnek içeren tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat saygısız tüp içeriğini karıştırmak için kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Tüp manyetik tutucu içinde yerleştirin ve kapağını tüp sıkıca kapalı sağlamak için bir parmak tutmak.</li>
	<li>Tüp ile manyetik sahibi tüm MGPs tüp mıknatıs ile tarafında toplanan emin olmak için el tarafından birkaç kez çevirin. Not: Manyetik tutucu uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir.</li>
	<li>Tüp kapağını kaldırmak ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL toplama tüp içine dökme tarafından sadece tüp içeriğini atın. Not: 50 mL toplama tüp aerosoller kapaklı tüp kapatarak kaçının.</li>
	<li>WB-1 (4 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Kapağı güvenli bir şekilde bir parmak ile sıkılır tutmak manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-2 (1,5 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp birkaç saniye için el ile saygısız resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-3 (3 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>EB hazır aliquot dökün (100 µL) doğrudan kan toplama tüp içine.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs EB içinde kan toplama tüp bir parmak ile 5 - 10 kez dokunarak resuspend. Not: Burada protokol duraklatılmış ve tüpler-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Bir damlacık (5-8 µL) resuspended MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet (herhangi bir aşağı akım tanılama NA amplifikasyon tahlil lamba/RT-lamba veya qPCR/RT-qPCR deneyleri kullanılan gibi) kullanarak aşağı akım NA amplifikasyon tepki karışıma aktarın. Not: NAs MGPs için sopa, aşağı akım NA amplifikasyon tepki MGPs kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyon karıştırın. Karıştırma sonra MGPs tüp alt kısmında toplayacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li>
<li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li>
<li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li>
<li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li>
<li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Pressure+Driven%2C+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li>
<li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li>
<li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li>
<li>Schmitz, H., Köhler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li>
<li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li>
<li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li>
<li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li>
<li>Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+microfluidic%2C+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li>
<li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+%28v2.5%29+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li>
<li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone%3A+A+Field+Evaluation+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).</li>
<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan toplama sonra tam inactivation örne...

Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika'da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3' te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tüpleri (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Kan Alma</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 iğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK şırınga (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Küçük delikli uzatma borulu kelebek iğne</td><td>J&oslash; rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>%1 Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Saf LC DNA İzolasyon Kiti I - Liziz/Bağlayıcı Tampon - Dolum</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Saf LC Toplam Nükleik Asit İzolasyon Kiti</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik Tüpler (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik Tüpler (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik Tüpler (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Samco ve ticaret; İnce Uçlu Transfer Pipetleri (1,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Trade; Nunc&ticaret; 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

Burada sunulan iletişim kuralı basit ve etkili ve geniş lizis/bağlama arabellek inaktive bulaşıcı tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir moleküler tahlil için uygulanabilir. Kan inactivation ve NA çıkarma için iş akışı kan toplama camlı7 (Şekil 1A), kan toplama7 (Şekil 1B), ( NA ayıklama hazırlanması da dahil olmak üzere Şekil 1</strong...

Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Bu yöntem, viral enfeksiyon belirtileri olan hastaların bakım noktası teşhisi yapılırken yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, laboratuvar ekipmanı ve elektrik olmadan yapılabilmesi ve dolayısıyla bir hastane koğuşunda yapılabilmesidir. Kan alma prosedürünü gösteren, her ikisi de laboratuvarımdan Tıp Doktoru Anders Fomsgaard ve Bilim Adamı Morten Rasmussen olacak.Kan alma tüplerini hazırlayarak başlayın. 4 ML EDTA vakum tüpüne 1.6 ML ticari bir lizis tamponu enjekte etmek için 3 ML'lik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir inç iğne kullanın. Kan alma için kan alma tüpündeki vakumun korunması çok önemlidir.Bu nedenle, lizis tamponunu kan alma tüpüne enjekte etmek için her zaman bir iğne kullanın. Daha sonra, 960 mikro litre hacminde manyetik cam parçacıklarını veya MGP'leri tamamen yeniden askıya alın ve etiketli bir 1.8ML tüpe aktarın. Sonraki pipet: 4 ML yıkama tamponu, biri WB-1.1.5ML etiketli 4.5 ML'lik bir tüpe, ikisi WB-2 etiketli 3.6 ML'lik bir tüpe ve 3 ML yıkama tamponu, üçü WB-3 etiketli 4.5 ML'lik bir tüpe.Son olarak, EB etiketli 1.8 ML'lik bir tüpe 100 mikro litre elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri kullanılana kadar oda sıcaklığında bırakın. Hastadan intravenöz tam kan almak için, küçük delikli bir uzatma borusu olan bir kelebek iğne ve lizis tamponu içeren önceden hazırlanmış kan alma vakum tüplerinden birini kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru pozisyonda dinlendirin.Kelebek iğneyi hastanın damarına sokun ve kan alma vakum tüpünü küçük delikli uzantıya takın. Kan alındıktan sonra, tüpü beş ila on kez çevirerek tüpün içeriğini karıştırın. Tüpün dışını %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.Daha sonra virüs inaktivasyonu için tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Toplanan kandan nükleik asitleri saflaştırmak için, vakum tüpünü elle beş ila on kez çevirerek tüpün içeriğini tekrar karıştırın. MGP'lerin hazırlanan alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün.Numuneyi içeren tüpün üzerine kullanılmayan bir kan alma tüpünden yeni bir kapak yerleştirin. Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için kapağın üzerine bir parmak yerleştirin ve tüpün içindekileri beş ila on kez çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağın üzerinde tutun.Ardından, MGP'leri mıknatısla birlikte tüpün yanında toplanmadan önce dağıtmak için manyetik tutucuyu tüple birkaç kez çevirin. Tüpün kapağını çıkarın ve tüpün içeriğini tek kullanımlık bir pipet kullanarak 50 ML'lik bir toplama tüpüne atın. Hazırlanan WB-1 alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün ve tüpün kapağını kapatın.İçeriği elle beş ila on kez karıştırın. Daha sonra mıknatısı kullanarak tüpün yan tarafındaki boncukları toplayın ve sıvıyı daha önce olduğu gibi çıkarın. Boncukları hazırlanan WB-2 alikotunda tekrar süspanse edin, ardından çözeltiyi atın ve prosedürü hazırlanmış bir WB-3 alikotu ile tekrarlayın.Son olarak, tüpü manyetik tutucudan çıkarın ve hazırlanan EB alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün. Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve parmağınızla beş ila on kez dokunarak MGP'leri yeniden askıya alın. Son olarak, yeniden süspanse edilmiş MGP'lerin bir damlacığını aşağı akış nükleik asit amplifikasyon reaksiyonu karışımına aktarmak için 1.5 ML'lik tek kullanımlık bir pipet kullanın.PCR reaksiyonuna yalnızca bir damlacık aktarmadan önce MGP'leri tamamen yeniden askıya aldığınızdan emin olun. Kavramın kanıtını göstermek için, negatif tam kan, güney Gine'deki son salgından hazırlanan Ebola virüsü standardının 10 kat seyreltilmesi veya üç farklı Epstein Barr virüsü konsantrasyonu ile çivilendi. Ekstrakte edilen nükleik asitler, kurum içi virüs spesifik R2 qPCR veya qPCR ile analiz edildi.Geçiş eşiği veya BT ne kadar düşükse, viral genom kopya sayısı o kadar yüksek olur. Burada, farklı konsantrasyonlarda Ebola virüsü ile sivri uçlu tam kanlar, Ebola virüsüne özgü bir lamba ile tespit edildi. Çivili tam kan örneğindeki son virüs konsantrasyonu X ekseninde görülür ve pozitife giden dakikalar Y ekseninde görülür.Burada, tam kan, HCV'ye özgü RT qPCR ile tespit edilen bir hepatit C WHO standardize serum örneğinin 10 kat seyreltilmesiyle çivilendi. Son olarak, bu görüntü, Epstein Barr virüsü pozitif tam kan üzerinde Epstein Barr virüsüne özgü bir lamba reaksiyonunun sonuçlarını göstermektedir. Bu prosedürü denerken, belirtilen lizis bağlama tamponunu kullanmak önemlidir.Bu çok önemli bir adımdır ve yöntem için çok önemli bir reaktiftir. Bu lizis bağlama tamponu, numunedeki virüsü etkisiz hale getirecektir. Bu tekniği takiben lamba ve PCR gibi farklı moleküler tespit yöntemleri uygulayabilir ve böylece ayırıcı tanı yapabilirsiniz.

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Çekirdekli hücre zenginleştirme hücre kaybı olmadan yüksek kaliteli örnek izolasyonu sağlar eritrosit lizis ile periferik kan dolaşımını sağlamak için otomatik bir mikroakışkan cihaz geliştirildi.

Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Bu video, silika ile kaplanmış küçük manyetik boncuklar olan manyetik cam parçacıkları (MGP'ler) kullanılarak tam insan kanından nükleik asit ekstraksiyonu için bir tekniği göstermektedir. Kan hücrelerinin bir lizis tamponu kullanılarak parçalanması üzerine, salınan nükleik asitler silika kaplı MGP'lerin yüzeyine bağlanır ve molekülleri numuneden çıkarır.

Kandan Manyetik Cam Parçacık Aracılı Nükleik Asit Ekstraksiyonu için Bir Teknik

TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

Daha fazla analiz için çeşitli bileşenler elde etmek üzere tam kanın işlenmesi için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Klinik olmayan bir ortamda tam kan örneklerinin hızlı, yüksek verimli eş zamanlı işlenmesini sağlayan kolaylaştırılmış bir protokolü optimize ettik.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Burada VirWaTest sunuyoruz, hangi kullanım noktasında su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu ve tespiti için basit, uygun fiyatlı ve taşınabilir bir yöntemdir.

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Sars-CoV-2 için çevre örnekleri toplamak üzere San Diego sakinlerini işe almak için bir vatandaş bilimi projesi tasarlandı. Kullanıcı dostu bir mobil cihaz arayüzü kullanılarak veri gönderimi için çok dilli bir web tabanlı platform oluşturuldu. Laboratuvar bilgi yönetim sistemi, gerçek zamanlı sonuç takibi ile binlerce coğrafi çeşitlilikte numunenin toplanmasını kolaylaştıran bir sistemdir.

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

Protokol, tükürük örneklerinin RT-qPCR moleküler testini gerçekleştirmek için açık kaynaklı otomasyon kullanan bir SARS-CoV-2 tanı yöntemini açıklamaktadır. Bu ölçeklenebilir yaklaşım, klinik halk sağlığı gözetimine ve daha küçük üniversite laboratuvarlarının kapasitesini artırmaya uygulanabilir.

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

Öğrenin, tam kan örneklerinden hızlı virüs nükleik asit çıkarma yöntemini. Bu el ile başucu protokolü, laboratuvar ekipmanı ve elektrik gerektirmeden viral tanı yapılmasını sağlar.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

Daha fazla video keşfet