Stabil Kronik kemirgen Elektrofizyoloji için şırınga enjekte edilebilir Mesh elektronik

Bu yöntem, yaşlanma süreçlerinin beyinde nasıl tezahür ettiği, beynin nasıl geliştiği ve beyin hastalıklarının nasıl ortaya çıktığı ve ilerlediği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ağ elektroniğinin beyne implante edildikten sonra gliozda kronik bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmaması ve çevredeki nöral doku ile kesintisiz bir entegrasyona izin vermesidir. Prosedürü gösterenler, Lieber Group'ta bir yüksek lisans öğrencisi olan Tao Zhou ve Lieber Group'ta bir doktora sonrası olan Jung Min Lee olacak.

Prosedüre başlamak için, bir termal buharlaştırıcıya temiz bir silikon gofret yükleyin ve 100 nanometre nikeli buharlaştırın. Daha sonra, yaklaşık 400 ila 500 nanometre SU-8 kalınlığı için dakikada 400 devirde gofret üzerine SU-8 2000.5 negatif fotorezist sıkın. Alt ağ SU-8 katmanına karşılık gelen fotolitografi maskesi ile SU-8'i ortaya çıkarmak için gofreti bir maske hizalayıcıya yükleyin.

Santimetre kare başına 100 milijoule I-line dozunda maruz bırakın. Onları, gofretleri SU-8 geliştiricisinin tepsisine daldırın. SU-8'deki ağ deseni tamamen gelişene kadar çözeltiyi iki dakika boyunca hafifçe çalkalayın.

Ardından, gofreti bir izopropil alkol tepsisinde bir dakika durulayın ve kurutun. Gofretleri sıcak bir tabakta 180 santigrat derecede bir saat pişirin. Daha sonra, LOR 3A'yı yaklaşık 300 nanometre kalınlık için dakikada 4.000 devirle gofret üzerine sıkın.

Yaklaşık 500 nanometre kalınlık için dakikada 4.000 devirde spin coat S1805 pozitif fotorezist. Daha sonra, metal ara bağlantılara ve giriş, çıkış pedlerine karşılık gelen fotolitografi maskesi iki ile S1805'i ortaya çıkarmak için gofreti bir maske hizalayıcıya yükleyin. Santimetre kare başına 40 milijoule H-line dozunda maruz bırakılın, daha sonra gofreti bir CD-26 fotorezist geliştirici tepsisine daldırın.

Metal ara bağlantı modeli tamamen gelişene kadar çözeltiyi bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Gofretleri deiyonize su dolu bir tepside bir dakika durulayın ve kurulayın. Daha sonra, üç nanometre kromu ve ardından 80 nanometre altını termal olarak buharlaştırın.

Gofreti, metal tamamen alttan kesilene kadar yaklaşık üç saat boyunca düz bir sökücü PG kabına daldırın ve metali yalnızca ağ elektroniğinin arzu edilen ara bağlantı ve giriş, çıkış pedi bölgelerinde bırakın. Sıkma kaplamasını, litografiyi, buharlaştırmayı tekrarlayın ve elektrot bölgelerinde üç nanometre krom ve 50 nanometre platin bırakmak için kaldırın. Daha sonra, üst SU-8 ağ katmanını tanımlamak için SU-8'in spin kaplamasını ve fotolitografisini tekrarlayın.

Gofret'i bir dakika boyunca 50 watt'ta oksijen plazması ile tedavi edin. Daha sonra, ağ elektroniği silikon gofretten tamamen serbest kalana kadar gofret'i yaklaşık üç saat boyunca çözelti içinde nikel aşındırmaya daldırın. Serbest bırakılan ağ elektronik problarını nikel aşındırmadan 100 mililitrelik bir deiyonize su kabına aktarmak için bir pastör pipeti kullanın.

Ardından, durulamayı sağlamak için ağ elektroniklerini en az üç kez deiyonize su dolu taze bir behere aktarın. Ağ elektroniğini bir iğneye yüklemek için, ağ elektroniğini içeren PBS'nin 100 mililitrelik kabına bir cam kılcal iğne yerleştirin. İğnenin ucunu bir ağ elektronik probunun giriş, çıkış pedlerinin yanına yerleştirin ve iğneye bir ağ elektronik probu çekmek için şırıngayı manuel olarak geri çekin.

Ağ elektroniğinin iğne içindeki konumunu ayarlamak için şırınga pistonunu hala tuzlu suya batırılmış durumdayken itin ve çekin. Ağ elektroniğini bir fare beynine enjekte etmek için, kafatası üzerinde istenen koordinatlarda bir kraniyotomi açmak için bir diş matkabı ve stereotaksik çerçeve kullanın. Paslanmaz çelik bir grafik vidası veya telinin yerleştirilmesi için enjeksiyon bölgesinden uzağa ikinci bir kraniyotomi açın.

Ardından, diş çimentosu ile kafatasına bir sıkıştırma substratı sabitleyin. Alt tabakada yaklaşık bir milimetre genişliğinde bir kesim, prosedürün ilerleyen aşamalarında katlama adımının güvenilirliğini artırır. Daha sonra, pipet tutucuyu, ağ elektroniği içeren iğne ile dik açılı bir uç kelepçesi kullanarak stereotaksik çerçeveye monte edin.

Pipet tutucunun yan çıkışını, 0,5 ila bir metre uzunluğunda kılcal boru ile bir şırınga pompasına tutturulmuş beş mililitrelik bir şırıngaya takın. Ardından, iğnenin ucunu beyinde istenen başlangıç konumuna yerleştirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın. Kamerayı, örgü elektronik probun üst kısmını cam iğne içinde gösterecek şekilde konumlandırın.

Şırınga pompasını düşük bir hıza ayarlayarak ve başlat düğmesine basarak akışı başlatın. Ağ elektronik probu iğne içinde hareket etmiyorsa akış hızını yavaşça artırın. Ağ elektroniği probu iğne içinde hareket etmeye başladığında, ağ elektroniğinin işaretli orijinal konumu kılavuz olarak kullanılarak ağ elektronik probunun enjekte edildiği hızda iğneyi geri çekmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın.

İğne kafatasından çıkana kadar tuzlu su akıtmaya ve iğneyi geri çekmeye devam edin. Ardından, şırınga pompasından gelen akışı durdurun. Bu prosedürde, iğneyi boşluk boyunca düz, esnek kablo sıkıştırma alt tabakasına dikkatlice yönlendirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın ve ağ elektroniği bağlantılarında bir gevşeklik oluşturmak için çözeltiyi şırınga pompası ile akıtın.

İğne, sıkıştırma alt tabakasının üzerine ve boşluk boyunca olduğunda, ağ elektronik girişini, çıkış pedlerini sıkıştırma alt tabakasına enjekte etmek için akışa hızlı bir şekilde devam edin. Cımbız ve deiyonize su pipeti kullanarak, girişi, çıkış pedlerini ilk girişe, çıkış pedine mümkün olduğunca yakın 90 derecelik bir açıyla bükün. Giriş yapıldıktan sonra, çıkış pedleri hizalanır ve katlanır ve ağ gövdesine 90 derecelik açıyla, hafifçe akan basınçlı hava ile yerlerinde kurutun.

Sıkıştırma alt tabakasını, giriş, çıkış pedlerinin kenarından yaklaşık 0,5 ila bir milimetre uzakta bir boğaz kenarında kesin. Ayrıca, PCB'ye monte edilmiş 32 kanallı zif konektörüne yerleştirmeyi engelleyecek sıkıştırma alt tabakasının yabancı parçalarını kesin. Ardından, giriş, çıkış pedlerini PCB üzerindeki zif konektörüne takın ve mandalı kapatın.

Başarılı arayüzü doğrulamak için kanallar ve topraklama vidası arasındaki empedansı ölçmek için ölçüm elektroniğini kullanın. Empedans değerleri çok yüksekse, zif konektörünün mandalını açın, yerleştirmeyi ayarlayın ve başarılı bağlantı onaylanana kadar yeniden test edin. Daha sonra, zif konektörünü kapatın ve açıkta kalan ağ elektroniği, koruma için diş çimentosu ile ara bağlantılar.

PCB'yi alt tabakadaki boşlukta çevirin ve PCB'yi çimento ile fare kafatasının üzerine sabitleyin. Serbestçe hareket eden kayıtlar için, önamplifier PCB'sini taktıktan ve referans vidasını toprakladıktan sonra fareyi sınırlayıcıdan serbest bırakın. Fare serbestçe davranırken veri toplama sistemini kullanarak istenen süre boyunca kayıt yapın.

Burada, fare hipokampusuna ve somatosensoriyel korteksine enjekte edilen 32 kanallı örgü elektronik problardan elde edilen temsili yerel alan ısı haritaları gösterilmektedir. Fare, enjeksiyondan iki ay ve dört ay sonra kafesini serbestçe keşfederken veriler kaydedildi. Yerel alan potansiyeli genliği, sağdaki renk çubuğuna göre renk kodludur.

Yüksek geçiren filtre izleri, siyah, sivri yükselme aktivitesini gösterir, 32 kanalın her biri için spektrogram üzerine yerleştirilmiştir. Çizilen verileri sıraladıktan sonra izole edilen ani artış aşağıda verilmiştir. 32 kanalın 26'sında, hem enjeksiyondan iki ay sonra hem de enjeksiyondan dört ay sonra tek birim sivri aktivite tespit edildi.

Bu prosedürü denerken, örgü elektronik probuna başarılı elektrik bağlantısını doğrulamak için G/Ç arayüzünü test etmeyi unutmamak önemlidir. Ölçüm empedansı, herhangi bir sorunun kaynağında sorun gidermeye yardımcı olur ve arayüz veya fabrikasyon ile ilgili sorunları belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bu prosedürü takiben, kaydedilen her elektrotun etrafındaki hücresel ortamı incelemek için histoloji yapılabilir.

Geleneksel, katı beyin problarının aksine, ağ elektroniği histoloji sırasında dokuda bırakılabilir, bu da elektrofizyoloji verilerini immünohistokimyasal analizle hassas bir şekilde ilişkilendirmeyi mümkün kılar.