Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Bu yöntem, lisans öğrencilerinin demir bağlayıcı metaloenzimleri hızlı bir şekilde saflaştırmalarına ve daha sonra bu proteini, tümü öğretim laboratuvarının sınırları içinde, yapı ve işlevle ilgili temel soruları yanıtlamak için kullanmalarına olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, hem olmayan demir bağlayıcı enzimlere uygulanabilir olmasıdır. Lisans öğrencileri tarafından erişilebilirdir ve öğretim laboratuvarında kolayca uygulanır.

Bu prosedüre başlamak için, bir luer kilit çıkışı, ayrıca bir luer kilit bağlantısı içeren bir üst kapak ve reçine parçacıklarını tutmak için bir alt yatak desteği ile donatılmış 1,5 x 20 santimetrelik bir sütun elde edin. Akışı kontrol etmek için alt luer kilit bağlantısını bir vana ile takın. Daha sonra, daha önce dört santigrat derecede depolanmış olan %20 etanol içinde %50 nikel bağlı nitriloasetik asit reçinesi bulamacı içeren bir şişe elde edin.

Reçineyi eşit şekilde yeniden askıya almak için şişeyi hafifçe döndürün. Oda sıcaklığında çalışarak, bulamacın iki milimetresini çekmek ve kolona aktarmak için dereceli bir pipet kullanın. Fazla depolama çözeltisi reçineden boşaldıktan sonra, reçine yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek en az 30 mililitre soğutulmuş lizis bağlama tamponunu dikkatlice eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın.

Sıçramayı önlemek için tamponu sütunun duvarlarından aşağı doğru çalıştırın. Tamponun kolondan yerçekimi ile yavaşça bir toplama kabına akmasına izin vererek reçineyi dengeleyin. Başlamak için, nikel-NTA kolonunu, vanayı açarak ve kalan lizis bağlayıcı tamponun nikel-NTA reçinesi boyunca yerçekimi ile süzülmesine izin vererek hücresiz ham ekstraktların eklenmesi için hazırlayın.

Tampon tamamen boşaldığında ve reçine yüzeyi açığa çıktığında, vanayı kapatın. Ardından, yüzeyi rahatsız etmemeye dikkat ederek hücresiz ham özleri reçine üzerine dikkatlice pipetlemek için bir Pasteur pipeti kullanın. Sıçramayı önlemek için ham özleri sütunun duvarından aşağı akıtın.

Tüm ham ekstraktlar kolona aktarıldıktan sonra, kolonun yerçekimi ile boşalabilmesi için vanayı açın. Daha sonra analiz etmek için 100 mikrolitre akış toplayın. Kolonun kapağına 10 mililitrelik bir luer kilit şırıngası bağlamak için kısa bir plastik boru kullanın.

Şırınga pistonunu dışarı çekin ve ardından sütun kapağını sütunun üstüne sıkıca doldurun. Akış hızını manuel olarak değerlendirmek için eluent'i dereceli bir silindire toplarken pistonu hafifçe sıkıştırın. Dakikada bir ila iki mililitre arasındaki hızlar, reçine ve deney düzeneği ile uyumludur.

Akış hızı yavaşladıkça şırınga pistonunun sıkıştırmasını yavaşça artırın. Uygulanan sıvının menisküsü reçine yatağının beş ila 10 mililitre üzerine ulaştığında, reçineye hava girmesini önlemek için kolon kapağını ve takılı el pompasını çıkarın. Kalan hacmin yerçekimi ile boşalmasına izin verin.

Ham ekstraktların tahliyesi bittikten ve reçine yüzeyi tekrar açığa çıktıktan sonra, reçine yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek kolona dikkatlice yaklaşık 30 mililitre soğutulmuş yıkama tamponu eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın. Vanayı açın ve yıkama tamponunun kolondan akmasına izin verin. Kolon boşalırken, fraksiyon toplama için 16 mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.

Tampon tamamen boşaldığında ve reçine yüzeyi tekrar açığa çıktığında, vanayı kapatın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, reçinenin yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek kolona dikkatlice yaklaşık 30 mililitre soğutulmuş elüsyon tamponu ekleyin. Ardından, elüsyon tamponunun polihistidin etiketli proteini kolondan uzaklaştırmasına izin vermek için vanayı yavaşça açın.

İşaretli mikrosantrifüj tüplerinin her birinde bir mililitre eluent toplayın. Protein testinden sonra, protein içeren fraksiyonları temiz bir konik tüpte birleştirin. Metal iyon kofaktörünün sulandırılmasıyla devam edin veya proteini eksi 80 santigrat derecede üç mililitrelik alikotlarda dondurun.

Metalin sulandırılmasına başlamak için, elüsyon tamponunda süspanse edilmiş saflaştırılmış enzimin üç mililitrelik bir alikotunu buz üzerine koyun. Tüpteki protein hacmini kullanarak, gerekli sodyum askorbat ve ditiotreitol miktarını, her birinin nihai konsantrasyonu numunede 12.5 milimolar olacak şekilde hesaplayın. Katı sodyum askorbat ve ditiyotreitol ekleyin ve tamamen çözünmesi için nazikçe ama iyice karıştırın.

Birkaç mililitrelik katı demir sülfat heptahidrat granülünü bir tartı kağıdına hafifçe vurun. Kağıdı granülün üzerine katlayın ve metal bir spatulanın düz tarafıyla ezin. Elde edilen tozun bir tanesini protein çözeltisini içeren tüpe ekleyin.

Karıştırmak için girdap, pembe-pembe bir renk elde edilir. Tüpü kapatın ve pembe çözeltiyi buz üzerinde 10 ila 30 dakika arasında inkübe edin. Pembe renk zamanla solacaktır.

Jel filtrasyonu için, 1.5 x 12 santimetrelik bir sütunda 10 mililitre küresel poliakrilamid jel ile paketlenmiş ve ayrıca 10 mililitrelik bir rezervuar ile donatılmış bir jel filtrasyon sütunu kullanın. Ardından sütunu metin protokolünde belirtildiği gibi dengeleyin. Tampon kolondan boşaldığında ve üst yatak desteği açığa çıktığında, vanayı kapatın.

Üç mililitrelik demir iki sulandırılmış metaloenzim çözeltisini açıkta kalan üst yatak desteğine pipetleyin. Vanayı açın ve üç mililitrelik numunenin tamamının yerçekimi ile sütuna girmesine izin verin. Eluent'in ilk üç mililitresini atın.

Çözeltiyi tutarken oluşan herhangi bir pembe renk, sütunun üst kısmında sıkışıp kalacaktır. Kolonun damlaması durduğunda ve üst yatak desteği açığa çıktığında, dört mililitre jel filtrasyon tamponu ekleyin ve 8,5 mililitrelik fraksiyonlar üzerinde dört mililitre eluent toplayın. Protein içeren fraksiyonları birleştirdikten sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi numunenin tahlili veya saklanması ile devam edin.

Bu çalışmada, öğrenciler polihistidin etiketli hem olmayan demir bağlayıcı bir dioksijenazı saflaştırdılar ve daha sonra yeniden oluşturdular. SDS-PAGE analizi, etiketli proteinin etkili bir şekilde saflaştırıldığını göstermektedir. Demir iki ile sulandırıldıktan ve ardından jel filtrasyonundan sonra saflaştırılmış L-dopa dioksijenazın enzimatik etkisine ilişkin öğrenci tarafından toplanan aktivite verileri burada gösterilmektedir.

Veri toplama başlamadan önceki beş saniyelik gecikme, bu tekniği ilk kez uygulayan öğrenciler için tipiktir. Kararlı durum testi, ilerleme eğrilerine uydurularak belirlenen kinetik parametrelerin yayınlanan sonuçlarla tutarlı olduğunu gösterir. Bu prosedürü denerken, çok fazla demir protein çökelmesine neden olacağından, daha fazla demirin daha iyi olmadığını hatırlamak önemlidir.

Proteinin üç ila beş molar fazlalığındaki demir konsantrasyonları yeterlidir. Bu prosedürü takiben, öğrenciler çözelti yapısını ölçmek, enzim veya substrata bağlı kimyaya bakmak için ek deneyler yapabilir ve hepsi reaksiyon mekanizması ile ilgili ek soruları yanıtlayabilir.