Name: Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin, immobilize metal afinite kromatografisi kullanarak demir bağlayan metaloenzimleri saflaştırma ve yeniden yapılandırma yöntemini. Bu teknik, lisans öğrencilerinin enzim yapısı ve fonksiyonu hakkında pratik deneyim kazanmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayın Grant No altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur  CHE 1708237.

1. arıtma için hazırlık
<ol><li>Boş hücre ham hazırlanması ayıklamak<ol>
<li>Bu bir 50 mL konik tüp polyhistidine öğesini metalloprotein25 overexpressed E. coli (BL21) ~ 9-10 g hücre Pelet edinin.</li>
		<li>Toplam hacim ~ 45-50 mL için hücre Pelet ~ 9-10 g oda geçici lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) gram başına 5 mL ekleyin. Düzenli olarak dağılması teşvik etmek için girdap. Pelet donmuştu, ılık su banyosu içinde çözülme.</li>
		<li>Buz-su banyosu kullanarak, hücre süspansiyon ~ 3 ° c hücre lizis için hazırlık soğuk. Not: Bu noktada, hücre lizis sonication, boncuk freze veya başka bir yöntemi mümkündür. Çünkü bu nispeten ucuz, hızlı ve does değil istemek kulak koruma boncuk freze burada gösterilmiştir.</li>
		<li>Odası üreticinin talimatlarına göre freze 50 mL boncuk bir araya getirin.</li>
		<li>Dolgu yarım, tam Boncuk Değirmen Odası-20 ° C'de depolanan 0.1 mm cam boncuk soğutulmuş</li>
		<li>Odası kalan soğutulmuş hücre süspansiyon ile doldurun ve 4 ° C lizis/bağlama arabellek odası tamamen doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Şaft boncuk değirmen döndürmek ve hücre süspansiyon boncuk ile karıştırmak için küçük bir spatula kullanın.</li>
		<li>Herhangi bir büyük kabarcıkları ile bir damlalıklı kaldırın ve sonra kapağı üstüne vidala.</li>
		<li>Herhangi bir sızıntı odasından kapalı kuru.</li>
		<li>Buz yaklaşık 1 fincan için açık, Plastik ceket ekleyin, dolu 50 mL odası dolu buz ceket ve vida kapalı içine ters çevir.</li>
		<li>Motor üzerine buz ceketli odası güvenli.</li>
		<li>Boncuk Değirmen 15 saniye 15,800 devirde motor üzerinde açmak, sonra 45 saniye boyunca dinlenmek için izin. 8 kere tekrar edin.</li>
		<li>8 döngüsü tamamlandığında, tüm hücre lizis süspansiyon 50 mL veya daha büyük tüp (25.000 g x veya daha yüksek) yüksek hızlı Santrifüjü için dekor içine dikkatle boşaltmak. 4 ° C hücre artıkları ve cam boncuklar cips 40-45 dakika santrifüj ve 25.000 x g spin dengeli tüpler bir çift koyun. Not: mevcut değildir 50 mL veya daha büyük tüpler için yüksek hızlı Santrifüjü dekor, cam boncuk, centrifuging tarafından kaldırın 1000-2000 g 2-3 dk bir 50 mL konik tüp daha küçük bir güç çıkarmak hücre süspansiyon (~ 25 mL) daha küçük bir hacim verim için x e tüp için yüksek hızlı Santrifüjü dekor.</li>
		<li>Santrifüjü tamamlandığında, berrak, sarı, boş hücre, ham özleri temiz 50 mL konik tüp içine dikkatle boşaltmak. Herhangi bir hücre artıkları aktarmak için dikkat ediniz.</li>
		<li>Boş hücre ham özleri arıtma daha sonraki analizler için küçük bir örnek toplamak SDS-sayfa26tarafından.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IMAC sütun hazırlanması<ol>
<li>Reçine parçacıklar, radarı kilit çıkışı ve ayrıca uygun bir radarı kilit içeren bir üst kap korumak için daha düşük bir yatak desteği ile donatılmış bir 1.5 x 20 cm sütun edinin. Radarı-kilit çıkış akışını kontrol etmek için bir stopcock ile uygun.</li>
		<li>Benchtop çalışma, güvenli bir şekilde sütun bir yüzük stand üzerine monte.</li>
		<li>Nikel-bağlı nitriloacetic asit (Ni-NTA) reçine 4 ° C'de depolanan % 20 etanol içinde % 50 Bulamaç elde</li>
		<li>Yavaşça eşit reçine yeniden askıya için şişe girdap.</li>
		<li>Oda sıcaklığında ve benchtop, reçine polyhistidine 50-60 mg bağlama yeteneğine sahip protein öğesini ve bulamaç sütuna aktarmak 2 mL 1 mL verecektir Bulamaç çekilmeye mezun bir damlalıklı yerleşmiş kullanımı üzerinde çalışıyor.</li>
		<li>Stopcock açın ve reçine düşük yerçekimi tarafından boşaltmak aşırı depolama çözümü sağlar.</li>
		<li>Stopcock güvenli șekilde kapatır</li>
		<li>Pasteur damlalıklı kullanarak dikkatli bir şekilde soğutulmuş lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) ekleyin ve reçine-en az 30 mL sütunun. Reçine yüzey bozmamaya özen. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
		<li>Reçine yavaş yavaş toplama kabı içine yerçekimi tarafından sütundan boşaltmak lizis/bağlama arabellek izin vererek equilibrate.</li>
		<li>Lizis/bağlama arabellek çoğunlukla drene zaman ~ 5 mL lizis arabelleği reçine kaldığında arabellek akışını durdurmak için stopcock kapatın ve dik, devam etmek için hazır kadar veya en fazla 1 hafta monte sütun bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Polyhistidine öğesini hedef tarafından IMAC saflaştırılması
<ol><li>Yıkama tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8) ve elüsyon tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, % 10 gliserol pH 8) hazırlayın. 4 ° C'de soğuk</li>
	<li>Ni-NTA sütun boş hücre ham özleri eklenmesi için stopcock açarak ve Ni-NTA reçine ile yerçekimi tarafından boşaltmak için lizis/bağlama arabellek kalan izin hazır olun. Tüm arabellek süzülmüş ve reçine yüzey maruz stopcock kapatın.</li>
	<li>Bir Pasteur damlalıklı, dikkatle damlalıklı kullanarak hücre ücretsiz ham reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici, ayıklar. Ham özleri duvarları sıçramasına önlemek için sütun aşağı çalıştırın. Ham özleri uygulanan hacmi ifade polyhistidine öğesini protein düzeyine bağlıdır; ham özleri hacmi 50-60 mg içerir emin olmak veya hedef protein mL Ni-NTA reçine başına daha az (bkz. Adım 1.2.4).</li>
	<li>Tüm ham özleri sütuna devredilmiştir sütun yerçekimi tarafından drenaj olabilir bu yüzden stopcock açın. Bu akış için reçine-SDS-sayfa tarafından arınma daha sonraki analizler için toplamak 100 μL bağlanamadı proteinler oluşur. 26
</li>
	<li>Boş hücre ham özleri viskozite yerçekimi akışı sütun önemli ölçüde yavaşlatabilir. Akış oranını artırmak için basit bir "el-pompa" uygulanır:<ol>
<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga al ve kap plastik boru ve sütun kap ve şırınga radarı-kilit bağlantı parçaları arasında kısa uzunluğu kullanarak sütun bağlayın. Şırınga pistonu çizin ve sonra sıkı bir şekilde uygun sütun üst sütun kap.</li>
		<li>Yavaşça şırınga pistonu el ile mezun silindir içine eluent toplayarak akış hızı değerlendirilmesi sırasında sıkıştırmak; 1-2 mL / dakika oranları reçine ve bu kurulum ile uyumludur. Akış hızı yavaşlar gibi yavaşça şırınga pistonu sıkıştırma artırın.</li>
		<li>Hava giriş reçine içine engellemek için sütun başlığını çıkarın ve menisküs uygulanan sıvı reçine yatağın üzerinde 5-10 mm ulaştığında el pompası bağlı ve yerçekimi tarafından boşaltmak zorunda kalan cilt izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre ücretsiz ham özleri boşaltma tamamladıktan ve reçine yüzey tekrar maruz Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk yıkama arabellek sütuna reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
	<li>Stopcock açmak ve yıkama arabellek sütun ile drenaj izin vermek. Bu işlem zayıf ilişkili proteinler reçine kaldırıyor. Eluent atın.</li>
	<li>Yıkama arabellek boşaltma iken, on altı yaşında hazırlamak etiketli, 1 mL kesirleri toplamak için microcentrifuge tüpler.</li>
	<li>Yıkama arabellek süzülmüş ve reçine yüzey tekrar maruz stopcock kapatın. Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk elüsyon arabelleği reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici sütun için – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
	<li>Stopcock yavaş yavaş açmak ve elüsyon arabellek sütun öğesini polyhistidine protein elute izin vermek. 1 mL eluent her işaretli microcentrifuge tüpler, 1-16 arası toplamak.</li>
	<li>Renkölçer protein tahlil Bradford tahlil veya belirli yöntemlerine göre UV-görünür spektroskopisi gibi reaktif ve/veya araç üreticileri27,28tarafından kullanarak protein için kesirler test. Burada gösterildiği gibi Coomassie mavi kullanarak Renkölçer tahlil 100 μL birime her fraksiyonu sadece küçük bir birimden kurban için küçültülür.</li>
	<li>Her kesir Mix 3 μL 100 µL kolorimetrik bir protein ile reaktif tahlil ve el ile protein fraksiyonu varlığını göstermek için herhangi bir renk oluşumu gözlemlemek; algılama bir Spektrometre ile gerekli değildir.</li>
	<li>Protein fraksiyonu 16 bulunursa, eluted kesirler artık önemli miktarda protein içeren kadar 1 mL kesirler ve tahlil protein için düzenli olarak eluting devam edin.</li>
	<li>Protein içeren kesirleri temiz konik tüp içine birleştirmek ve daha sonraki analizler için 100 μL örnek SDS-sayfa26tarafından tutar.</li>
	<li>Metal iyon kofaktör sulandırma ile devam etmek ya da protein 3 mL aliquots-80 ° C'de dondurmak O % 10 gliserol dahil olduğundan emin olun elüsyon arabellek saf protein donma sırasında dengelemek için bir cryoprotectant olduğunu.</li>
	<li>Ni-NTA sütunun elüsyon tamamlandığında, tüm protein sütundur ve kesirler toplanan, elüsyon arabelleği sütun aracılığıyla başka bir 25 mL geçmek ve sütun 4 ° c ~ 5 mL elüsyon arabelleği için kısa süreli depolama depolamak , veya daha uzun vadeli depolama için % 20 etanol ile lizis/bağlama arabellek.</li>
</ol>3. hedef Protein ile Fe2 + sulandırma
<ol><li>Fe2 + ek Not: Bu örnekte L-DOPA dioxygenase gibi enzim bağlama heme olmayan demir (II) etkinliği için bir Fe2 + iyon gerektirir; Ancak, demir (II) etkin olan demir (III), kolayca oksitlenir ve protein bir kısmını herhangi bir demir hiç arındırır.<ol>
<li>Metal sulandırma başlamak için 3 mL saf enzim elüsyon arabellekte askıya alın. Dondurulmuş, hızla ılık su banyosu kullanarak çözme ve bir kez çözdürülen, protein buza koy.</li>
		<li>Protein hacmi tüp kullanarak, sodyum askorbat (198.1 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek yapmak için gerekli miktarı hesaplamak. De, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek olması için gereken miktarını hesaplar.</li>
		<li>Katı sodyum askorbat ve DTT ve tamamen erimesi için yumuşak, ama iyice karıştırın. Protein yağış aşırı saldırgan karıştırma ile neden olmaması için dikkat ediniz. Demir (II) sülfat heptahydrate (MW 278.01 g/mol) az miktarda protein örnek ekleyin.</li>
		<li>Demir tuz, dokunun yeterince küçük bir miktar birkaç 1 elde etmek için mm granül FeSO4•7H2O dışarı sağlam bir parça kağıt tartmak, granül üzerinde kağıt katlama ve metal bir spatula düz tarafıyla ezersin.</li>
		<li>Bir tanesini elde edilen toz protein tüp için ekleyin.</li>
		<li>Girdap karışımı ve pembe pembe renk tüp içinde görünür.</li>
		<li>Pembe çözüm protein, şapkalı, 10-30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Pembe renk yavaş yavaş zaman içinde kaybolacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel filtrasyon<ol>
<li>Küresel polyacrylamide jel 10 mL bir molekül ağırlığı dışlama sınırı yaklaşık 6000 ve 90-180 µm de bir 10 mL rezervuar ile donatılmış bir 1.5 x 12 cm sütundaki sulu parçacık boyutu aralığı dolu bir jel filtrasyon sütun kullanın. Sütun alt ile donatılmıştır ve reçine sütun korumak ve reçine yatak kuru çalışmasını engellemek için 30 um gözenekli polietilen disk şeklinde üst yatak desteklediğinden olun. Jel filtrasyon sütun bir yüzük stand mount.</li>
		<li>Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, kapağını çıkarın ve aşırı arabellek üst yatak destek yukarıda kapalı dökün.</li>
		<li>Sütun equilibrate için arabellek sonraki tahlil ve Muhafazası, örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0 uyumlu ile havzanın doldurarak başlayın.</li>
		<li>Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, arabellek akışını başlatmak ve radarı kayma uygun maruz jel filtrasyon sütun alt ucu çekin. Bir stopcock sonuna radarı kayma sütun uygun ama açık bırakın ve yerçekimi tarafından damla sütun izin.</li>
		<li>Arabellek sütun süzülmüş ve üst yatak destek maruz stopcock kapatın ve çözüm maruz üst yatak desteği üzerine pipetting Fe (II) yeniden metalloenzyme ~ 3 mL sütuna ekleyin.</li>
		<li>Stopcock açmak ve tüm 3,0 mL örnek sütun yerçekimi tarafından girmek izin vermek. Eluent bu ilk 3 mL atmak. Çözüm taşıma sırasında formları herhangi bir pembe renk sütunun üst kısmına sıkışmış.</li>
		<li>Sütun damlama durdurdu ve üst yatak destek maruz, 4 mL jel-filtrasyon arabelleği (Örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0) için sütun ekleyin. Stopcock açın ve eluent microcentrifuge tüpler içine sekiz 0.5 mL kesirleri toplamak.</li>
		<li>Renkölçer protein tahlil veya UV-VIS27,28 daha önce açıklandığı gibi kullanarak protein için kesirler test.</li>
		<li>Protein içeren kesirleri birleştirin.</li>
		<li>Bir örnek SDS-sayfa analizi26için geri alıyorum.</li>
		<li>Tahlil veya bir örnek ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1188-1321">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li>
<li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwitzer%2C+RL+%22Experimental+Biochemistry%22">Experimental Biochemistry</a>. , Macmillan. (1999).</li>
<li>Boyer, R. <a target="_blank" href="https://www.pearson.com/us/higher-education/program/Boyer-Modern-Experimental-Biochemistry-3rd-Edition/PGM122783.html">Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition</a>. , (2001).</li>
<li>le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ale+Maire%2C+M+%22Laboratory+Guide+to+Biochemistry%2C+Enzymology%2C+and+Protein+Physical+Chemistry%3A+A+Study+of+Aspartate+Transcarbamylase%22">Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase</a>. , Springer Science & Business Media. (2012).</li>
<li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBettelheim%2C+FA+%22Laboratory+Experiments+for+General%2C+Organic%2C+and+Biochemistry%22">Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2013).</li>
<li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed065p901">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).</li>
<li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed068p430">Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).</li>
<li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+mutation+to+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students%3A+An+illustration+of+protein+expression+and+purification%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li>
<li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li>
<li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li>
<li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKay%2C+BK+%22Phage+Display+of+Peptides+and+Proteins%3A+A+Laboratory+Manual%22">Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual</a>. , Elsevier. (1996).</li>
<li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21591176">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li>
<li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li>
<li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+writing-intensive%2C+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%3A+A+Bimonthly+Publication+of+the+International+Union+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li>
<li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization%3A+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Known+structure%2C+unknown+function%3A+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li>
<li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/metalloenzymes-use-of-recombinant-protein-expression-and-affinity-tags-to-aid-identification-of-native-metal-ion-cofactors-2161-1009.1000132.php?aid=11177">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li>
<li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/3527600906.mcb.200400107/abstract">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li>
<li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470048672.wecb327/abstract">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li>
<li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="https://Link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-485-2:257">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e45">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li>
<li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2%2C3-dioxygenase%2C+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li>
<li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+overexpression%2C+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2%2C3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li>
<li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li>
<li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis%3A+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li>
<li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016748389390013H">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li>
<li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2%2C3-Dihydroxyphenylpropionate+1%2C2-Dioxygenase+%28MhpB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li>
<li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246%2C+His-199%2C+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2%2C3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li>
<li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC%2C+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li>
<li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma IMAC tarafından eklenmesi biyokimyasal edebiyat3,4,5, IMAC uygulamaları enzim arıtma için hemen hemen her yerde olmuştur iken Biyokimya Laboratuvarı öğretim kalır seyrek ve yayımlanmış yöntemleri her zaman öğretim kaynak sınırlamaları düşünmüyoruz laboratuvar20. Ayrıca, IMAC öğretim laboratuvar etkinliği ve saflık, IMAC arıtma bir enzim ideal öğretim etkinlik yapma değerlendirmek deneyler birleştiğinde en etkili kullanmaktır. Enzimler, metaloenzimlerde, öğretim laboratuvar dahil arıtma IMAC uygulamaya uzatmak için güvenilir ve ucuz Yöntemler gereklidir. Bu protokol için biz benchtop IMAC göstermek hazır ve ucuz Laboratuvar malzemeleri, ayrıca sınırlamalar IMAC uygulama metalloproteins22, iron(II) bağımlı başlamaktan tarafından hitap ederken kullanarak metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, arıtma sonrası. Reaktifler ve açıklanan malzemeleri kullanarak, sekiz öğrenci grupları için sarf malzemeleri arasında $500-600 resim 1 resim 2aldatmacalarını analysis adımlar da dahil olmak üzere bu iletişim kuralını çalıştırmak için dönem başına maliyetidir tahmin ediyoruz.
Hangi ile Fe2 + amino asit ligandlar24 ve facile oksidasyonunu Fe2 + O2 tarafından Fe3 +için sigara-heme, sulandırma ayırmak kolaylığı nedeniyle rekombinant metalloenzyme içine amino asit Şelatatlı iron(II) olduğunu enzim arıtma tipik bir bileşenidir. Klasik Kromatografi kullanıldığında, bazı durumlarda32demir toplam kayıplarını önlemek mümkündür, ancak demir (II) geri azaltılması ajanlar33,34,35huzurunda, daha sık eklenir 36 kez altında bir anaerobik atomosphere37,38,39ve bazı durumlarda demir fazlalığı değil kaldırıldı33,34,36, komplike Sonraki herhangi bir tahlil. Klasik Kromatografi ve anaerobik bir atmosfer ardışık adımlar bu protokolü gelişimi isteyen Lisans Laboratuvarı için gerçekçi değildir.
Ni-NTA sütun el ile hazırlanması ve örnekleri yerçekimi tarafından büyük ölçüde işleme ek zaman ve önceden paketlenmiş sütunları karşılaştırılır ve Kromatografi araçları otomatik zaman çaba sürer iken, el ile gerçekleştirilecek adımlar için yakışıklı-üstünde izin artan işlem arkasında bilim anlayışı sonucunda öğrenci tarafından öğrenme. Burada özetlenen koşullar altında bir demir (II) tuzu aşırı dithiothreitol için özellikle hassas bir ektir. Bir öğrenci, yanlışlıkla dithiothreitol aşırı ekler, yağış olay olasıdır. Bu laboratuvarda, tezgah laboratuvar zaman en etkin şekilde kullanılacak şekilde gelmeden önce reaktif miktarlar hesaplamalar öğrenciler gerektirecek şekilde yararlı bulduk. Tüm benchtop IMAC arıtma - cep-lysis protein elüsyon için-gelen bir 4 saatlik laboratuvar periyotta ardından sulandırma ve tahlil bir sonraki laboratuvar döneminde yapılır.

Özler tarafından immobilize bir metal şelasyon histidin etiketi kullanarak bir ana bilgisayar organizmanın bir öğesini polyhistidine protein saflaştırma ilk raporlarını edebiyat 19881,2' girdi. O zamandan beri polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından ek haline gelmiştir biyokimyasal edebiyat3,4'hemen hemen her yerde karşımıza çıkan, 5. IMAC arıtma yöntemleri otomatik Kromatografi kullanarak benchtop ve spin-sütun biçimlerde uygulanabilir. Benzeşme arıtma yöntemleri, özellikle IMAC, yaygın olarak kullanılan araştırma laboratuvarı, onlar lisans öğretim laboratuvar olarak daha az yaygın vardır. Biyokimya Laboratuvarı için en çok kullanılan laboratuvar ders kitapları düzenli olarak bu yöntemler yerine daha geleneksel iyon değiştirme veya boya-bağlama Kromatografi6,7,8 için gözle öğretmek değil , 9. Örneğin, laktat dehidrogenaz Anderson10 arıtma benzeşme boya-bağlama tarafından ve sığır süt α-laktalbumin7,11 Boyer tarafından arıtma nikel nitriloacetic kullanır asit matris, ama bunun yerine reçine için protein içsel ilgi güvenerek rekombinant poli-histidin etiketi yok, yani. Bazı modern lisans laboratuvar ders kitapları ve yayınlar immobilize metal benzeşme Kromatografi poli-histidin öğesini protein hedefleri yeşil ya da kırmızı-floresan proteinler12,13gibi uygulamak, 14,15, antikorlar16ve seçili enzimler17,18,19,20, hatta bazı bilinmeyen işlev21. Tartışılır, çünkü hedef etkinlik için sonraki oturumlarda deneyim "gerçek bilim" öğrenci adına zenginleştirici denetlesinler bir enzim saflaştırılması öğretim laboratuvar tercih edilir; Gerçekten de, bu tür laboratuvar deneyimleri yayınlandı ve17,18,20,21öğrenci öğrenme üzerinde yararlı sonuçlar bildirdi. Ve henüz, iMac enzim arıtma Biyokimya öğretim laboratuvar seyrek kalır ve yayımlanmış yöntemleri bile erişim genellikle kullanılamaz Kromatografi araçları için tahmin için sınıf laboratuvar uygulamaları 20. Ayrıca IMAC uygulama metalloproteins, özellikle de hangi etkinliği22' ye gerekli olan redoks duyarlı divalent metal bağlamak için sınırlamalar vardır. Sık sık, metal iyon kaybı veya etkin olmayan bir enzim hasta uygun-lisans laboratuvarı verimli arıtma sırasında okside.
Tam üçte enzimlerin bağlamak bir metal iyon23ve demir hayat23tüm formları için neredeyse evrensel bir gereklilik rağmen demir tartışmalı Enzimologiya en sorunlu metal iyonları arasında yer alıyor. Sigara-heme Fe2 + bağlama enzimler IMAC sırasında özellikle eğilimli kaybı ve/veya metal oksidasyon; Muhtemelen heme ve hangi Fe ile ayırmak2 + düşük aminoasit ligandlar24kolaylığı gibi adanmış bir organik ligand eksikliği nedeniyle. Ayrıca, Fe2 + Fe3 + oksijen bağımlı oksidasyon nedeniyle olumsuz serbest enerji değişimi ve Fe3 +göreli istikrar sulu çözelti içinde spontan olduğunu. Çoğu zaman, bu zorlukları anaerobik atmosfer ve/veya sigara IMAC kromatografik yöntemler22kullanımı ile üstesinden vardır. Bu makalede, biz benchtop aktif Fe2 +, sulandırma tarafından takip basit, ucuz Kromatografi malzemeleri kullanarak Fe2 + bağımlı metalloenzyme L-DOPA dioxygenase arındırmak için IMAC kullanımı gösterecektir ve enzimatik tahlil. Bu yöntemler 6-12 öğrenci grupları kendi lisans Biyokimya laboratuarında standart ve enzim araştırmalar lisans düzeyinde repertuarı genişletmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td>sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>BeadBeater 0.1mm cam boncuklar</td><td>BioSpec Ürünler</td><td></td><td>11079101 1 pound her</td></tr><tr><td>biri 50mL Vidalı Kapaklı Konik Tüpler, steril</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, monobazik</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Askorbat</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td> <td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Demir (II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Reçinesi&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Ekono-Kolon Kromatografi Kolonları - 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2 adet&nbsp;</td></tr><tr><td>Musluk Valfi, tek yönlü, dişiden erkeğe luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>50</td></tr><tr><td>BD 10mL luer-loc şırınga paketi (steril olmayan, iğnesiz)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Boru için bağlantı parçası: 1,6 mm Dikenli Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Boru için bağlantı: 1,6 mm Dikenli Erkek Luer&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Boru (1,6 mm İç Çap / 0,8 mm duvar, Peristaltik Pompada 0,2-5 ml / dak için)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>1, 1,6 mm İç Çap / 0,8 mm duvar, 10 m, sıvı işleme için düşük basınçlı boru</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Protein Testi</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, geçmeli kapak, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand polistiren tek kullanımlık serolojik pipetler Fisher</td><td></td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fiserbrand üniversal pipet pompası</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipetleri</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG tuz giderme kolonları</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>30 kutu</td></tr><tr><td>ExpressPlus SAYFA 5x numune tamponu</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Numune ile 1:5 oranında seyreltin)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Jel, %4-20, 12 kuyu</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 jel</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Küvetler, Metayakrilat</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>500 vaka</td></tr><tr><td>Küvet Kapakları Kare Tek Kullanımlık</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihidroksifenilalanin)</td> <td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı Ekipman:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 50mL hazne&nbsp;</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>110803-50SS</td><td>1 odacıklı</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>1107900-101</td><td>350 ml polikarbonat haznesi, rotor tertibatı, motor tabanı, buzlu su soğutma ceketi ve bir pound cam boncuk.</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri, Yüksek Hızlı PPCO, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Mini Prekast Jeller için Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi, 4 jelli</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; 4 jelli dikey elektroforez sistemi, elektrot montajı, eşlik eden çalışma modülü, tank, güç kablolu kapak, mini hücre tampon barajı PowerPac</td></tr><tr><td>HC Güç Kaynağı Bio-Rad</td><td></td><td>1645052</td><td>100&ndash; 120/220&ndash; 240 V, yüksek akım uygulamaları için güç kaynağı,</td></tr><tr><td>UV-Probe Yazılımı ile UV-1800</td> güç kablosu içerir <td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>sürüm 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir polyhistidine tahlil metalloenzyme lisans laboratuvarı etiketli.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

İmmobilize Benchtop metal benzeşme Kromatografi (IMAC), öğesini polyhistidine proteinlerin ve lisans öğrencileri tarafından kolayca hakim en çok kullanılan protein saflaştırma yöntemi modern edebiyat haline gelmiştir. Ama benzeşme Kromatografi uygulamaya metal bağlayıcı proteinler, özellikle bu gibi demir, redoks hassas metaller ile sık sık laboratuvarları bir torpido - lisans içinde düzenli olarak kullanılamaz ekipman erişim sınırlıdır Laboratuvar. Bu makalede, biz bizim benchtop yöntemleri için yalıtım, IMAC bir poli-histidin etiketlendi arıtma ve metal iyon sulandırma, redoks aktif, heme olmayan demir bağlama extradiol dioxygenase ve dioxygenase ile çeşitli substrat tahlil göstermektedir konsantrasyonları ve oksijen doyurarak. Bu yöntemler lisans öğrencileri tarafından yürütülen ve erişilebilir ve öncelikle lisans kurumlarında uygun araçları ile lisans öğretim ve araştırma laboratuvarında uygulanan.

Bu protokol iki ders laboratuvar dönemlerinde BCM 341 idam gibi temsilcisi bu sonuçlar lisans öğrencileri tarafından toplanmıştır: deneysel Biyokimya Muhlenberg Koleji'nde. Bir 20 kDa poli-histidin arıtma sonuçlarını metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, bir 4 saatlik sınıf laboratuvar dönemde iki lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilen olarak etiketlenen ve SDS-PAGE tarafından aynı tarafından analiz Şekil 1 gösterir Öğrenciler bir sonraki laboratuvar dönemde. Etkili bir şekilde poli-histidin öğesini proteindir saflaştırılmış (Şekil 1, lane 2). Poli-histidin öğesini hedef protein az miktarda akışı aracılığıyla içinde (veri) gösterilmez, kayıp bir immunoblot poli-histidin etiketi karşı antikor kullanarak jel gösterir büyük olasılıkla çünkü hedef protein miktarı 100 mg büyüktür bağlama kapasitesi reçine lysate aştı.
Şekil 2 etkinlik öğrenci toplanan veri poli-histidin etiketli metalloenzyme hedef L-DOPA dioxygenase, enzimatik reaksiyon sonra demir (II) ve sonraki jel-filtrasyon protokolü tarafından tanımlandığı gibi sulandırma üzerinde gösterir burada. Beş ölü-zaman veri toplanan başlar bu tekniği ilk kez yürütme öğrencilerin tipik ikincisidir. Metalloenzyme sağlam etkinliği yayımlanmış bir tahlil kullanarak ve kararlı durum kinetik parametrelerin yayımlanan sonuçları29ile tutarlı sunmuştu algılandı. Kararlı durum kinetik parametrelerin Şekil 2' de gösterilen ilerleme eğrileri30 yaklaştırarak belirlenmiştir; Ancak, doğrusal olmayan en küçük kareler uygun substrat konsantrasyonu bir dizi toplanan ilk oranları eşit olası31' dir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Şekil 1. SDS-sayfa26 Analizi poli-histidin protein öncesinde, sırasında ve sonra arıtma etiketledi. Yolları 1 - moleküler ağırlık işaretleri, 2 saf protein (20 kDa) post Ni-NTA, ile 4 - hücre ücretsiz ham özleri önce arıtma, 5 - hücre artıkları Pelet yazı lizis 3-Ni-NTA akışı. Örnekleri 5 x örnek/yükleme arabellek kullanılarak hazırlanan ve önceden döküm 4- polyacrylamide bir jel elektroforez sistemi kullanarak jeller üzerinde ayrılmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Şekil 2. Kararlı duruma tahlil demir (II) metalloenzyme (Yani, L-DOPA dioxygenase, 10µM) substrat (L-DOPA-5 µM (kırmızı), 25 µM (yeşil), 50 µM (mavi)) arabelleği (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8) ile birlikte yeniden düzenlendi. İzleri tasvir ürün oluşumu, 414nm. Absorbans veri sürekli 1 mL metakrilat cuvettes bir split-ışın tarama UV-görünür Spektrometre29kullanarak elde. Ham veri, Michaelis-Menten kararlı durum yaklaşım (KM 30,8 µM ± 14,4, kkedibelirgin 2.3 s-1 ± 0,05)30bir modeli uygun olan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Bu yöntem, lisans öğrencilerinin demir bağlayıcı metaloenzimleri hızlı bir şekilde saflaştırmalarına ve daha sonra bu proteini, tümü öğretim laboratuvarının sınırları içinde, yapı ve işlevle ilgili temel soruları yanıtlamak için kullanmalarına olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, hem olmayan demir bağlayıcı enzimlere uygulanabilir olmasıdır. Lisans öğrencileri tarafından erişilebilirdir ve öğretim laboratuvarında kolayca uygulanır.Bu prosedüre başlamak için, bir luer kilit çıkışı, ayrıca bir luer kilit bağlantısı içeren bir üst kapak ve reçine parçacıklarını tutmak için bir alt yatak desteği ile donatılmış 1,5 x 20 santimetrelik bir sütun elde edin. Akışı kontrol etmek için alt luer kilit bağlantısını bir vana ile takın. Daha sonra, daha önce dört santigrat derecede depolanmış olan %20 etanol içinde %50 nikel bağlı nitriloasetik asit reçinesi bulamacı içeren bir şişe elde edin.Reçineyi eşit şekilde yeniden askıya almak için şişeyi hafifçe döndürün. Oda sıcaklığında çalışarak, bulamacın iki milimetresini çekmek ve kolona aktarmak için dereceli bir pipet kullanın. Fazla depolama çözeltisi reçineden boşaldıktan sonra, reçine yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek en az 30 mililitre soğutulmuş lizis bağlama tamponunu dikkatlice eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın.Sıçramayı önlemek için tamponu sütunun duvarlarından aşağı doğru çalıştırın. Tamponun kolondan yerçekimi ile yavaşça bir toplama kabına akmasına izin vererek reçineyi dengeleyin. Başlamak için, nikel-NTA kolonunu, vanayı açarak ve kalan lizis bağlayıcı tamponun nikel-NTA reçinesi boyunca yerçekimi ile süzülmesine izin vererek hücresiz ham ekstraktların eklenmesi için hazırlayın.Tampon tamamen boşaldığında ve reçine yüzeyi açığa çıktığında, vanayı kapatın. Ardından, yüzeyi rahatsız etmemeye dikkat ederek hücresiz ham özleri reçine üzerine dikkatlice pipetlemek için bir Pasteur pipeti kullanın. Sıçramayı önlemek için ham özleri sütunun duvarından aşağı akıtın.Tüm ham ekstraktlar kolona aktarıldıktan sonra, kolonun yerçekimi ile boşalabilmesi için vanayı açın. Daha sonra analiz etmek için 100 mikrolitre akış toplayın. Kolonun kapağına 10 mililitrelik bir luer kilit şırıngası bağlamak için kısa bir plastik boru kullanın.Şırınga pistonunu dışarı çekin ve ardından sütun kapağını sütunun üstüne sıkıca doldurun. Akış hızını manuel olarak değerlendirmek için eluent'i dereceli bir silindire toplarken pistonu hafifçe sıkıştırın. Dakikada bir ila iki mililitre arasındaki hızlar, reçine ve deney düzeneği ile uyumludur.Akış hızı yavaşladıkça şırınga pistonunun sıkıştırmasını yavaşça artırın. Uygulanan sıvının menisküsü reçine yatağının beş ila 10 mililitre üzerine ulaştığında, reçineye hava girmesini önlemek için kolon kapağını ve takılı el pompasını çıkarın. Kalan hacmin yerçekimi ile boşalmasına izin verin.Ham ekstraktların tahliyesi bittikten ve reçine yüzeyi tekrar açığa çıktıktan sonra, reçine yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek kolona dikkatlice yaklaşık 30 mililitre soğutulmuş yıkama tamponu eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın. Vanayı açın ve yıkama tamponunun kolondan akmasına izin verin. Kolon boşalırken, fraksiyon toplama için 16 mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.Tampon tamamen boşaldığında ve reçine yüzeyi tekrar açığa çıktığında, vanayı kapatın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, reçinenin yüzeyini rahatsız etmemeye dikkat ederek kolona dikkatlice yaklaşık 30 mililitre soğutulmuş elüsyon tamponu ekleyin. Ardından, elüsyon tamponunun polihistidin etiketli proteini kolondan uzaklaştırmasına izin vermek için vanayı yavaşça açın.İşaretli mikrosantrifüj tüplerinin her birinde bir mililitre eluent toplayın. Protein testinden sonra, protein içeren fraksiyonları temiz bir konik tüpte birleştirin. Metal iyon kofaktörünün sulandırılmasıyla devam edin veya proteini eksi 80 santigrat derecede üç mililitrelik alikotlarda dondurun.Metalin sulandırılmasına başlamak için, elüsyon tamponunda süspanse edilmiş saflaştırılmış enzimin üç mililitrelik bir alikotunu buz üzerine koyun. Tüpteki protein hacmini kullanarak, gerekli sodyum askorbat ve ditiotreitol miktarını, her birinin nihai konsantrasyonu numunede 12.5 milimolar olacak şekilde hesaplayın. Katı sodyum askorbat ve ditiyotreitol ekleyin ve tamamen çözünmesi için nazikçe ama iyice karıştırın.Birkaç mililitrelik katı demir sülfat heptahidrat granülünü bir tartı kağıdına hafifçe vurun. Kağıdı granülün üzerine katlayın ve metal bir spatulanın düz tarafıyla ezin. Elde edilen tozun bir tanesini protein çözeltisini içeren tüpe ekleyin.Karıştırmak için girdap, pembe-pembe bir renk elde edilir. Tüpü kapatın ve pembe çözeltiyi buz üzerinde 10 ila 30 dakika arasında inkübe edin. Pembe renk zamanla solacaktır.Jel filtrasyonu için, 1.5 x 12 santimetrelik bir sütunda 10 mililitre küresel poliakrilamid jel ile paketlenmiş ve ayrıca 10 mililitrelik bir rezervuar ile donatılmış bir jel filtrasyon sütunu kullanın. Ardından sütunu metin protokolünde belirtildiği gibi dengeleyin. Tampon kolondan boşaldığında ve üst yatak desteği açığa çıktığında, vanayı kapatın.Üç mililitrelik demir iki sulandırılmış metaloenzim çözeltisini açıkta kalan üst yatak desteğine pipetleyin. Vanayı açın ve üç mililitrelik numunenin tamamının yerçekimi ile sütuna girmesine izin verin. Eluent'in ilk üç mililitresini atın.Çözeltiyi tutarken oluşan herhangi bir pembe renk, sütunun üst kısmında sıkışıp kalacaktır. Kolonun damlaması durduğunda ve üst yatak desteği açığa çıktığında, dört mililitre jel filtrasyon tamponu ekleyin ve 8,5 mililitrelik fraksiyonlar üzerinde dört mililitre eluent toplayın. Protein içeren fraksiyonları birleştirdikten sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi numunenin tahlili veya saklanması ile devam edin.Bu çalışmada, öğrenciler polihistidin etiketli hem olmayan demir bağlayıcı bir dioksijenazı saflaştırdılar ve daha sonra yeniden oluşturdular. SDS-PAGE analizi, etiketli proteinin etkili bir şekilde saflaştırıldığını göstermektedir. Demir iki ile sulandırıldıktan ve ardından jel filtrasyonundan sonra saflaştırılmış L-dopa dioksijenazın enzimatik etkisine ilişkin öğrenci tarafından toplanan aktivite verileri burada gösterilmektedir.Veri toplama başlamadan önceki beş saniyelik gecikme, bu tekniği ilk kez uygulayan öğrenciler için tipiktir. Kararlı durum testi, ilerleme eğrilerine uydurularak belirlenen kinetik parametrelerin yayınlanan sonuçlarla tutarlı olduğunu gösterir. Bu prosedürü denerken, çok fazla demir protein çökelmesine neden olacağından, daha fazla demirin daha iyi olmadığını hatırlamak önemlidir.Proteinin üç ila beş molar fazlalığındaki demir konsantrasyonları yeterlidir. Bu prosedürü takiben, öğrenciler çözelti yapısını ölçmek, enzim veya substrata bağlı kimyaya bakmak için ek deneyler yapabilir ve hepsi reaksiyon mekanizması ile ilgili ek soruları yanıtlayabilir.

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu video, metallopeptidaza karşı rekombinant antikorların üretimi için bir prosedürü göstermektedir. Antikor, yeşil floresan proteini ve antibiyotik direnci genlerini taşıyan rekombinant plazmitler, lipofektamin ile epitel hücrelerine transfekte edilir. Transfekte edilen hücreler, rekombinant antikorlar oluşturmak için seçilir ve yetiştirilir.

Metallopeptidaza Karşı Rekombinant Antikorlar Üretmek İçin Bir Yöntem

Sağlam tespit reaktifleri, yeni sıtma teşhis araçları geliştirmek için giderek artan bir gereklilik göstermektedir. Histidin açısından zengin bir sıtma proteini biyobelirteç varlığında uzun süreli ışıldayan sinyal yayan bir iridyum (III) probu tasarlanmıştır. Proteinin çözelti içinde veya manyetik bir parçacık üzerinde hareketsiz hale getirilerek tespit edilmesi, uygulamada esneklik sağlar.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma - kütle spektrometresi (ICP-MS) ile tirelenmiş boyut dışlama kromatografisi, metaloproteinlerin bolluğundaki değişiklikleri doğrudan biyolojik örneklerden ölçmek için güçlü bir araçtır. Burada, moleküler kütleyi ve bilinmeyen proteinlerle ilişkili metal miktarını tahmin etmek için kullanılan bir dizi metaloprotein standardını açıklıyoruz.

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Iyon hareketlilik-kütle spektrometresi ve moleküler modelleme teknikleri, tasarlanmış metal bağlayıcı peptidlerin ve bakır bağlayıcı peptid metanobakinin seçici metal şelat performansını karakterize edebilir. Metal şelat peptidler yeni sınıflar geliştirilmesi metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır.

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.

Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Öğrenin, immobilize metal afinite kromatografisi kullanarak demir bağlayan metaloenzimleri saflaştırma ve yeniden yapılandırma yöntemini. Bu teknik, lisans öğrencilerinin enzim yapısı ve fonksiyonu hakkında pratik deneyim kazanmasını sağlar.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli. (Video) | JoVE Journal

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Daha fazla video keşfet