Name: Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, tek HIV-1 enfekte hücrelerden tam uzunlukta provirusleri amplifiye etmek ve yeni nesil dizileme ile genetik yapısını belirlemek için FLIPS yöntemini. Bu teknik, latent rezervuarı anlamak ve tedavi stratejilerini geliştirmek için kritik olan replikasyon yetenekli provirusleri tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser desteklenmiştir (1U19AI096109 ve 1UM1AI126611-01); bir çare bulmak için Delaney AIDS araştırma Enterprise (meydan) bir amfAR araştırma konsorsiyumu üzerinde HIV ortadan kaldırılması (ARCHE) ortak araştırma bursu Vakfı AIDS Araştırma (amfAR 108074-50-RGRL); Avustralya merkezi HIV ve hepatit Viroloji araştırma (ACH2); UCSF-GIVI merkezi AIDS Araştırma (P30 AI027763); Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (AAP1061681). Dr. Joey Lai, genomik tesis yöneticisi kitaplığı hazırlık ve onun tesisi kullanımı onun eğitimi için tıbbi araştırma Westmead Enstitüsü'nde ve Ramaciotti merkezi genomik (University of New South Wales, Sidney, Avustralya) için teşekkür etmek istiyorum sıralama yürütmek için. Bu çalışma için örnekleri hibe katılımcılar Şükran ile anıyoruz.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

FLIPS tahlil yükseltecek ve tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki sıralama tek için verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemidir. Multipl faktörler ve protokol sayısı ve kalitesi elde sıralarının etkileyen kritik adımları tespit edilmiştir. İlk olarak, hücre sayısı ve hücre nüfus HIV-1 enfeksiyonu sıklığı güçlendirilmiş proviruses sayısını etkiler. Örneğin, bir önceki yayında yaklaşık yarısı kadar çok dizileri saf CD4 aynı numaradan+ T elde karşılaştırıldığında efektör bellek CD4 hücreleri+ T hücreleri. Saf hücreleri genellikle efektör bellek hücreleri2' den daha düşük bir enfeksiyon frekans sahip olmasıdır. İkinci olarak, hücre lizis sütunlara göre çıkarma yöntemleri olarak DNA ekstraksiyon sürecinde kaybetme riski yoktur genomik DNA elde etmek için tercih edilir. Son olarak, herhangi bir PCR tabanlı tahlil gibi ile bulaşma önlenmesi çok önemlidir. Ayrılmış temiz alanlarda ana karışımları, genomik DNA, pozitif denetimleri, DNA arıtma ve miktar ve Kütüphane hazırlık ekleme işleme hazırlamak için belirlenmiş olması. Bu tek kopya deneyleri burada sunulan biri gibi için özellikle önemlidir.
Uygulama döndürür testin ilk katılımcı örnekleri yerine pNL4-3 plazmid gibi olumlu bir denetimin çalıştırılması içermelidir. Kullanılabilir başvuru sıralarını bu Plasmid'ler için elde edilen dizileri karşılaştırıldığında bu herhangi bir sorun giderme önceden HIV-1 pozitif hücrelerinin, kullanımı için izin verir. HIV-1 pozitif hücrelerinin kullanırken, hiçbir proviruses için çok az güçlendirilmiş Eğer HIV-1 alt türü (astar döndürür alt B özgü için tasarlanmış) ve hücre nüfus enfeksiyonu sıklığı dikkate almak önemlidir. Astar dizileri modifiye/diğer alt türleri eşleştirmek için yeniden tasarlanmış olabilir. Ayrıca, bir de olumlu bir denetimi içeren gerçekleştirilen her PCR dahil edilmelidir.
FLIPS SPS dahil olmak üzere önceki sıralama deneyleri sınırlamaları aşmak. Yükseltecek ve sıralamanın tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki döndürür olası çoğaltma yetkinlik, HIV-1 proviruses belirleyebilirsiniz. Bu sadece alt genomik bölgeleri sıralı ve bu nedenle diziler ile bozulmamış astar bağlayıcı siteleri için seçilen SPS kullanarak mümkün değildi. Ayrıca, FLIPS birden çok amplifikasyon ve sıralama astar, önceki tam uzunlukta sıralama deneyleri1,4tarafından istihdam edildi gibi kullanan ile ilgili sınırlamalar üstesinden gelir. NGS ile kombine HIV-1 lt. bölgeleri hedefleyen PCR iki tur üzerinden FLIPS sayısını ve astar gerekli karmaşıklığını azaltır. DÖNDÜRÜR bu nedenle astar uyuşmazlıkları, yani arızalı proviruses hatalı tanımlaması ve bazı proviruses bir nüfus içinde yükseltmek için bir yetersizlik sonuçlarını üzere. FLIPS Protokolü Ayrıca daha etkilidir ve bir yüksek-den geçerek sıralama daha önceki yöntemler sağlar.
Belli ki, FLIPS HIV-1 proviruses genetik kompozisyonu belirlemek mevcut yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Ancak, FLIPS sınırlamaları kabul etmek önemlidir. Analizler FLIPS yükselterek olup olmadığını her HIV-1 provirus bir hücre nüfus mevcut belirlemek için tamamlanmamış gibi öncelikle, FLIPS tahlil gizli HIV-1 depo, boyutunu ölçmek için bir araç olarak geliştirilmiş değil. DÖNDÜRÜR, bunun yerine farklı hücre nüfus2arasında baraj gölünün kompozisyon göreli karşılaştırmaları yapmak için kullanışlıdır. İkinci olarak, çoğaltma-yetkinlik sağlam HIV-1 proviruses, in vivo analizleri, örneğin Ho vd tarafından geçekleştirilen olmadan kesinlikle tespit edilemez 4. üçüncü olarak, FLIPS HIV-1 proviruses entegrasyon siteyi belirlemek üzere tasarlanmamıştır.
Küçük varyasyonları FLIPS protokolü için uygulama artırabilir. Örneğin, dizileri farklı izin verebilirsiniz astar ve sıralı ve güçlendirilmiş için birden fazla HIV-1 alt türlerini değiştirir. Plazma HIV-1 virions nın cDNA sentez iç içe PCR önce eklenmesi mümkündür. Gelecekteki tek molekül sıralama yöntemleri kullanımı de novo derleme gereksinimini ortadan kaldırır.
Entegre HIV-1 proviruses genetik sıralama anlayışımız gizli HIV-1 baraj gölünün artmıştır. DÖNDÜRÜR kompozisyon ve dağıtım gizli rezervuar elucidating gelecekteki çalışmaları için önemli bir araçtır. Bununla birlikte, FLIPS uygulanması havzanın genişletebilirsiniz. Gelecekteki çalışmalar CRISPR-Cas teknoloji için belirli hedefler belirlemek veya kodlama belirlenmesine yardımcı için FLIPS yararlanmak ve virüs ajanları geri gecikme süresi için daha duyarlı olun kodlamayan bölgeler. Viral rekombinasyon büyük iç silme kavşak sitelerinde bakarak daha iyi anlamış.

Uzun vadeli antiretroviral tedavi (ART) bireylerde devam ederse, gizli HIV-1 depo, genetik karakterizasyonu entegre proviruses çoğunluğu1 arızalı ve çoğaltma-beceriksiz olduğunu anlamak için çok önemli olmuştur , 2. Ters transkripsiyon işlemi sırasında hatalar entegre proviral sıra tanıtılmaktadır. Arızalı proviral dizileri oluşturmak bazı mekanizmalar hataya dahil HIV-1 ters transkriptaz enzimi3,4ve/veya APOBEC kaynaklı Hipermutasyon5,6anahtarlama şablonu. İki son yıllarda yapılan çalışmalarda bulduk izole bireyler üzerinde uzun vadeli ART HIV-1 proviruses yaklaşık % 5'i genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili ve HIV-1 plazma düzeyleri sanat kesilmesi üzerine hızlı rebound için katkıda bulunabilir 1 , 2 , 7. önceki çalışmalar çoğaltma yetkili HIV-1 proviruses saf ve bellek CD4 dinlenme inat belirledik+ T hücre önemini gösteren alt kümeleri, (orta, geçiş ve efektör bellek T hücreleri de dahil olmak üzere) Bunlar hedefleme gelecekte giderme stratejileri2,8,9hücreleri.
Dağıtım, dinamikleri ve gizli HIV-1 rezervuar bakım erken anlayışlar genetik olarak HIV-1 genom10 alt genomik bölgeleri karakterize tek proviral sıralama (SPS) yöntemleri kullanımı elde edildi ,11,12,13. SPS bir tek HIV-1 provirus üzerinden tek bir virüslü hücrede bulunan sıra için çok yönlü bir araçtır. Ancak, SPS sadece astar bağlayıcı siteleri içinde büyük silme işlemlerini içeren alt genomik bölgeler ve özlüyor proviruses dizileri beri proviruses, çoğaltma yetkinlik belirleyemiyor. Bir önceki çalışma SPS tarafından çoğaltma yetkili rezervuar boyutunu overestimates göstermiştir 13 - için 17 - kat seçici sağlam alt genomik bölgeler2sıralama yoluyla.
SPS, Ho ve ark. sınırlamaları gidermek için 4 ve Bruner vd. 1 deneyleri sıra tam uzunlukta HIV-1 proviruses yakınındaki geliştirdi. Bu genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses sıklığını tespit edilecek uzun vadeli sanat bireylerde izin verdi. Bu deneyleri ve güçlendirilmiş sıralı (Sanger üzerinden sıralama) sonra (olduğu gibi veya serisini arızalı) HIV-1 provirus elde etmek için toplandı alt genomik bölgeler. Bu yaklaşımın üç sınırlamalar şunlardır: 1) birden fazla sıralama astar kullanımı istemeden kusurları proviral dizisi tanıtımı riskini artırır, 2) astar uyuşmazlıkları amplifikasyon engelleyebilir belirli proviruses ve 3) genellikle Tüm proviral sıra bu yöntemler teknik nedeniyle çözümlenemiyor.
Varolan tam uzunlukta HIV-1 proviral sıralama deneyleri sınırlamalarını aşmak için Full -Lmesafe benkaynaklandığıdır Proviral Sequencing (döndürür) tahlil geliştirilmiştir. DÖNDÜRÜR bir nesil sıralama (NGS) olduğunu-hangi güçlendirir ve yüksek üretilen iş ve verimli bir şekilde tam uzunlukta (sağlam ya da bozuk) HIV-1 proviruses serileri temel alınarak tahlil. FLIPS kullanılan astar sayısını sınırlar gibi önceki deneyleri, avantajlar sağlar; Bu nedenle, proviruses nüfusu sınırlayabilir uyuşmazlıkları yakalanan ya da istemeden kusurları bir viral dizisi tanıştırmak astar olasılığını azaltır. DÖNDÜRÜR aynı zamanda daha az teknik olarak önceki deneyleri meydan okuyor ve 6 ana adımlardan oluşur: 1) lizis HIV-1 enfekte hücreleri, 2) tek HIV-1 proviruses yolu ile iç içe geçmiş PCR seyreltme için son derece korunmuş astar özel kullanarak sınırlama gerçekleştirilen amplifikasyon HIV-1 5' ve 3' U5 LTR bölge (Şekil 1A), 3) arıtma ve miktar güçlendirilmiş ürünler, 4) güçlendirilmiş proviruses Kütüphane hazırlanması için NGS, 5) NGS ve 6) contigs her elde etmek için sıralı proviruses Meclisi de novo tek tek provirus.
FLIPS tarafından oluşturulan dizileri o hangi genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma yetkili (Şekil 1 c)2tanımlamak için eleme sıkı bir süreç tabi olabilir. Genetik olarak olduğu gibi proviruses da bir çoğaltma-beceriksiz provirus üretimi neden tüm bilinen hataları eksikliği. Bu kusurlar dahil: inversiyon dizileri, büyük iç silme, Hipermutasyon/zararlı stop kodon, frameshifts veya mutasyonların 5 sinyal veya ana ambalaj ' splice donör (MSD) sitesi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Şekil 1: tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) tahlil önemli adımlar. (A)HIV-1 DNA genom astar bağlayıcı siteleri tam uzunlukta (kusurlu ve sağlam) HIV-1 proviruses iç içe geçmiş PCR ile yakınındaki yükseltmek için FLIPS tarafından kullanılan 5' ve 3' U5 LTR bölgelerinde ile. (B) yerleşimini 80 örnek wells (20 kuyu her seyreltme için), 4 negatif kontrol kuyu ve 1 pozitif kontrolü de içeren bir 96-şey PCR tabak. (C) genetik olarak sağlam ve potansiyel olarak çoğaltma-yetkili, HIV-1 proviruses tanımlamak için kullanılan eleme süreci. Bu rakam Hiener ve ark. değiştirildi 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>İç içe PCR Nonidet P 40 için 5 mM'ye seyreltin</td></tr><tr><td>İkame çözelti</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K Çözeltisi (20 mg / mL)</td> <td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu termodöngüleyici</td><td></td><td></td> Herhangi <td>bir 96 kuyulu termodöngüleyici kullanılabilir</td></tr><tr><td>Platin Taq DNA Polimeraz Yüksek Sadakatli</td><td>İnvitrojen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x Yüksek Sadakat Tamponu [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Canlandırıcı</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>İnvitrojen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nükleotid Karışımı, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 ve PCR2 Primerleri</td><td></td><td></td><td>tuzdan arındırılmış. (100 & M) H2O</td></tr><tr><td>PCR Plakası 96 Kuyu, Yarım Etek, Tek Çentik Köşesi, Şeffaf</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Yapışkan Contalar</td><td>BioRad</td><td></td><td>MSB1001 96 kuyulu PCR plakasını kapatmak için gereklidir</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Enfeksiyöz Moleküler Klon (pNL4-3)</td><td>Aşağıdaki reaktif, NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH aracılığıyla elde edildi: Dr. Malcolm Martin'den (Cat# 114) HIV-1 NL4-3 Bulaşıcı Moleküler Klon (pNL4-3).</td><td></td><td>105 kopya/mL'ye seyreltilmiş ve pozitif kontrol</td></tr><tr><td>PCR plaka döndürücü veya tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>olarak kullanılır E-GEL 48 %1 Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Prekast %1 agaroz jelleri (96 oyuklu plaka başına iki jel kullanılır). Herhangi bir% 1 agaroz jeli ikame edilebilir. Etidyum bromür içerir.</td></tr><tr><td>DirectLoad Geniş Aralıklı DNA İşaretleyici</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>10 kb'ye kadar menzile sahip herhangi bir merdiven ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Mother E-Base cihazı</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Prekast 48 kuyulu %1 agaroz jelleri çalıştırmak için gereklidir</td></tr><tr><td>Jel Doc EZ Jel Dokümantasyon Sistemi</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Etidyum bromür içeren agaroz jeller için herhangi bir görselleştirme sistemi kullanılabilir</td></tr><tr><td>PlateMax Soyulabilir Isı Yalıtımı</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>Uzun süreli depolama için ısı yalıtım filmi</td></tr><tr><td>96 Kuyulu 0,8 mL Saklama Plakası</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>Manyetik boncuk bazlı PCR saflaştırması için 0,8 mL 96 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>gereklidir Agencourt AMPure XP (PCR saflaştırma kiti)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Manyetik boncuk bazlı PCR saflaştırma kiti. Diğer PCR saflaştırma kitleri burada ikame edilebilir (örn. QIAquick PCR Saflaştırma Kiti (Qiagen Cat # 28106)</td></tr> <tr><td>Etil alkol, saf. Moleküler biyoloji için 200 kanıt</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td>Opsiyonel</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>dsDNA konsantrasyonunu ölçmek için floresan bazlı bir leke</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT İndeks Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Nextera XT DNA kütüphane hazırlama kiti için gereklidir</td></tr><tr><td>Kütüphane Miktar Belirleme Kiti - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Diğer kütüphane miktar belirleme kitleri ikame edilebilir (örn. JetSeq DNA Kütüphanesi Miktar Tayini Lo-Rox Kiti (Bioline Cat # BIO-68029)</td></tr> <tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td></td><td>Otomatik elektroforez sistemi . Yüksek Hassasiyetli DNA kiti ile birlikte kullanın</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA kiti</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>Platform Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplifikasyon tam uzunlukta hiv-1 proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Full-Length bireysel Proviral sıralama (döndürür) tahlil ve tam uzunlukta (sağlam ve arızalı), HIV-1 proviruses tek sıra yükseltmek için tasarlanmış verimli ve yüksek işlem hacmi bir yöntemdir. DÖNDÜRÜR sağlar entegre HIV-1 bir hücre nüfus içinde genetik kompozisyon belirlenmesi. Büyük iç silme gibi ters Transkripsiyon sırasında ortaya çıkan HIV-1 proviral dizileri içinde kusurları tespit yoluyla zararlı stop kodon/Hipermutasyon, frameshift mutasyonlar ve mutasyonlar/silme öğeleri hareket CIS içinde gerekli virion olgunlaşma için FLIPS entegre proviruses çoğaltılması aciz tanımlayabilirsiniz. FLIPS tahlil bu kusurları eksikliği ve bu nedenle potansiyel olarak çoğaltma yetkili olan HIV-1 proviruses tanımlamak için yararlı olabilir. FLIPS Protokolü içerir: lizis HIV-1 enfekte hücre, PCR, tam uzunlukta HIV-1 proviruses iç içe (HIV-1 5'e hedef primerler kullanılarak ' 3'soldan sağa), DNA arıtma ve miktar, Kütüphane hazırlık için yeni nesil sekanslama (NGS), NGS, proviral contigs ve basit bir işlem çoğaltma yetkili proviruses tanımlamak için eleme de novo kurul. DÖNDÜRÜR sağlar sıra için tasarlanmış geleneksel yöntemleri üzerinde avantajları tek proviral sıralama gibi HIV-1 proviruses entegre. DÖNDÜRÜR güçlendirir ve kararlı olmak çoğaltma yetkinlik etkinleştirme tam uzunlukta proviruses dizileri ve aynı zamanda daha az sayıda amplifikasyon astar astar uyuşmazlıkları sonuçlarının önlenmesi, kullanır. FLIPS özellikle gizli rezervuar içinde entegre HIV-1 proviruses genetik peyzaj anlamak için yararlı bir araçtır, ancak, onun kullanımı herhangi bir uygulama için tümleşik HIV-1'in genetik kompozisyon gereklidir genişletebilirsiniz.

FLIPS tahlil güçlendirir ve tam uzunlukta HIV-1 proviruses tek dizileri. Protokol tam uzunlukta proviral dizileri elde etmek için 6 adımdan oluşur. Bu adımlar içerir: lysis ile enfekte hücreleri, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses, DNA arıtma ve miktar Kütüphane hazırlık, NGS, sıralama, iç içe geçmiş PCR ve de novo Meclisi sıralı proviruses. Her adım sonu içinde önce bir sonraki adım (güçlendirilmişÖrneğin DNA, saf DNA, sıralama kitaplığı veya sıra) ürünün kalitesini tespit edilebilir bir denetim noktası kabul edilebilir. Genel değerlendirme her adım sonunda gerçekleştirilen ve beklenen sonuçları aşağıda özetlenen.
İç içe geçmiş PCR güçlendirilmiş ürünler % 1'özel jel (Şekil 3<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank"></a>

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Bu yöntem, HIV provirüslerinin ve farklı hücre tiplerinin genetik bileşiminin belirlenmesi gibi HIV alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Özellikle genetik olarak bozulmamış ve potansiyel olarak çoğaltma yetkin olanların belirlenmesi. Bu tekniğin en önemli avantajları bize tek HIV enfekte hücrelerden tam uzunlukta HIV provirüsler yakın yükseltmek ve daha sonra yeni nesil sıralama bu dizi sağlar.Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tüm arabellekleri hazırlayın. Bir hücre peleti edinin ve milyon hücre başına 100 mikrolitre lysis tampon ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.Hücreleri bir saat boyunca 55 santigrat derecede bir termal döngüde kuluçkaya yatırArak ve sonra 15 dakika boyunca 85 santigrat derece ekleyerek lyse. Tek HIV-1 DNA provirüsleri yükseltmek başlamak için metin protokolü tablo birinde listelenen ilk tur PCR için reaktifler karıştırın. 96 kuyu PCR plakasında 85 kuyuya 38 mikrolitre ekleyin ve bu plakayı PCR 1 olarak etiketlayın.Bundan sonra, PCR 1 plakasını genomik DNA ilavesi için belirlenen açık bir alana taşıyın. Tris hidroklorür kullanarak genomik DNA'yı 1'den 3'e 1'den 81'e kadar bir oranda seyrelterek her seyreltmenin 45 mikrolitresini hazırlayın. Her numuneye iki mikrolitre seyreltilmiş genomik DNA ve her negatif kontrol kuyusu için iki mikrolitre tris hidroklorür ekleyin.Pozitif kontrol kuyusu dışında tüm plakayı kapatın. Daha sonra, pozitif kontrolün eklenmesi için belirlenmiş bir alana geçin. İlgili kuyuya pozitif kontrol iki mikrolitre ekleyin ve sonra tamamen plaka mühür.PrC 1 plakasını kısa bir süre döndürmek ve kuyuların kenarlarından kalan tüm içerikleri aşağı çekmek için bir PCR plaka spinner kullanın. METIN protokolünde belirtildiği gibi, PCR 1 plakasını termal döngüde çalıştırın. Daha sonra, birinci tabloda listelenen ikinci pcr turu için reaktifleri karıştırın.Yeni bir 96 iyi PCR plaka 85 kuyubu PCR 2 karışımı 28 mikrolitre ekleyin. Bu plakayı PCR 2 olarak etiketlayın. Bir plaka spinner kullanarak, kısaca kuyuların kenarlarından herhangi bir kalıntı içeriği aşağı çekmek için PCR 1 plaka spin.Bu plakanın her kuyusu için tris hidroklorür 80 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, PCR 1 plakasının her kuyudan PCR 2 plakalı ilgili kuyulara iki mikrolitre aktarmak için mutli kanallı pipet kullanın. PCR 2 plakasını açık yapışkan lı sargı ile kapatın.PcR 2 plakasını plaka spinner'ında kısaca döndürün. Bu arada, eksi 20 santigrat derece uzun süreli depolama için bir ısı sızdırmazlık filmi ile PCR 1 plaka mühür. PCR 2 plakasını metin protokolünde belirtildiği gibi bir termal döngüde çalıştırın.Sonra kısaca kuyuların kenarlarından herhangi bir kalıntı içeriği aşağı çekmek için PCR 2 plaka spin. Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 60 mikrolitre tris hidroklorür ekleyin. Daha sonra, iki 48 iyi prekast yüzde bir eterlik bromür içeren agarose jeller üzerinde her kuyunun 15 mikrolitre çalıştırın.Güçlendirilmiş ürünü ve yaklaşık boyutlarını içeren kuyuları belirleyin ve jel görüntüsünü kaydedin. Bundan sonra, kuyuların en fazla yüzde 30'unun güçlendirilmiş ürün için pozitif olmadığı seyreltme belirleyin. İlk olarak, PCR 2 plakayı kısa bir süre döndürmek ve kuyuların kenarlarından kalan tüm içerikleri aşağı çekmek için bir plaka döndürücü kullanın.Güçlendirilmiş ürün içeren kuyulardan 40 mikrolitreyi yeni bir 96 kuyu midi plakanın ilgili kuyularına aktarın. Daha sonra, manyetik boncukları oda sıcaklığına getirmeyi ve yüzde 80 etanoliçeren taze bir çözüm hazırlamayı sağlayacak manyetik yem bazlı bir arınma kiti hazırlayın. Boncuklar oda sıcaklığına ulaştıktan sonra iyice askıya alındıklarından emin olmak için onları.Çok kanallı bir pipet kullanarak, midi plakaher kuyuda amplifiye ürün 40 mikrolitre boncuk 40 mikrolitre ekleyin. 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.Sonra, bir manyetik stand için plaka aktarın ve iki dakika dinlenmeye bırakın. Bundan sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Plaka hala standında, her kuyuya yüzde 80 etanol çözeltisi iki yüz mikrolitre ekleyerek boncukyı yıkayın.30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçka ve sonra kaldırmak ve supernatant atın. Bu yıkama işlemini etanol eklemekten supernatant'ı atmaya kadar bir kez tekrarlayın. Çok kanallı pipet kullanarak herhangi bir aşırı etanol kaldırın.Boncuklar 15 dakika kurusun. Bundan sonra, plakayı standdan çıkarın. Her kuyuya 30 mikrolitre elütion tamponu ekleyin ve 10 kez hafifçe borulandırarak karıştırın.İki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Plakayı manyetik standa geri yerleştirin ve iki dakika dinlendirin. Çok kanallı pipet kullanarak, 25 mikrolitre süpernatantı yeni bir 96 kuyu PCR plakanın ilgili kuyularına aktarın.Ardından, her güçlendirilmiş DNA ürününün yaklaşık konsantrasyonunun belirlenmesi ve kaydedilmesi için bir spektrum fotometre kullanın. Bir çift iplikli DNA sayısallaştırma kiti ayarlayın ve steril DNA'sız suda bir kez tampon seyreltin. Düz bir alt doku kültür plakası boş kuyuların uygun sayıda tampon 99 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, üç boş kuyuya yüz mikrolitre arabellek ekleyin. Ölçülecek her güçlendirilmiş ürün için her kuyu içeren tampon için triplicate saflaştırılmış DNA bir mikrolitre ekleyin. Seyreltik lambda çift iplikçikli DNA 10 mikrolitre başına iki nanogram dan sıfır nanogram mikrolitre başına standartları hazırlamak için.Üç kuyuya her çift iplikçikli DNA standardının yüz mikrolitresini ekleyin. Floresan boyayı tamponla 1-200 arasında seyreltin. Hızlı bir şekilde bir örnek, boş veya standart içeren her kuyuya yüz mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı boru ile karıştırın.Bundan sonra, ışık ile temas önlemek için folyo ile plaka kapağı. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, floresan emisyon kaydedin. Her örnekte çift iplikçikli DNA konsantrasyonu belirlemek için kaydedilen ölçümleri kullanın.Daha sonra her saflaştırılmış ürünü suyla seyreltin ve mikrolitre başına 2 nanogram sıfır noktası konsantrasyonuna kadar seyreltin. İç içe PCR'yi takiben, güçlendirilmiş ürünler yüzde bir agarose jel üzerinde çalıştırılır. PCR'nin ilk kalitesi kontroller incelenmekle belirlenebilir.Güçlendirilmiş ürün içeren negatif kontroller kontaminasyonu ve güçlendirilmiş ürün içermeyen pozitif kontroller yetersiz amplifikasyonu gösterir. Sadece tek amplifiye provirüsler içeren son noktada seyreltme çalışan kuyular sıralama için kabul edilir. Bu aşamada farklı uzunluklarda birden fazla güçlendirilmiş provirüs içeren kuyular görselleştirilebilse de, sıralama için seçilmemelidir.De novo montajı için, biraraya getirilen kontiglerin kalitesi yeterli derinlik ve eşitlik için değerlendirilebilir. Karışık popülasyonlar da düzensiz kapsama varlığı ile bu aşamada tespit edilebilir. Bir katılımcıdan izole edilen dizilerin görsel gösterimi, dizilerinin yüzde 97'sinin kusurlu olduğunu gösterir.Efektör ve geçiş belleğinde bulunan bozulmamış diziler ile CD4 pozitif T hücreleri. Bu prosedürü denerken, sadece limitli seyreltme de elde edilen güçlendirilmiş ürünlerin, yani kuyuların en fazla yüzde 30'unun pozitif olduğu, tek bir provirüs içerdiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, güçlendirilmiş ürünler HIV provirüslerin genetik bileşimibelirlemek için sıralanabilir.Bu teknik, gelişiminden sonra, HIV alanında araştırmacılar ın genetik olarak bozulmamış HIV provirüslerinin ve tedavi gören hastalardaki farklı hücre tiplerinin dağılımını keşfetmelerinin ve genetik olarak bozulmamış ve potansiyel olarak replikasyona uygun provirüslerin nerede saklandığını belirlemelerinin önünü açmıştır. HIV enfekte hücrelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve uygun kişisel koruyucu ekipman takmak ve sertifikalı bir laboratuvarda çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

amplification-near-full-length-hiv-1-proviruses-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Burada, insan hücrelerinde Moloney fare lösemi virüsü tabanlı retroviral vektörlerin entegrasyon alanlarının genom çapında haritalanması için bir protokolü açıklıyoruz.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.

Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Öğrenin, tek HIV-1 enfekte hücrelerden tam uzunlukta provirusleri amplifiye etmek ve yeni nesil dizileme ile genetik yapısını belirlemek için FLIPS yöntemini. Bu teknik, latent rezervuarı anlamak ve tedavi stratejilerini geliştirmek için kritik olan replikasyon yetenekli provirusleri tanımlamaya yardımcı olur.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Daha fazla video keşfet