Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Bu yöntem, genomdaki yeni oluşan, önde gelen ve gecikmeli iplikçik DNA'sına kaç ribonükleotidin dahil edildiği gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, maya genomundaki ribonükleotid yoğunluğu ile ilgili nicel ve nitel bilgi sağlayabilse de, memeli genomları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Alkalin jel elektroforezi, tüm genomda ribonükleotid katılımının yarı kantitatif bir görünümünü sağlar ve ipliğe özgü güney lekeleme, belirli bir genomik lokusta daha fazla hassasiyet ve kantitasyona izin verir.

Bu işleme başlamak için, taze hazırlanmış maya genomik DNA'sının her bir örneğine altı mikrolitre bir molar potasyum hidroksit ekleyin ve iki saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. İki saat sonra, numuneleri beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra her numuneye dört mikrolitre 6-6 alkalin DNA yükleme tamponu ekleyin.

Şerit başına 24 mikrolitre DNA örneğinin yüklenmesine izin veren bir tarakla yüzde bir agaroz, 50 milimolar sodyum hidroksit ve bir milimolar EDTA pH sekizden oluşan bir alkali jel dökün. Numune tüplerini kısaca aşağı doğru döndürün. Her numunenin 24 mikrolitresinin tamamını alkali agaroz jelin içine yükleyin.

Uygun bir DNA boyutu işaretleyicisi ekleyin. 30 dakika boyunca 30 voltta elektroforez. Ardından voltajı 10 volta düşürün ve 18 ila 20 saat elektroforez edin.

Ertesi gün jeli nötralize edin. Jeli nötralizasyon tamponu bir içine daldırın ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. Nötralizasyon tamponu karışımını taze tampon ile değiştirin.

Ve 45 dakika daha kuluçkaya yatırın. DNA'yı lekelemek için, nötralize edilmiş jeli, oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe çalkalayarak bir ila 10000 seyreltilmiş sybr altın lekesi içeren 200 mililitre suya batırın. Bir UV transilluminatörü kullanarak DNA'yı görselleştirin.

Alkali jelden gelen DNA, kılcal hareket ile pozitif yüklü bir naylon zara aktarılacaktır. Önce alkali jeli oda sıcaklığında 15 dakika alkali transfer tamponunda bekletin. Daha sonra, naylon zarı kısa bir süre suyla ıslatın ve beş dakika boyunca alkali transfer tamponunda bekletin.

Agaroz jelinin boyutundan biraz daha büyük bir cam fırın tepsisinde üç adet 100 mililitrelik cam kabı ters çevirerek transfer platformunu kurun. Cam beherlerin üzerine bir cam plaka yerleştirin. İki büyük parça üç MMCHR kromatografi kağıdını cam plakanın üzerine örtün.

Kromatografi kağıdının üzerine alkali transfer tamponu dökün ve cam kabın yarısını doldurun. Beş mililitrelik bir cam pipet kullanarak baloncukları düzeltin. Agaroz jeli üstüne yerleştirin.

Yine, baloncukları yumuşatmak. Jelin tüm kenarlarını parafilm ile çevreleyin. Jelin üzerine az miktarda alkali transfer tamponu dökün.

Önceden ıslatılmış naylon zarı jelin üzerine yerleştirin ve kabarcıkları düzeltin. Agaroz jelinin boyutuna göre kesilmiş iki parça kromatografi kağıdı koyun. Bunları zarın üzerine yerleştirin ve kabarcıkları düzeltin.

Transfer sandviçinin üzerine büyük bir kağıt havlu yığını yerleştirin ve kağıt havluların üzerine dikkatlice bir cam tabak yerleştirin. Üstüne ağırlıklı bir nesne ekleyin ve aktarımın gece boyunca oda sıcaklığında devam etmesine izin verin. Ertesi gün, transfer yığınını dikkatlice ayırın.

Membranı oda sıcaklığında iki nötralizasyon tamponunda 15 dakika bekletin. Bir UV çapraz bağlayıcı kullanarak DNA'yı yüklü naylon zara çapraz bağlayın. Otomatik çapraz bağlantı ayarını kullanın.

Hibridizasyon prosedürüne başlamadan önce, radyo işaretli probu metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Islatılmış zarı bir hibridizasyon tüpüne yuvarlayın ve 25 mililitre taze hazırlanmış hibridizasyon tamponu ekleyin. Bir hibridizasyon fırınında bir ila iki saat boyunca rotasyonla 65 santigrat derece inkübe edin.

Çözeltiyi dikkatlice dökün ve 25 mililitre hibridizasyon tamponu artı prob ekleyin. Rotasyonla 16 ila 18 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, çözeltiyi radyoaktif bir atık kabına dökün.

Hibridizasyon tüpüne bir fosfat STS yıkama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika döndürün. Bu şekilde, bir fosfat STS yıkama solüsyonu ile her biri beş dakikalık beş yıkama gerçekleştirin. Fosfat STS yıkama solüsyonu ile beşinci yıkamadan sonra, membranı iki kez fosfat STS yıkama solüsyonu ile yıkayın, her seferinde 15 dakika boyunca iki kez, rotasyonla 65 santigrat derecede yıkayın.

Membranı hibridizasyon tüpünden çıkarmak için cımbız kullanın ve membranı açık bir plastik kılıf koruyucusuna yerleştirin. Örtün ve bir görüntüleme plakasına maruz bırakın. Gerekirse, lekeyi farklı bir prob ile soyun ve yeniden araştırın.

Soymak için, zarı 25 mililitre yüzde 50 formamid 2XSSPE çözeltisi ile örtün ve iki saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Çözeltiyi radyoaktif bir atık kabına dökün. Hibridizasyon tüpüne fosfat STS yıkama çözeltisi iki ekleyin ve 15 dakika boyunca 65 santigrat derecede döndürün.

Daha önce gösterildiği gibi ön hibridizasyon ve hibridizasyonun gerçekleştirilmesinden önce sinyal olmadığını doğrulamak için membranı bir geiger sayacı ile kontrol edin. Bu jel görüntüleri, potasyum hidroksit ile veya potasyum hidroksit olmadan muamele edilmiş maya genomik DNA'sına sahiptir, RNH2'den yoksun hücrelerin genomda daha fazla ribonükleotid tuttuğunu gösterir. Polimeraz iki'nin M644L varyantı, ribonükleotidleri dahil etme yeteneğini azaltırken, M644G mutantı, vahşi tip polimerazdan daha fazla ribonükleotid içerir.

Bir alkalin agaroz jeli, ipliğe özgü güney lekesi analizi ile daha fazla incelenebilir. Bu örnekte, problar, iki zıt oryantasyonda ARS306'ya yakın yerleştirilmiş olan URA3 raportör geni içindeki yeni ortaya çıkan önde gelen DNA zincirine tavlanır. Yeni ortaya çıkan önde gelen ipliğe özgü problar kullanılarak güney blotlamanın temsili sonuçları, ribonükleotidlerde ve yeni ortaya çıkan öncü iplikler DNA'sında vahşi tip bir suşta ve ribonükleotid dahil edilmesi için karışık olan polimerazların alfa, delta ve epsilon varyantlarını ifade eden suşlarda alkali bölünmenin neden olduğu bir DNA parçalanma modelini gösterir.

Bu grafik, radyoaktif sinyalin, güney lekesinden her şeritteki toplamın kesirine göre nicelleştirilmesini göstermektedir. Prosedürü denerken, kilit yüz hücrelerinden her zaman yeni izole edilmiş DNA'yı kullanmayı unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, DNA onarımı alanındaki araştırmacıların, ribonükleotidlerin replikatif DNA polimerazları tarafından dahil edildiği yoğunluğu ve ipliği ölçmelerinin yolunu açtı.

Bu prosedürü takiben, genomdaki ribonükleotidlerin yeri gibi ek soruları yanıtlamak için hidrollenmiş uç dizileme veya HydEn-seq gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Radyoaktif maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken tezgahın ve ekipmanın kirlenmesini önlemek için her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.