Name: Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin fare splenositleri kullanarak patojen ilişkili moleküler desenlerin saat gen ifadesi üzerindeki etkilerini değerlendirme yöntemini. Bu teknik immünoloji ve kronobiyoloji araştırmaları için yeniden üretilebilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser tarafından desteklenmiştir fakülte araştırma hibe Hartford Üniversitesi, üniversite Sanatlar ve Bilimler Dekan'ın ofisinden.

Çalışma sırasında hayvan bakım ve tedavi Ulusal Sağlık Enstitüleri ilkesiyle uyulması, kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak vardı ve Hartford Üniversitesi hayvan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hayvanların sürüklenme
Not: 20 haftalık erkek B6129SF2/J fareler çalışmada kullanılır.
<ol><li>Fareler (Standart genel gider beyaz ışık) 12 h ışık için trene binmek / 12 h karanlık döngüsü 2 hafta önce deney için. Not: Burada zeitgeber zaman (ZT) 0 ışıkları ve ZT12, ışıkları tüm diğer çevresel faktörler (Örneğin, yiyecek, su ve oda sıcaklığında) tutarak karşılık gelen sabit 21.</li>
</ol>2. aletleri, kültür orta ve meydan okuma orta hazırlanması
<ol><li>Otoklav forseps ve diseksiyon makası. Buzlu mikroskop slaytlar alüminyum folyo ve basınçlı kap çiftlerini sarın.</li>
	<li>Kültür orta fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek RPMI 1640 için % 10 son bir konsantrasyon için hazırlayın. Kültür ortamına aşağıdaki PAMPs ekleyerek 10 mL 50 mL tüpler ortamda meydan hazırlamak (RPMI % 10 ile FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), ısı-öldürdü Listeria Monositogenez (108 HKLM/mL), veya başka bir PAMP onun önerilen konsantrasyon.</li>
	<li>Sıcak kültür orta ve meydan okuma orta olarak 37 ° C'de bir su banyosu ve yaklaşık 70 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) Oda sıcaklığında tutmak.</li>
	<li>Kültür bir 10 mL pipet ve pipet yardım etmek için bir 50 mL tüp ve yer buz üzerinde kullanarak orta 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 30 mL % 70 etanol makas ve forseps mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için kabı diseksiyon of a 100 mL kabı ve yer biter ekleyin.</li>
	<li>Lizis arabellek RNA izolasyon için 10 µL β-Mercaptoethanol (altında bir duman hood) ekleyerek arabellek RLT 50 mL tüp içinde her 1 mL hazır olun. Sadece gerekli (yaklaşık 1 x 106 hücreleri oluşur örnek başına 600 µL) olacak miktar olun. Not: Arabellek RLT silika membran için RNA bağlamayı destekler RNA ekstraksiyon kiti bir bileşenidir.</li>
</ol>3. Splenocyte yalıtım ve meydan okuma
<ol><li>Onları kendi özgün kafeste tutma ve 3 L/dak 1 dk. için CO2 durur nefes sonra tedarik devam akış hızında kafesine CO2 ekleyerek narkoz üzerinden belirli zeitgeber zaman fareler ötenazi.</li>
	<li>Servikal yerinden çıkması ile ölüm kafatası tabanında boynun iki tarafında başparmak ve işaret parmağı yerleştirerek onaylayın. Alternatif olarak, kafatası tabanında bir çubuk (Öte yandan kullanarak) hızlı bir şekilde kablolarıylaberaber kuyruk veya servikal vertebra ayrılması kafatası22neden arka bacaklarda Bankası basın.</li>
	<li>Fare gövde ile % 70 etanol ve kağıt havlu ile silin sprey. Üstünde onun sırt ve biraz eğik sağ yan üzerine fareyi getirin. Kürk kes gitsin, anatomi kullanarak, fare sol tarafında hakkında yarım ön ve arka bacakları makas.</li>
	<li>Forseps kullanarak, Karın zarını kapmak ve dikkatle dalak zarar için bir kesik yapın. Forseps ile dalak çıkarın ve Kültür medya buz üzerinde yaklaşık 10 mL içeren bir steril 50 mL tüp içine yerleştirin. Kalan hayvanlar için yineleyin. Not: Dalak bir börülce rengidir ve daha uzun ve böbrek daha düz.</li>
	<li>
Kültür Orta 2 mL ile bir dalak için küçük steril Petri kabına aktarın.
	<ol>
<li>Dalak iki steril buzlu slayt buzlu kısmı arasında taşlama tarafından lunaparkçı. Mümkünse, sorun ve hücreleri ortamda homojenizasyon işlemi sırasında tut.</li>
		<li>Bir kez iyice homojenize damlalıklı kültür splenocytes 50 mL tüp içine 40 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla içeren Orta 2 mL.</li>
		<li>Buzlu slaytları yeni çift, 50 mL tüpler kültür orta ve hücre Süzgeçler kullanarak kalan dalağı için yukarıdaki adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her splenocytes için toplam hacmi 10 mL/tüp içeren 50 mL tüpler 8 mL soğuk kültür ortamının ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 1 x 106 hücreler/iyi 6-şey kültür tabakaları bana ekleyin. Hücreleri de deney için kullanılan farklı PAMPs sayısına karşılık gelen ve bir denetim dahil kuyu sayısını ekleyin. 3 mL kültür ortamının veya meydan okuma orta 3 mL ilgili wells için ekleyin.</li>
	<li>Plakayı %5 CO2 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri de P1000 micropipette bağlı bir 1000 µL damlalıklı ucu kullanarak alt kazı. 15 mL tüp için aynı 1.000 µL damlalıklı ucu kullanarak hücreleri içeren orta aktarın.</li>
	<li>Santrifüjü 167 x g oda sıcaklığında 5 min için de üzerinden hücreleri cips. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 5 mL de PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 167 x g de ikinci kez 5 min için cips, süpernatant kaldırın ve hücreleri parçalayıcı için hücre Pelet lizis arabelleği 600 µL ekleyin. Sonra RNA izolasyon için ilerlemek.</li>
</ol>4. RNA izolasyon ve cDNA sentezi
<ol><li>Splenocytes RNA ekstraksiyon kiti üreticinin yönergelerine uygun kullanarak gelen RNA yalıtmak ve 'isteğe bağlı' sütun üzerinde DNA sindirim gerçekleştirin.</li>
	<li>CDNA sentez önce RNA konsantrasyonu konsantrasyonu en uygun RNA aralığı (en çok 2 µg) içinde olduğunu doğrulamak için bir microvolume spektrofotometre kullanarak cDNA sentez Kit'in belirlemek.</li>
	<li>
Synthesize cDNA her üreticinin yönergelerine uygun ters transkripsiyon seti kullanarak örnekleri için. RNA'ın 10 µL her 20 µL toplam reaksiyon birimindeki örnekleri için kullanın. Ters transkripsiyon (thermocycler çalıştırmak) bitiminde 20 μL Ekle H2O her tepki için.
</li>
	<li>Standart eğri cDNA hazırlamak için 0.5 mL tüp içine birkaç denetim örneklerinden (Örneğin, 5 10 µL toplamda 2 örneklerinden µL) mRNA havuzu için bir P10 veya P20 micropipette kullanarak oluşturun.<ol>
<li>10 µL 2 x transkriptaz ana karışımı ekleyin.</li>
		<li>Ters transkripsiyon bitiminde, standart eğri seyreltme serisinde başlangıç konsantrasyonu ("1") görev yapacak tepki tüp H2O 10 µL ekleyin.</li>
		<li>10 kat seyreltme serisi (1-10-4) 45 µL P100 veya P200 micropipette 10-1, 10-2, 10-3ve 10-4dört 0.5 mL tüpler içine kullanarak su ekleyerek gerçekleştirin.<ol>
<li>5 µL P20 micropipettor, yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix kullanarak başlangıç konsantrasyon "1" (10-1) ilk tüp içine eklemek birkaç kez, sonra transfer 5 µL tüp içine 10-1 tüp belirlenmiş 10-2 ve karışımı.</li>
			<li>5 µL P20 micropipette 10-2 tüp 10-3 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın. 5 µL P20 micropipettor 10-3 tüp 10-4 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
<ol><li>MRNA düzeylerinin göreli Nefelometri qPCR tarafından belirler. İçinde deneysel Kur'u "Nefelometri - göreli standart eğri" ve "TaqMan" Kimya seçin. Değişiklik tepki birime 10 µL. plaka düzenine (Örneğin, hedef gen, standart eğri, muhabir, vb) ilgili bilgileri girin.</li>
	<li>İçerdiği 0.5 µL astar/sonda testin, gen ifade ana karışımı 5 µL, H2O 2 µL ve 2.5 tepki hazırlıkları µL cDNA (10-100 ng).<ol>
<li>Bu standart eğri eklediğinizden emin reaksiyonlar, negatif denetimleri, her tepki performans yinelenen ve hesap olacaktır 2 İlave reaksiyonlar sayısına göre her biri önceki reaktifleri (hariç cDNA) çarparak ana bir karışım hazırlamak Pipetting değişim için.</li>
		<li>Damlalıklı 7.5 µL bir 96-iyi tepki plaka bir micropipette veya bir çok kanallı pipet ile önceden belirlenmiş kuyu içine Ana hazırlanan karışımı. Damlalıklı cDNA bilinmeyenli ve standartları için uygun kuyunun içine 2.5 µL ve H2O negatif kontrol kuyu içine 2.5 µL.</li>
		<li>Çeşitli moleküler saat genler için astar/sonda deneyleri ve aynı zamanda bir tahlil için bir endojen denetimi (Örneğin, β-aktin) içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Göreli ifade değerleri belirlemek için her çoğaltma için Ortalama göreli miktarını hesaplamak sonra her örnek için hedef gen için Ortalama göreli miktarı ile β-aktiniçin Ortalama göreli miktarı bölün.</li>
</ol>6. istatistiksel analiz
<ol><li>İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak, veri sütun istatistikleri seçeneği altında programa girin. Bir tek yönlü ANOVA saat Gen ifadesinin denetimi karşı PAMP meydan sonra ortalama değerleri arasındaki farklar değerlendirmek için Dunnett'ın öğleden hoc testi ile seçin.</li>
</ol>

<ol><li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators%3A+lessons+from+diverse+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li>
<li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22483041">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).</li>
<li>Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+shock+induces+circadian+gene+expression+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells.</a> Cell. 93, 929-937 (1998).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+Central+and+Peripheral+Circadian+Oscillators+in+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+circadian+rhythms+in+mammalian+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms.</a> Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).</li>
<li>Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Clock+Proteins+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Circadian Clock Proteins and Immunity.</a> Immunity. 40, 178-186 (2014).</li>
<li>Keller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+clock+in+macrophages+controls+inflammatory+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages%2C+dendritic+cells%2C+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Publ.+Gr%22%5BJournal%5D)">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li>
<li>Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+responses+to+endotoxin+treatment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Circadian responses to endotoxin treatment in mice.</a> J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).</li>
<li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+LPS+Causes+Transient+Suppression+of+Biological+Clock+Genes+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats.</a> J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).</li>
<li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li>
<li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li>
<li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22184247">The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li>
<li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654533/">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li>
<li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+and+cancer%3A+sleep+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li>
<li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock%3A+pacemaker+and+tumour+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li>
<li>Germain, A., Kupfer, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18680211">CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION.</a> Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5158/basic-mouse-care-and-maintenance">Basic Mouse Care and Maintenance.</a> JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition.</a> AVMA. , (2013).</li>
<li>Silver, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li>
<li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844017321199">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579(2018).</li>
<li>Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https//phenome.jax.org">https//phenome.jax.org</a> (2018).</li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu protokolde, microvolume spektrofotometre ölçmek ve gen ekspresyonu belirlemede kullanılan RNA saflığı değerlendirmek için kullanılabilir. Nükleik asitler absorbe UV ışığı 260 nm, proteinler genellikle 280 ışığı absorbe bir RNA çıkarma işlemi (Örneğin, fenol) sırasında kullanılan diğer potansiyel kirletici 230 tespit olmakla birlikte nm, nm. Bu nedenle, absorbans (bir) oranında 260/280 değerlendirme tarafından nm (RNA protein) ve 260/230 nm (protein olmayan kirletici için RNA) RNA kalitesini tespit edilebilir....

Neredeyse tüm yönleri için 24 h salınımlarını fizyolojisi ve davranış orchestrates, ana saat memelilerde, suprachiasmatic çekirdek hipotalamus1,2içinde (SCN) yer alır. Bir organizma düzeyinde biyolojik süreçleri düzenleyen ek olarak, ana saatini de periferik hücresel saatler boyunca vücut3,4,5eşitler. En az üç birbirine translasyonel transkripsiyon geri besleme döngüleri moleküler saat makine oluşur ise, çekirdek dönemi (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1oluşur, ve saat genler6,7. Çekirdek moleküler saat doğru zamanlama sürdürmek, yanı sıra bazı yardımcı saat gen ürünleri (Örneğin, Rev erbα ve Dbp) da ifade olmayan genlerine düzenleyen, Yani, kontrollü genler (CCGs)6 saat , 7.
Fonksiyonel moleküler saatler çeşitli bağışıklık dokuları (Örneğin, dalak ve lenf bezleri)8 ve hücreleri (Örneğin, B hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar)8,9tarif edilmistir. Bu hücreler algılamak ve moleküler desenleri patojen ilişkili (PAMPs), doğuştan gelen bağışıklık tanıma reseptörleri Toll benzeri reseptörler (TLR)10gibi ile korunmuş mikrobiyal bileşenleri yanıt. Bugüne kadar 13 fonksiyonel TLRs, hangi bakteri hücre duvarı bileşenleri, kamçılı protein ve mikrobiyal nükleik asitler10gibi mikrobiyal bileşenleri tanımak tarif edilmistir. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri TLR4 tarafından tanınan bir hücre duvarı bileşeni sirkadiyen ritim, organizma ve moleküler düzeyde değiştirmek için gösterilmiştir. Örneğin, LPS vivo içinde meydan etkinlik fareler11 tarafından ölçülen fotosentez benzeri faz gecikmeler indüklenen ve indirimli saat gen ekspresyonu SCN (sahne) ve in situ hibridizasyon ve kantitatif PCR ile belirlendiği gibi karaciğer yol açtı, sırasıyla, içinde12sıçanlar. Sonra bir vivo içinde sorun LPS ile qPCR ile ölçülen birkaç saat genlerin değişmiş ifade insan periferik kan lökosit13 ve deri altı yağ dokusu14 analizi ortaya koydu. Son olarak, insan makrofajlar ve fare peritoneal makrofajlar, ayrıca yol açtı ex vivo LPS sorunları qPCR14tarafından ölçülen saat ifade değiştirdi.
Burada, biz PAMPs LPS, (sentetik oligonucleotides içeren bazlar CpG motifler) ODN1826, etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak ve TLR4, TLR9 ve TLR2, tarafından tanınan ısı öldürdü Listeria Monositogenez (HKLM), sırasıyla, Moleküler saat Gen ifadesinin içinde fare splenocytes. Protokol fare splenektomi, splenocyte yalıtım ve meydan okuma, RNA ayıklama, cDNA sentezi ve qPCR birkaç saat genlerin ifade değerlendirmek için içerir. Bu iletişim kuralı çok az hayvan ile bağışıklık hücreleri çok sayıda zamanında edinimi için izin verir veya daha sonra olabilir hücresel manipülasyon ex vivo çeşitli PAMPs ile meydan. Moleküler saat bağışıklık yanıtı8,15,16, çeşitli açılardan modüle gösterilmiştir, bu nedenle, moleküler saat çalışmasının büyük olasılıkla uygun zamana bağımlı varyasyonu zarar bağışıklık yanıtı. Sirkadiyen ritim kesintileri ciddi patolojiler17,18,19,20' ye neden olabilir beri Ayrıca, araştırmacılar splenocytes geniş bir yelpazede meydan okumak için ilgi olabilir moleküller ve saat onların etkisi değerlendirmek.

<table><tbody><tr><td>Buzlu slaytlar</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeçleri</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 veya 74106</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNaz Seti</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri b-aktin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR makinesi StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Hızlı 96 oyuklu reaksiyon plakası (0,1 mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>İstatistiksel Analiz Yazılımı</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

saat gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare splenocytes kullanımı

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Davranış-gen ekspresyonu sirkadiyen ritim fizyolojisi neredeyse tüm yönlerini düzenleyen. Burada, fare splenocytes moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 ve ısı öldürdü Listeria Monositogenez meydan ve moleküler üzerindeki etkileri sirkadiyen incelemek için bir metodoloji mevcut saat. Daha önce çalışmalar LPS etkisi a değişiklik-in vivo ve ex vivo yaklaşımlardan modelleri (Örneğin, fare, sıçan ve insan) bir ürün yelpazesine kullanarak moleküler saat inceleyerek üzerinde odaklanmıştır. Bu iletişim kuralı yalıtım ve saat gen ifade sonrası meydan kantitatif PCR ile değerlendirmek için meydan okuma splenocytes yanı sıra metodoloji açıklanmaktadır. Bu yaklaşım sadece etkisi mikrobiyal bileşenleri ifade saatin değiştirebilir moleküler saat diğer moleküller de ama değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım ayrı nasıl etkilediği PAMP Toll benzeri reseptör etkileşim saat ifade moleküler mekanizması kızdırmak için yararlanılabilir.

Fareler ZT13 kurban edildi, splenocytes izole edildi ve ex vivo PAMPs LPS, ODN1826 veya HKLM meydan. 3 h sonra RNA izole edildi ve qPCR saat, Per2, Dbp ve Rev-erbα tartışmasız denetim hücrelere kıyasla moleküler saat genlerin göreli ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılır. PAMP meydan sonra saat ifade düzeyleri kontrol hücreleri (Şekil 1A) ifadesinde önemli ölçüde farklı değildi. ...

Bu protokolü moleküler saat gen ekspresyonu alter patojen ilişkili moleküler desenleri bulmak için fare splenocytes kullanarak bir teknik anlatılmaktadır.

Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Bu yöntem, mikrobiyal bileşenlerin moleküler saati nasıl değiştirdiği gibi immünoloji ve kronobiyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, gerçekleştirilmesinin kolay olması, farklı mikrobiyal bileşenlerin moleküler saat üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi ve yüksek oranda tekrarlanabilir olmasıdır. Protokole başlamak için, RPMI 1640'a %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar fetal sığır serumu ekleyerek kültür ortamı hazırlayın Listelenen PAMP kültür ortamını ekleyerek 50 mililitrelik tüplerde test edilecek PAMP'ların her biri için 10 mililitre meydan okuma ortamı hazırlayın.Önceden hazırlanmış bir fare gövdesine% 70 etanol püskürtün ve bir kağıt havluyla silin. Fareyi sağ tarafına hafifçe eğik olarak sırt üstü yatırın. Ardından, farenin sol tarafı boyunca, ön ve arka bacakların yaklaşık yarısına kadar diseksiyon makası kullanarak kürkü kesin.Forseps kullanarak peritonu tutun ve dalağa zarar vermeden dikkatlice bir kesi yapın. Dalağı forseps ile çıkarın ve buz üzerinde yaklaşık 10 mililitre kültür ortamı içeren steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra dalağı iki mililitre kültür ortamı ile küçük, steril bir Petri kabına aktarın.Dalağı, iki steril buzlu sürgünün buzlu kısmı arasında öğüterek homojenize edin. İyice homojenize edildikten sonra, splenositleri içeren iki mililitre kültür ortamını 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Splenositleri içeren 50 mililitrelik tüplerin her birine, tüp başına toplam 10 mililitre hacim için sekiz mililitre soğuk kültür ortamı ekleyin.Bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin. Altı oyuklu kültür plakalarına oyuk başına altıncı hücreye yaklaşık bir kez 10 ekleyin. Hücreleri ekledikten sonra, hücrelere üç mililitre kültür ortamı veya üç mililitre meydan okuma ortamı ekleyin.Daha sonra plakaları üç saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bir P1000 mikropipete bağlı 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak hücreleri kuyunun dibinden kazıyın. Aynı pipet ucuyla, hücreleri içeren ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 167 kez g ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini beş mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca 167 kez g'de ikinci kez peletledikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletine 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.Üreticinin talimatlarına göre RNA ekstraksiyon kitini kullanarak RNA'yı splenositlerden izole edin ve isteğe bağlı sütun üstü DNA sindirimini gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarına göre ters transkripsiyon kitini kullanarak numunelerin her biri için cDNA'yı sentezleyin. 20 mikrolitrelik toplam reaksiyon hacmindeki numunelerin her biri için 10 mikrolitre RNA kullanın.Kantitatif PCR gerçekleştirirken standart eğri için kullanılacak cDNA'yı hazırlamak için birkaç kontrol örneğinden mRNA'yı 0,5 mililitrelik bir tüpe çekin. 10 mikrolitre 2X ters transkriptaz ana karışımı ekleyin. Ters transkripsiyonun tamamlanmasının ardından, standart eğri için seyreltme serisinde başlangıç konsantrasyonu olarak işlev gören reaksiyon tüpüne 10 mikrolitre su ekleyin.10 ila eksi bir, 10 ila eksi iki, 10 ila eksi üç ve 10 ila eksi dört olarak belirlenmiş dört adet 0,5 mililitrelik tüpe 45 mikrolitre su ekleyerek on katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirin. Bir P20 mikropipetleyici kullanarak başlangıç konsantrasyonunun beş mikrolitresini ikinci tüpe, 10'u eksi tüpe ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, ardından 10'dan eksi bir tüpe kadar beş mikrolitreyi 10 ila eksi iki tüp olarak belirtilen tüpe aktarın ve karıştırın.Bir P20 mikropipet kullanarak 10 ila eksi iki tüpten 10 ila eksi üç olarak belirtilen tüpe beş mikrolitre aktarın ve karıştırın. Son olarak, bir P20 mikropipetleyici kullanarak beş mikrolitreyi 10 ila eksi üç tüpten 10 ila eksi dört olarak belirtilen tüpe aktarın ve karıştırın. Reaksiyonu, 0.5 mikrolitre primer prob testi, beş mikrolitre gen ekspresyonu ana karışımı, iki mikrolitre su ve 2.5 mikrolitre cDNA içerecek şekilde hazırlayın.RNA örneklerini 96 oyuklu bir qPCR plakasına pipetleyin. Çeşitli moleküler saat genleri için primer prob testlerini inkübe edin ve endojen bir kontrol için bir test ekleyin ve mRNA seviyelerinin nispi kantitasyonunu belirlemek için bir qPCR makinesine yükleyin. Deney düzeneği içinde, kantitasyon, bağıl standart eğri ve TaqMan kimyasını seçin.Ardından, reaksiyon hacmini 10 mikrolitre olarak değiştirin. İlgili bilgileri plaka düzenine girin. qPCR, moleküler saat genleri, saat, Per2, Dbp ve Rev-erb alfa'nın nispi ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için izole RNA üzerinde gerçekleştirildi.PAMP zorluğundan sonra, saat ekspresyon seviyeleri kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde farklı değildi. Per2 ekspresyon seviyeleri, LPS ile zorlanan hücrelerde ve ODN1826 zorlanmamış kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde yükselmiştir. LPS, mRNA seviyeleri tartışmasız kontrollerden önemli ölçüde daha düşük olduğu için Rev-erb alfa ekspresyonunu değiştiren tek PAMP idi.Kontrollerle karşılaştırıldığında, PAMP'ların her biri ile yapılan meydan okumadan sonra Dbp için önemli ölçüde daha düşük mRNA seviyeleri gözlendi. Bu prosedürü takiben, PAMP'lar dışındaki moleküller, splenositlerdeki moleküler saat üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

the-use-mouse-splenocytes-to-assess-pathogen-associated-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Kaynak: Madenspacher, J. H. ve Fessler, M. B. Farelerde deneysel bakteriyel zatürrenin indüksiyonu ve fenotiplenmesi için invaziv olmayan ve teknik olarak yoğun olmayan bir yöntem. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, enfekte bir farenin dalağındaki bakteri yükünün niceli olarak belirlenmesi ve enfeksiyonun şiddetini değerlendirme sürecini göstermektedir. Homojenize dalak seri olarak seyreltilir ve plakalanarak toplam bakteri yükü belirlenir. Ortaya çıkan veriler, sistemik doku içindeki konak-patojen...

Fare dalağında bakteriyel yükün enfeksiyon çalışmaları için değerlendirilmesi

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Burada, duvar ikincil lenfoid organlarda sitokin Interferon gama salgılama hücrelerin içinde situ lokalizasyonu görselleştirmek için basit bir Konfokal görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol, farklı dokularda diğer sitokinlerin görselleştirilmesi için uzatılabilir.

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

Öğrenin fare splenositleri kullanarak patojen ilişkili moleküler desenlerin saat gen ifadesi üzerindeki etkilerini değerlendirme yöntemini. Bu teknik immünoloji ve kronobiyoloji araştırmaları için yeniden üretilebilir bir araç sunar.

Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı

Daha fazla video keşfet