Saat Gen ifadesinin etkisi moleküler desen patojen ilişkili değerlendirmek için fare Splenocytes kullanımı

Bu protokolü moleküler saat gen ekspresyonu alter patojen ilişkili moleküler desenleri bulmak için fare splenocytes kullanarak bir teknik anlatılmaktadır.

Bu yöntem, mikrobiyal bileşenlerin moleküler saati nasıl değiştirdiği gibi immünoloji ve kronobiyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, gerçekleştirilmesinin kolay olması, farklı mikrobiyal bileşenlerin moleküler saat üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi ve yüksek oranda tekrarlanabilir olmasıdır. Protokole başlamak için, RPMI 1640'a %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar fetal sığır serumu ekleyerek kültür ortamı hazırlayın Listelenen PAMP kültür ortamını ekleyerek 50 mililitrelik tüplerde test edilecek PAMP'ların her biri için 10 mililitre meydan okuma ortamı hazırlayın.

Önceden hazırlanmış bir fare gövdesine% 70 etanol püskürtün ve bir kağıt havluyla silin. Fareyi sağ tarafına hafifçe eğik olarak sırt üstü yatırın. Ardından, farenin sol tarafı boyunca, ön ve arka bacakların yaklaşık yarısına kadar diseksiyon makası kullanarak kürkü kesin.

Forseps kullanarak peritonu tutun ve dalağa zarar vermeden dikkatlice bir kesi yapın. Dalağı forseps ile çıkarın ve buz üzerinde yaklaşık 10 mililitre kültür ortamı içeren steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra dalağı iki mililitre kültür ortamı ile küçük, steril bir Petri kabına aktarın.

Dalağı, iki steril buzlu sürgünün buzlu kısmı arasında öğüterek homojenize edin. İyice homojenize edildikten sonra, splenositleri içeren iki mililitre kültür ortamını 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Splenositleri içeren 50 mililitrelik tüplerin her birine, tüp başına toplam 10 mililitre hacim için sekiz mililitre soğuk kültür ortamı ekleyin.

Bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin. Altı oyuklu kültür plakalarına oyuk başına altıncı hücreye yaklaşık bir kez 10 ekleyin. Hücreleri ekledikten sonra, hücrelere üç mililitre kültür ortamı veya üç mililitre meydan okuma ortamı ekleyin.

Daha sonra plakaları üç saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bir P1000 mikropipete bağlı 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak hücreleri kuyunun dibinden kazıyın. Aynı pipet ucuyla, hücreleri içeren ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 167 kez g ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini beş mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca 167 kez g'de ikinci kez peletledikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletine 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Üreticinin talimatlarına göre RNA ekstraksiyon kitini kullanarak RNA'yı splenositlerden izole edin ve isteğe bağlı sütun üstü DNA sindirimini gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarına göre ters transkripsiyon kitini kullanarak numunelerin her biri için cDNA'yı sentezleyin. 20 mikrolitrelik toplam reaksiyon hacmindeki numunelerin her biri için 10 mikrolitre RNA kullanın.

Kantitatif PCR gerçekleştirirken standart eğri için kullanılacak cDNA'yı hazırlamak için birkaç kontrol örneğinden mRNA'yı 0,5 mililitrelik bir tüpe çekin. 10 mikrolitre 2X ters transkriptaz ana karışımı ekleyin. Ters transkripsiyonun tamamlanmasının ardından, standart eğri için seyreltme serisinde başlangıç konsantrasyonu olarak işlev gören reaksiyon tüpüne 10 mikrolitre su ekleyin.

10 ila eksi bir, 10 ila eksi iki, 10 ila eksi üç ve 10 ila eksi dört olarak belirlenmiş dört adet 0,5 mililitrelik tüpe 45 mikrolitre su ekleyerek on katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirin. Bir P20 mikropipetleyici kullanarak başlangıç konsantrasyonunun beş mikrolitresini ikinci tüpe, 10'u eksi tüpe ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, ardından 10'dan eksi bir tüpe kadar beş mikrolitreyi 10 ila eksi iki tüp olarak belirtilen tüpe aktarın ve karıştırın.

Bir P20 mikropipet kullanarak 10 ila eksi iki tüpten 10 ila eksi üç olarak belirtilen tüpe beş mikrolitre aktarın ve karıştırın. Son olarak, bir P20 mikropipetleyici kullanarak beş mikrolitreyi 10 ila eksi üç tüpten 10 ila eksi dört olarak belirtilen tüpe aktarın ve karıştırın. Reaksiyonu, 0.5 mikrolitre primer prob testi, beş mikrolitre gen ekspresyonu ana karışımı, iki mikrolitre su ve 2.5 mikrolitre cDNA içerecek şekilde hazırlayın.

RNA örneklerini 96 oyuklu bir qPCR plakasına pipetleyin. Çeşitli moleküler saat genleri için primer prob testlerini inkübe edin ve endojen bir kontrol için bir test ekleyin ve mRNA seviyelerinin nispi kantitasyonunu belirlemek için bir qPCR makinesine yükleyin. Deney düzeneği içinde, kantitasyon, bağıl standart eğri ve TaqMan kimyasını seçin.

Ardından, reaksiyon hacmini 10 mikrolitre olarak değiştirin. İlgili bilgileri plaka düzenine girin. qPCR, moleküler saat genleri, saat, Per2, Dbp ve Rev-erb alfa'nın nispi ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için izole RNA üzerinde gerçekleştirildi.

PAMP zorluğundan sonra, saat ekspresyon seviyeleri kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde farklı değildi. Per2 ekspresyon seviyeleri, LPS ile zorlanan hücrelerde ve ODN1826 zorlanmamış kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde yükselmiştir. LPS, mRNA seviyeleri tartışmasız kontrollerden önemli ölçüde daha düşük olduğu için Rev-erb alfa ekspresyonunu değiştiren tek PAMP idi.

Kontrollerle karşılaştırıldığında, PAMP'ların her biri ile yapılan meydan okumadan sonra Dbp için önemli ölçüde daha düşük mRNA seviyeleri gözlendi. Bu prosedürü takiben, PAMP'lar dışındaki moleküller, splenositlerdeki moleküler saat üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.