Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Bu yöntem, biyomedikal alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Genetik hastalık modelleri oluşturmak için zebra balığının kullanılması gibi. Bu tekniğin temel avantajı, basit bir yüksek verimli yöntem kullanılarak genotiplerin erken tanımlanmasına izin vermesidir.

Bu yöntem, genetik epilepsilerin zebra balığı modellerini kullanarak kapsamlı araştırmalara olanak sağlasa da, diğer genetik hastalık modellerine ve her türlü mutasyon çalışmasına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, larva yüzgecinin transeksiyonunun kuyruğun pigment boşluğu içinde hassas bir şekilde yapılması gerektiğinden zorluklar yaşayabilir. Zebra balığı larvalarının yüzgeç kesimine başlamadan önce, diseksiyon yüzeyini hazırlayın.

Dokuz santimetrelik bir Petri kabı kapağının iç yüzeyine bir parça otoklav bandı bantlayın ve kapağı stereo mikroskop altına yerleştirin. Pipet ucunun ucunu iki milimetre çapında keserek, üç dpf larvasını minimum stresle barındırmak için bir P1000 pipet ucu hazırlayın. Döllenmeden üç ila beş gün sonra veya dpf, zebra balığı larvalarını bir Petri kabına yerleştirin ve 1x E3 embriyo ortamında 1.5 milimolar trikamid içinde anestezi uygulayın.

Modifiye edilmiş P1000 mikro pipeti kullanarak, zebra balığı larvalarını alın ve uyuşturun ve Petri kabı kapağındaki yerleştirilmiş Otoklav bandına yerleştirin. Larvaları çevreleyen fazla trikain çözeltisini çıkarın. Yüzgeci başarılı bir şekilde ayırmak ve almak için alan mümkün olduğunca kuru olmalı, ancak hayatta kalmayı sağlamak için yine de ıslak olmalıdır.

Kanamayı önlemek ve yüzgeç kırpma sırasında larvaların hayatta kalmasını sağlamak için, transeksiyon pigment boşluğu içinde gerçekleşmelidir. Bu resimde gösterildiği gibi kan dolaşımının sınırına distal. Stereo mikroskop altında çalışarak, kuyruk yüzgecini bölmek için bir mikro neşter kullanın.

Kesi sırasında, notokordun zarar görmesini önlemek için sabit ama hafif bir aşağı doğru basınç uygulayın. Kesitli yüzgeci mikroskop altında görselleştirin ve parçayı mikro neşter bıçağının ucunun üzerine yerleştirin. Yüzgeci içeren mikro neşteri küçük bir filtre kağıdının yüzeyine yerleştirin.

Kesilen dokuda melanositlerin varlığı nedeniyle, yüzgeç küçük bir siyah nokta olarak görünür. Başarılı bir DNA ekstraksiyonu sağlamak için, protokole devam etmeden önce filtre kağıdında yüzgecin yerleşimini işaretleyen siyah bir noktanın gözlemlenmesi önemlidir. Makas ve cımbız kullanarak, yüzgeci içeren filtre kağıdını, 25 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi içeren 96 oyuklu bir PCR plakasının kuyusuna aktarın.

Daha sonra, kuyucukları PCR plakasının etiketine göre numaralandırarak düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın. 200 mikrolitre taze e3 embriyo ortamı ile doldurulmuş modifiye edilmiş P1000 pipetini kullanarak, zebra balığı larvalarını hafif bir basınç kullanarak dikkatlice toplayın. Larvaları 96 oyuklu plakaya PCR plakası ile aynı kuyu numarasında dağıtın.

Kanatçığı içeren filtre kağıdının çözeltiye iyice batırıldığından emin olun. Her kesim arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için, mikro neşterin bıçağını ve cımbızı %70 etanol çözeltisine batırarak temizleyin. Bıçağı temiz bir kağıt mendille silin veya silin.

Tüm larvalar kırpıldığında, larvaları genotipleri tanımlanana kadar 96 oyuklu plakada 28 santigrat derecede saklayın. Bu prosedüre, kanat parçalarını içeren 96 oyuklu PCR plakasını kapatarak ve numuneleri bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyerek başlayın. Tüm filtre kağıtlarının sodyum hidroksit çözeltisine batırıldığından emin olmak için.

Doku lizisi için, numuneleri bir termal döngüleyicide 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Ardından 10 dakika boyunca dört santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra, her numuneye altı mikrolitre 500 milimolar tris-HCL pH8.0 ekleyin.

Örnekleri girdaplayın. Plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1500 kez G'de kısaca santrifüjleyin. Bu yöntemi kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için, yüzgeci daha önce gösterildiği gibi kırpın, ancak kırpılmış yüzgeçli filtre kağıdını, 30 mikrolitre %5 şelatlama reçinesi içeren 96 oyuklu bir PCR plakasının bir kuyusuna ekleyin.

Tüm kanat parçaları kırpıldıktan sonra, 96 oyuklu PCR plakasını kapatın ve tüm filtre kağıtlarının şelatlama reçinesi ile daldırıldığından emin olmak için numuneleri kısaca santrifüjleyin. Numuneleri bir termal döngüleyicide 95 santigrat derecede 15 dakika ısıtın, ardından 10 dakika boyunca dört santigrat dereceye kadar soğutun. Reçine boncuklarını peletlemek için numuneleri kısaca santrifüjleyin ve süspansiyondaki DNA'yı elde edin.

Multipleks bir PCR testi, homozigot mutantlar, heterozigotlar ve vahşi tip larvalar arasında ayrım yapılmasını sağlayacaktır. PCR reaksiyonunu metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. PCR reaksiyonlarını 96 oyuklu termal döngüleyicide gerçekleştirin.

Sodyum borat tamponunda 1x jel kırmızısı ile boyanmış %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın. Prosesi kolaylaştırmak için mümkünse, numunelerin yüklenme süresini kısaltarak daha yüksek verim özellikleri sağlamak için çok kanallı pipetlerle uyumlu bir jel sistemi kullanın. Jeli 1x sodyum borat tamponunda 250 voltta 15 dakika çalıştırın.

Farklı genotiplerin ayırt edilmesine izin vermek için jeli ultraviyole ışık altında görüntüleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi 1,5 milimetre ara plaka ve 15 numune tarağı kullanarak iki adet %12'lik poliakrilamid jel hazırlayarak bu tahlili başlatın. Çalışan tampon olarak dikey bir elektroforez sistemi ve 1x TBE tamponu kullanın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirdikten sonra, PCR ürünlerini beş dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın, ardından 10 dakika boyunca dört santigrat derecede soğutun. PCR numunesi başına 10 mikrolitre ve sekiz mikrolitre moleküler ağırlık işaretleyici yükleyin. Jeli bir saat boyunca 150 voltta veya moleküler ağırlık işaretleyicisi neredeyse cam plakanın ayak çizgisine ulaşana kadar çalıştırın.

Farklı genotiplerin ayırt edilmesine izin vermek için jeli ultraviyole ışık altında görüntüleyin. Bu protokol, mutant ilealin aldh7a1 geninin ilk kaplama ekzonunda 5 baz çifti eklemesine sahip olduğu heterozigot bir çaprazlamanın yavrularının genotiplemesi için kullanıldı. Hem vahşi tip hem de mutant ileallerin PCR amplifikasyonundan beklenen sonuç 434 BP amplikondur.

Mutant ilealin amplifikasyonundan 293 BP'lik bir bant ortaya çıkar ve vahşi tip ileal için 195 BP'lik bir bant elde edilir. %1'lik bir agaroz sodyum borat jeli üzerindeki PCR reaksiyonlarının analizi, ikinci ve altıncı şeritlerde vahşi tip genotipleri, üç, dört ve beşinci şeritlerde heterozigot genotipleri ve birinci şeritte bir homozigot mutant genotipi tanımladı. Heterodubleks erime tahlili ile genotiplendirilen çeşitli mutasyonlar.

Plpbp geninin plpbpot101 ve plpbpot102 mutant ileallerinin her biri bir çerçeve kaymasına ve erken durdurma kodonuna izin verir. Denatürasyon ve tavlamadan sonra, heterozigot hayvanlar için PCR fragmanları, poliakrilamid jel elektroforları kullanılarak kolayca ayrılan ve görselleştirilen heterodubleks ve homodubleks DNA içerecektir. Bileşik heterozigot mutant genotipler iki, dört ve sekizinci şeritlerde, heterozigot genotipler üç, altı, yedi, dokuz ve onuncu şeritlerde ve vahşi tip genotipler beşinci şeritte tanımlanmıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniği kullanarak 96 larvanın yüzgeç kırpılması, uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben, doku ekstraksiyonu için aynı genotipe sahip zebra balığı larvalarının bir araya getirilmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir ve biyobelirteç araştırması ve hastalık modelleri gibi ek soruları yanıtlamak için sipariş edilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, zebra balıklarında hastalık yolu fizyolojisini keşfetmek için metabolik epilepsi modelleri alanında araştırmaların yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bir kuyruk yüzgecinin mikrodiseksiyonu ile üç günlük zebra balığı larvalarının nasıl düzgün bir şekilde genotipleneceğini iyi anlamış olmalısınız.