Name: Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, 3dpf zebra balığı larvalarında kuyruk kırpma yöntemiyle yüksek işlem hacimli genotipleme tekniğini. Bu yöntem genetik hastalık modellerinde erken genotip belirlemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar nadir hastalık modelleri ve mekanizması (RDMM) ağ (in arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) ve genom Kanada tarafından finanse edilir) teşekkür etmek istiyorum. CK UROP burs ödülü (University of Ottawa) tarafından desteklenir. DLJ Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs tarafından desteklenir. IAP, arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) doktora sonrası bursu ödülü tarafından desteklenir. Yazarlar genetik Society of izin verme için America tamamlayıcı Şekil 5 Pena, üzerinden bir uyarlaması kullanılacak ve bu protokol yayımlamak için teşekkür ederiz ve ark.

Maddelerle ilgili hayvan konular onaylanmış olan ve hayvan bakımı kılavuzlarınıza uygun olarak çoğu yordamlar Kanada Konseyi tarafından hayvan bakım ve Ottawa Üniversitesi hayvan bakımı komiteler sağlanan.
1. hazırlık
<ol><li>Diseksiyon yüzey 9 cm Petri kabına kapak Otoklav Bandı ile iç yüzeyi taping tarafından hazırlamak. Stereo mikroskop altında yerleştirin.</li>
	<li>Yer 3-5 gün sonrası döllenme (dpf) bir Petri zebra balığı larvaları yemek ve ˜1.5 mm Tricaine 1 x E3 embriyo medya (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7.2) anestezi.</li>
	<li>P1000 pipet ucu makas ya da jilet bir çift ile sonu kapalı 3 dpf larva en az stres ile karşılamak için 2 mm çapında yara bere.</li>
</ol>2. zebra balığı larva fin kırpma
<ol><li>Değiştirilmiş P1000 micropipette kullanarak bir imzalat larva kadar almak ve zebra balığı larva konumlandırılmış Otoklav Bandı üzerine Petri kabına kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak larva çevreleyen aşırı Tricaine çözüm kaldırın. Alan başarıyla bölüm ve fin kadar almanız mümkün ama hala hayatta kalmasını sağlamak için ıslak kuru olmalıdır.</li>
	<li>Mikro neşter, Bölüm mikroskop stereo Wilkinson ve ark16açıklandığı gibi Şekil 1' de gösterildiği gibi altında kaudal fin kullanarak. Belgili tanımlık kesme sırasında kaudal fin, kan dolaşımını (Şekil 1A) sınırlamak için distal pigment boşluğu sitenin içinde sürekli bir aşağı doğru basınç uygulayın. Notochord zarar görmesini önlemek için hafif basınç uygulayın.</li>
	<li>Mikroskop altında kesitli fin görselleştirmek ve üstünde tepe-in belgili tanımlık uç parçası microscalpel bıçak (Şekil 2A) konumlandırın. Filtre kağıdı küçük bir parça yüzeyinin fin içeren microscalpel yerleştirin. Not: transected doku melanosit varlığı nedeniyle, bu adımı fin görselleştirme bir küçük siyah nokta (Şekil 2B) olarak sağlar.</li>
	<li>Makas ve cımbız (Şekil 2C), transfer 50 mm NaOH çözüm iyi (Şekil 2B) başına 25 μL içeren bir 96-şey PCR plakasına fin içeren filtre kağıdı kullanarak.</li>
	<li>PCR plaka etiket göre iyi numaralandırma bir düz-alt 96-şey plaka hazırlayın. Taze 1 x E3 embriyo medya 200 µL ile dolu değiştirilmiş P1000 pipet kullanarak, dikkatle hafif basınç kullanarak zebra balığı larva toplamak. 96-iyi doku kültürü plaka aynı PCR plaka (Şekil 2E) iyi numara larva dağıtmak.</li>
	<li>Filtre kağıdı de çözüm (2F rakam) sular altında emin olun. Microscapel ve cımbız % 70 alkol çözüm daldırma tarafından çapraz kontaminasyonu önlemek için her kesim arasında bıçak temiz. Bıçak temiz kağıt doku/bezle silin.</li>
	<li>Tüm embriyoların kısaltıldı 2.1-2.7 tamamlayana dek.</li>
	<li>Genotip belirleyinceye kadar larva 96-şey plaka 28 ° C'de depolayın. Not: Embriyo medya iletişim kuralı kolayca az 2 gün içinde tamamlanabilir beri değiştirilmesi gerekmez. Daha fazla zamana ihtiyacım vardı, bir medya değiştir önerilir.</li>
</ol>3. genomik DNA ekstraksiyon
<ol><li>96-şey PCR plaka ve örnekleri için tüm filtre kağıtları emin olmak 1 dk 1000 x g de NaOH çözümünüzde batık santrifüj kapatın.</li>
	<li>Doku lizis için 95 ° c 5 min 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip için bir thermocycler örneklerinde ısı.</li>
	<li>500 mm Tris-HCl, her örnek için 8,0 pH 6 μL ekleyin. Girdap.</li>
	<li>Kısaca, oda sıcaklığında 5 min için 1.500 x g plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir DNA süpernatant PCR reaksiyon başına 1,5 μL kullanın.</li>
	<li>Genotip için PCR larvalar, Tablo 1-2' de gösterildiği gibi hazırlayın. Not: Bu protokol iki uygulamaları için test edildi: multiplex özel jelleri9ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa)17kullanarak genotip ortaya tahlil (HMA) erime heteroduplex kullanarak genotip ortaya PCR reaksiyonları.</li>
</ol>4. alternatif genomik ayıklama şelat bir reçine kullanarak
<ol><li>Filtre kağıdı ile bölünerek fin bir 96-şey PCR plakasına ekleyerek tam adım 2.5 reçine (eşli iminodiacetate iyonları içeren stiren-divinylbenzene kopolimer) şelat % 5'lik 30 μL içeren. Not: Bu tür reçine bir doku lizis ve PCR-hazır DNA bir hızlı ve verimli bir şekilde18' hazırlanması için yaygın olarak kullanılır.</li>
	<li>2.6-2.8 belirtildiği gibi adımları.</li>
	<li>96-şey PCR plaka mühür ve kısaca tüm filtre kağıdı içinde bağlayıcı reçine sular altında emin olmak için örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Doku lizis için bir thermocycler 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip 15dk için 95 ° C'de örneklerinde ısı. Not: Bu adımı DNA ve RNA çözümde kalırken lizis ve kutup reçine boncuk hücresel bileşenleri için sonraki bağlantısını sağlar.</li>
	<li>Kısaca reçine boncuk cips ve süspansiyon DNA'da edinmek için örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>3.5-3.6 Genotipleme yordamı tamamlamak için adımları izleyin.</li>
</ol>5. uygulama 1: Özel jel analiz tarafından takip Multiplex PCR
<ol><li>Tablo 1, takip homozigoz mutantlar, heterozygotes ve WT larva arasında ayrımcılık sağlamak için çok katmanlı bir PCR reaksiyonu ayarlayın. 96-iyi termal cycler Tablo 3' te açıklanan Bisiklet koşullarını kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanın. Not: PCR reaksiyonları da herhangi bir diğer geleneksel PCR termal cycler içinde gerçekleştirilir. Bu örnek Pena, et al. kullanılan PCR strateji açıklar aldh7a1 WT ve 5-bp ekleme mutant gen aynı multiplex tepki olarak tanımlamak için, 9 .</li>
	<li>% 1'özel jel 1 ile lekeli sodyum borat arabellekte hazırlamak x GelRed. Not: 76 g Borik asit ile 8.5 için ayarlanabilir ve sonra GKD2O. kullanarak 2 L son birim için tamamlandı pH 10 M NaOH, GKD2O, 1800 mL, 40 mL sodyum borat arabellek hisse senedi x 20 yapılan</li>
	<li>V 250 15dk için 1 x sodyum borat arabellekte jel çalıştırın. Sürecini kolaylaştırmak için mümkünse, örnekleri yükleme süresi azaltarak daha yüksek üretilen iş yetenekleri etkinleştirmek için çok kanallı pipets ile uyumlu bir jel sistemi kullanın.</li>
	<li>Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için ultraviyole (UV) ışık altında görüntü.</li>
</ol>6. uygulama 2: Tahlil erime Heteroduplex
<ol><li>SAYFA %12 jelleri 1.5 mm spacer plaka ve 15-örnekleri tarak kullanarak hazırlayın. İki sayfa jelleri 12.21 mL GKD2O, 10 x Tris/bor/EDTA (TBE), 10 mL % 30 akrilamid, 250 μL 2.52 mL % 10 amonyum Persülfat (APS) kullanarak hazırlamak ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. 1 x TBE arabellek kullanın (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M Borik asit ve 0.002 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) arabellek çalışan olarak.</li>
	<li>PCR ürünleri 5 min için 94 ° C'de ısı.</li>
	<li>Tüpler buz veya thermocycler 4 ° C'de 10 dakika serin</li>
	<li>PCR örnek başına 10 μL ve molekül ağırlığı işaretleyicinin 8 μL yük.</li>
	<li>150 V 1 x TBE molekül ağırlığı işaret kadar veya 1 h için neredeyse bir dikey elektroforez sistemi kullanarak ayak hattının cam levha ulaşır. sayfayı çalıştırın.</li>
	<li>Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için UV ışık altında görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Son mutasyonlar ve zebra balığı transgenes tam olarak tanıtmak istihdam düzenleme araçları Gene yıl5,6,7,8. Zebra balığı içinde modelleme hastalığı gerçekleştirirken, erken larva veya Juvenil fenotipleri9,12,13,14kez gözlenir. Burada sunulan Protokolü PCR-hazır DNA çe...

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın preklinik tedavi hipotezler1,2,3test gelince de hastalık soruşturma için bir model olarak kullanılan omurgalı bir organizma. Bu hayvanlar kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve DNA'ın mikroenjeksiyon embriyo4tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Teknolojik öyle aynı derecede çinko-parmak enzimler (ZFN)5, TAL benzeri efektör enzimler (TALENs)6,7ve kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa roman transgenik ve gen artan geliştirilmesi yoluyla düzenleme Palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili 9 (Cas9) sistem8, zebra balığı önemli ölçüde birkaç patolojik koşulları anlayış geliştirmek için hazırlanıyor. Hedeflenen renkleri çakıştırma hem de somatik oluşturmak için kullanılan bu teknolojiler ve verimli bir şekilde genetik olarak duyumsatan zebra balığı, hücrelerde germline hayvanlar8değiştirilebilir. Son literatürde epilepsi ve metabolik bozukluklar genetik modellerini başarılı gelişimi zebra balığı3,9,10,11',12 örnekler .
Zebra balığı genom düzenleme içinde ilerleme ile hızlı ve güvenilir Genotipleme yadsınamaz bir hızı sınırlaması adım haline gelmiştir. Belirli DNA mutasyonları öngörülen genom düzenleme hedef siteye bitişik tanımlaması Protokolü'nün önemli bir aşamadır. Geleneksel olarak, Genotipleme fin kırpma tarafından genellikle sadece içinde gerçekleştirilen çocuk ya da yetişkin zebra balığı tekniklerdir. Ancak, harcanan zaman yetişkinliğe yükselterek zebra balığı (> 2 ay) önemli ölçüde araştırma gelişmeler geciktirir. Birçok durumda, yetişkinlik gerekli genler (Örneğin, hastalık modelleme) veya zararlı fenotipik etkileri için önde gelen işlev kazanç mutasyonlar nakavt nedeniyle elde edilemez. Ayrıca, çeşitli deneyleri larva, RNA veya metaboliti ayıklama gibi havuzu gerektirir ve böylece sadece post hoc Genotipleme teknikleri kullanılabilir olduğunda hangi zor olabilir genotip, önceden tanımlanması dahil. Söz konusu bu örnekler aynı zamanda hassas ve tam kurtarma ve larvalar normal gelişimini olanaklı kılmak larva Genotipleme teknikleri önemini vurgulayın. Erken sahne zebra balığı Genotipleme Şu anda yaygın olarak kullanılan görünmüyor; Bu hastalık modelleri larva genotip Genotipleme çalıştırmadan önce deneme12,13,14yerine öldükten sonra Genotipleme üzerinden tespit edilir son yayınlar yansıtır. Bu yazıda, daha önce kurulan Genotipleme yordamlar geliştirmek amaçlayan bir larva fin küçük strateji sunulur.
Geçmişte, İndinavir K sindirim genotip için istihdam stratejileri larva değişken polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) verimlilik15' e açmıştır zebra balığı yaşamak. Daha son zamanlarda mikroskobik kuyruk biyopsi tekniği daha umut verici sonuçları16sağlanan yayınlanan rağmen biz ve diğer grupları yüksek verimlilik ve yazarlar tarafından bildirilen DNA kurtarma çoğaltmak mümkün değildi. Wilkinson ve ark. tarafından açıklanan Protokolü'nün büyük bir başarısızlık 16 kuyruk doku transferi PCR tüp için olabilir. Mikroskobik onun büyüklüğü nedeniyle, fin düzgün toplanan ve pipetting tarafından reçete emin olmak zordur. Bu bariyer adrese, Genotipleme canlı zebra balığı larvaları yaklaşık % 100 verim9ile çok sayıda için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bir microscalpel kullanarak, fin kuyruk ucu kaldırılır ve bir filtre kağıt parçası yerleştirilir. Filtre kağıt dokusu içeren kolayca görselleştirildiği ve doğru bir PCR tüp içine yerleştirilir. Genomik DNA ekstraksiyon ardından, genotip örnek ilgi bölgesinin PCR güçlendirme tarafından takip gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajları, yüksek bir PCR verim, düşük bir yanlış pozitif oranı ve düşük ölüm oranı içerir. Ayrıca, çok sayıda embriyo Genotipleme bu iletişim kuralını kullanan mümkündür. Burada açıklanan protokol fin-kırpma, larva bu yaklaşım ve genotyped balık ve kuyruk rejenerasyon iki gün içinde doğru kimlik kullanarak 2-3 saat içinde yüzlerce sağlar.

<table><tbody><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Mikroneşter</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Trikain / Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Doku kültürü plakası</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR plaka</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>%5 Chelex 100 sodyum formu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Alt Hücre Modeli 192 sistemi</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1704508 %30 Akrilamid/Bis Solüsyonu, 37.5: 1</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>kağıt mendil (Kimwipes ve reg; tek kullanımlık silecekler)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb artı moleküler ağırlık işaretleyici ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Alt Hücre Model 192 sistemi (yüksek verimli agaroz jel sistemi)</td> <td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>dikey jel elektroforez sistemi Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1658004</tr></tbody></table>

yüksek işlem hacmi dna ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva fin kırpma tarafından genotipleme

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebra balığı (Danio rerio) insan hastalıkları ile ilişkili olduğu bilinen genlerin % 84 için orthologues sahip. Buna ek olarak, bu hayvanlar bir kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve embriyo içinde DNA'ın mikroenjeksiyon tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Son gelişmeler düzenleme araçları gen mutasyonlar ve zebra balığı transgenes kesin giriş etkinleştirme. Hastalık içinde zebra balığı kez modelleme larva fenotipleri ve genotip bilinmeyen varsa yorumlamak zor olabilir erken ölüme yol açar. Bu erken genotip Ayrıca tanımlamasıdır örnek havuzu gerektiren deneylerde gerekli, gen ifade veya kütle spektrometresi çalışmaları gibi. Ancak, geniş genotypic tarama çoğu labs sadece yetişkin zebra balığı ya da öldükten sonra larva gerçekleştirilen geleneksel yöntemler ile sınırlıdır. Biz bu sorunu bir yöntem gibi erken 72 h sonrası döllenme (hpf) elde edilebilir canlı zebra balığı larva PCR-hazır genomik DNA izolasyonu için adapte tarafından ele. Bu zaman ve maliyet-etkin tekniği, daha önce yayımlanmış Genotipleme Protokolü geliştirilmiş sağlar genotip mikroskobik fin biyopsi üzerinden tanımlaması. Larvalar geliştirdikçe yüzgeçleri hızlı bir şekilde yeniden. Araştırmacılar daha sonra seçin ve istenen genotip yetişkinliğe bu yüksek-den geçerek PCR tabanlı Genotipleme yordamı kullanarak yetiştirmek edebiliyoruz.

Taht verimliliğini Genotipleme tarafından gösterilmiştir Heterozigoz bir çapraz dölü (aldh7a1+ / ot100, burada aldh7a1+/-gösterilen) ()Şekil 3A- C)9. Aldh7a1ot100mutant Gen 5-baz çifti (bp) ekleme ilk kodlama exon frameshift ve fonksiyon kaybı nedeniyle erken bir stop kodonu9yol açar zebra balığı aldh7a1 gen va...

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Bu yöntem, biyomedikal alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Genetik hastalık modelleri oluşturmak için zebra balığının kullanılması gibi. Bu tekniğin temel avantajı, basit bir yüksek verimli yöntem kullanılarak genotiplerin erken tanımlanmasına izin vermesidir.Bu yöntem, genetik epilepsilerin zebra balığı modellerini kullanarak kapsamlı araştırmalara olanak sağlasa da, diğer genetik hastalık modellerine ve her türlü mutasyon çalışmasına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, larva yüzgecinin transeksiyonunun kuyruğun pigment boşluğu içinde hassas bir şekilde yapılması gerektiğinden zorluklar yaşayabilir. Zebra balığı larvalarının yüzgeç kesimine başlamadan önce, diseksiyon yüzeyini hazırlayın.Dokuz santimetrelik bir Petri kabı kapağının iç yüzeyine bir parça otoklav bandı bantlayın ve kapağı stereo mikroskop altına yerleştirin. Pipet ucunun ucunu iki milimetre çapında keserek, üç dpf larvasını minimum stresle barındırmak için bir P1000 pipet ucu hazırlayın. Döllenmeden üç ila beş gün sonra veya dpf, zebra balığı larvalarını bir Petri kabına yerleştirin ve 1x E3 embriyo ortamında 1.5 milimolar trikamid içinde anestezi uygulayın.Modifiye edilmiş P1000 mikro pipeti kullanarak, zebra balığı larvalarını alın ve uyuşturun ve Petri kabı kapağındaki yerleştirilmiş Otoklav bandına yerleştirin. Larvaları çevreleyen fazla trikain çözeltisini çıkarın. Yüzgeci başarılı bir şekilde ayırmak ve almak için alan mümkün olduğunca kuru olmalı, ancak hayatta kalmayı sağlamak için yine de ıslak olmalıdır.Kanamayı önlemek ve yüzgeç kırpma sırasında larvaların hayatta kalmasını sağlamak için, transeksiyon pigment boşluğu içinde gerçekleşmelidir. Bu resimde gösterildiği gibi kan dolaşımının sınırına distal. Stereo mikroskop altında çalışarak, kuyruk yüzgecini bölmek için bir mikro neşter kullanın.Kesi sırasında, notokordun zarar görmesini önlemek için sabit ama hafif bir aşağı doğru basınç uygulayın. Kesitli yüzgeci mikroskop altında görselleştirin ve parçayı mikro neşter bıçağının ucunun üzerine yerleştirin. Yüzgeci içeren mikro neşteri küçük bir filtre kağıdının yüzeyine yerleştirin.Kesilen dokuda melanositlerin varlığı nedeniyle, yüzgeç küçük bir siyah nokta olarak görünür. Başarılı bir DNA ekstraksiyonu sağlamak için, protokole devam etmeden önce filtre kağıdında yüzgecin yerleşimini işaretleyen siyah bir noktanın gözlemlenmesi önemlidir. Makas ve cımbız kullanarak, yüzgeci içeren filtre kağıdını, 25 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi içeren 96 oyuklu bir PCR plakasının kuyusuna aktarın.Daha sonra, kuyucukları PCR plakasının etiketine göre numaralandırarak düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın. 200 mikrolitre taze e3 embriyo ortamı ile doldurulmuş modifiye edilmiş P1000 pipetini kullanarak, zebra balığı larvalarını hafif bir basınç kullanarak dikkatlice toplayın. Larvaları 96 oyuklu plakaya PCR plakası ile aynı kuyu numarasında dağıtın.Kanatçığı içeren filtre kağıdının çözeltiye iyice batırıldığından emin olun. Her kesim arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için, mikro neşterin bıçağını ve cımbızı %70 etanol çözeltisine batırarak temizleyin. Bıçağı temiz bir kağıt mendille silin veya silin.Tüm larvalar kırpıldığında, larvaları genotipleri tanımlanana kadar 96 oyuklu plakada 28 santigrat derecede saklayın. Bu prosedüre, kanat parçalarını içeren 96 oyuklu PCR plakasını kapatarak ve numuneleri bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyerek başlayın. Tüm filtre kağıtlarının sodyum hidroksit çözeltisine batırıldığından emin olmak için.Doku lizisi için, numuneleri bir termal döngüleyicide 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Ardından 10 dakika boyunca dört santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra, her numuneye altı mikrolitre 500 milimolar tris-HCL pH8.0 ekleyin.Örnekleri girdaplayın. Plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1500 kez G'de kısaca santrifüjleyin. Bu yöntemi kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için, yüzgeci daha önce gösterildiği gibi kırpın, ancak kırpılmış yüzgeçli filtre kağıdını, 30 mikrolitre %5 şelatlama reçinesi içeren 96 oyuklu bir PCR plakasının bir kuyusuna ekleyin.Tüm kanat parçaları kırpıldıktan sonra, 96 oyuklu PCR plakasını kapatın ve tüm filtre kağıtlarının şelatlama reçinesi ile daldırıldığından emin olmak için numuneleri kısaca santrifüjleyin. Numuneleri bir termal döngüleyicide 95 santigrat derecede 15 dakika ısıtın, ardından 10 dakika boyunca dört santigrat dereceye kadar soğutun. Reçine boncuklarını peletlemek için numuneleri kısaca santrifüjleyin ve süspansiyondaki DNA'yı elde edin.Multipleks bir PCR testi, homozigot mutantlar, heterozigotlar ve vahşi tip larvalar arasında ayrım yapılmasını sağlayacaktır. PCR reaksiyonunu metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. PCR reaksiyonlarını 96 oyuklu termal döngüleyicide gerçekleştirin.Sodyum borat tamponunda 1x jel kırmızısı ile boyanmış %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın. Prosesi kolaylaştırmak için mümkünse, numunelerin yüklenme süresini kısaltarak daha yüksek verim özellikleri sağlamak için çok kanallı pipetlerle uyumlu bir jel sistemi kullanın. Jeli 1x sodyum borat tamponunda 250 voltta 15 dakika çalıştırın.Farklı genotiplerin ayırt edilmesine izin vermek için jeli ultraviyole ışık altında görüntüleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi 1,5 milimetre ara plaka ve 15 numune tarağı kullanarak iki adet %12'lik poliakrilamid jel hazırlayarak bu tahlili başlatın. Çalışan tampon olarak dikey bir elektroforez sistemi ve 1x TBE tamponu kullanın.Metin protokolünde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirdikten sonra, PCR ürünlerini beş dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın, ardından 10 dakika boyunca dört santigrat derecede soğutun. PCR numunesi başına 10 mikrolitre ve sekiz mikrolitre moleküler ağırlık işaretleyici yükleyin. Jeli bir saat boyunca 150 voltta veya moleküler ağırlık işaretleyicisi neredeyse cam plakanın ayak çizgisine ulaşana kadar çalıştırın.Farklı genotiplerin ayırt edilmesine izin vermek için jeli ultraviyole ışık altında görüntüleyin. Bu protokol, mutant ilealin aldh7a1 geninin ilk kaplama ekzonunda 5 baz çifti eklemesine sahip olduğu heterozigot bir çaprazlamanın yavrularının genotiplemesi için kullanıldı. Hem vahşi tip hem de mutant ileallerin PCR amplifikasyonundan beklenen sonuç 434 BP amplikondur.Mutant ilealin amplifikasyonundan 293 BP'lik bir bant ortaya çıkar ve vahşi tip ileal için 195 BP'lik bir bant elde edilir. %1'lik bir agaroz sodyum borat jeli üzerindeki PCR reaksiyonlarının analizi, ikinci ve altıncı şeritlerde vahşi tip genotipleri, üç, dört ve beşinci şeritlerde heterozigot genotipleri ve birinci şeritte bir homozigot mutant genotipi tanımladı. Heterodubleks erime tahlili ile genotiplendirilen çeşitli mutasyonlar.Plpbp geninin plpbpot101 ve plpbpot102 mutant ileallerinin her biri bir çerçeve kaymasına ve erken durdurma kodonuna izin verir. Denatürasyon ve tavlamadan sonra, heterozigot hayvanlar için PCR fragmanları, poliakrilamid jel elektroforları kullanılarak kolayca ayrılan ve görselleştirilen heterodubleks ve homodubleks DNA içerecektir. Bileşik heterozigot mutant genotipler iki, dört ve sekizinci şeritlerde, heterozigot genotipler üç, altı, yedi, dokuz ve onuncu şeritlerde ve vahşi tip genotipler beşinci şeritte tanımlanmıştır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniği kullanarak 96 larvanın yüzgeç kırpılması, uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben, doku ekstraksiyonu için aynı genotipe sahip zebra balığı larvalarının bir araya getirilmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir ve biyobelirteç araştırması ve hastalık modelleri gibi ek soruları yanıtlamak için sipariş edilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, zebra balıklarında hastalık yolu fizyolojisini keşfetmek için metabolik epilepsi modelleri alanında araştırmaların yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, bir kuyruk yüzgecinin mikrodiseksiyonu ile üç günlük zebra balığı larvalarının nasıl düzgün bir şekilde genotipleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Burada, tasarım ve yüksek işlem hacmi zebra balığı embriyo bir 96-şey plaka diziliyor için böyle şablon kullanımı ayrıntılı yordam tarafından ardından arraying bir zebra balığı embriyo imal için bir protokol mevcut.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Bu çalışma, zebrafish larvalarında yüz yapısındaki değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım (tpsDigs2, MorphoJ ve PAST) kullanılarak kraniofasiyal kıkırdak şeklinin nicelendirilmesine yönelik bir protokolü tanımlar.

Şekil Morfometrik Analizleri: Zebrafish'te Kraniofasiyal Şekil Nicelesi için Analiz Yazılımı Araç Kutusu

Öğrenin, 3dpf zebra balığı larvalarında kuyruk kırpma yöntemiyle yüksek işlem hacimli genotipleme tekniğini. Bu yöntem genetik hastalık modellerinde erken genotip belirlemeyi kolaylaştırır.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Daha fazla video keşfet