Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Bu yöntem, neokorteksin yapısının ve işlevinin analizi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, beyindeki büyük ölçekli üç boyutlu yapıyı ortaya çıkarabilmesidir. Bu yöntem neokorteks hakkında bilgi sağlayabilse de, omurilik gibi diğer sinir sistemlerine de uygulanabilir.

İzleyiciyi yetişkin farelerin ponsuna enjekte etmek için, önce 26 gauge Hamilton şırıngaya bir mikrolitre floresan etiketli Kolera toksin alt birimi B çekin. Şırınganın üzerine bir enjektör pompası yerleştirin, ardından şırıngayı ve pompayı stereotaksik bir alet üzerindeki bir manipülatörün alet tutucusuna yerleştirin. Manipülatörü dikey eksenden 12 derece arkaya doğru eğin.

Daha sonra, fareyi stereotaksik aletin üzerine yerleştirin. Enfeksiyonu önlemek için bir tıraş bıçağı kullanarak tüylerini alın. Daha sonra kafa derisinin 10 milimetresini kesin, böylece bregma ve lambda görünür hale gelir.

Bir pipet kullanarak 0.1 mililitre% 1 lidokain uygulayın. Ağızlığın stereotaksik alet üzerindeki dikey konumunu, bregma ve lambda aynı Z seviyesine sahip olacak şekilde ayarlayarak başın açısını ayarlayın. Daha sonra, manipülatörün konumunu, şırınganın ucu bregmaya yakın olacak şekilde stereotaksik aletin üzerine kaydırarak ayarlayın.

Manipülatörün konumunu kaydedin. Alet tutucuyu manipülatör üzerinde hareket ettirerek şırıngayı geri çekin. Daha sonra manipülatörü 5,4 milimetre arkaya ve 0,4 milimetre yanal olarak hareket ettirin.

Şırıngayı, ucu kafatasındaki giriş noktasına yakın olacak şekilde ilerletin, ardından şırıngayı geri çekin ve giriş noktasını işaretleyin. İşaretli konumda, yaklaşık bir milimetre çapında bir delik açın. Şırınga ucunu, uç derinliği bregmada ölçülenden 6,9 milimetre daha fazla olacak şekilde delikten geçirin.

Ardından, dakikada 0,2 mikrolitre pompayı kullanarak bir mikrolitre izleyici enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, şırıngayı beyinden çıkarın. Gerekirse, açıkta kalan beyni küçük mikrofibriller hemostat parçaları ve anında yapıştırıcı ile örtün.

Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisini dikmek için açıkta kalan beyni tuzlu suyla silin. Ardından, fareyi stereotaksik aletten çıkarın. Farenin yaklaşık bir saat boyunca 30 santigrat derecede bir inkübatörde anesteziden kurtulmasına izin verin.

Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra fareyi diğer hayvanların şirketine geri koyun. Beyin dokusunu toplamak için, kafatasını ortaya çıkarmak için bir makas kullanarak kafa derisini kesin.

Ardından, bir makas kullanarak açıkta kalan kafatasının orta hattını kesin. Ardından, forseps kullanarak kafatasını çıkarın. Bregma ve lambdanın konumunu işaretlemek gerekirse, önce kafatasının bir tarafını çıkarın.

Daha sonra beyne bregma ve lambda pozisyonlarında ince tungsten iğneleri sokun, ardından kalan kafatasını çıkarın. Ardından, beyin örneğini vibratom platformuna yerleştirin. Oda sıcaklığında PBS'de 500 mikrometre kalınlığa kadar olan bölümleri kesin.

Bu prosedürde, dilimleri dört mililitre Scale S0 çözeltisi içeren beş mililitrelik bir plastik tüpe aktarın. Daha sonra 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin. 12 saat sonra, bir pipet kullanarak çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek A2 çözeltisi ekleyin.

Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 36 saat inkübe edin. 36 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek B4 çözeltisi ekleyin. Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 24 saat inkübe edin.

24 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek A2 çözeltisi ekleyin. Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin. 12 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre PBS ekleyin.

Dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak altı saat inkübe edin. Daha sonra, dilimleri dikkatlice iki mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın. Hafifçe çalkalayarak 37 santigrat derecede 48 ila 72 saat boyunca bir mililitre AB Scale çözeltisinde bir birincil antikor ile inkübe edin.

Daha sonra, dilimleri dikkatlice beş mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın. Onları dört mililitre AB Scale solüsyonunda iki saat boyunca oda sıcaklığında iki kez hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra, dilimleri dikkatlice iki mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın.

Hafifçe çalkalama ile 37 santigrat derecede 48 saat boyunca bir mililitre AB Scale çözeltisinde floresan etiketli bir ikincil antikor ile inkübe edin. Dilimleri, dört mililitre antikor Ölçeği çözeltisi içeren beş mililitrelik bir plastik tüpe dikkatlice çıkarın ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak altı saat inkübe edin. Çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre AB Scale çözeltisi ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak iki kez iki saat inkübe edin.

Daha sonra, çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre% 4 PFA ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak bir saat inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre PBS ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak bir saat inkübe edin. Solüsyonu çıkarın ve dört mililitre Scale S4 solüsyonu ekleyin ve dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin.

Ardından, ara parçayı bir cam slayt üzerine yerleştirin ve dilimleri ara parçaya yerleştirin ve dilimleri Ölçek S4 çözeltisine daldırın. Ara parçayı bir kapak camı ile kapatın. Kapak camına biraz su koyun ve suya daldırmalı uzun çalışma mesafeli objektif ile konfokal veya iki foton mikroskobu kullanarak dilimleri görüntüleyin.

Bu çalışmada, Tlx3-cre AI9 transgenik farelerde kortikal projeksiyon nöronları tdTomato ekspresyonu ile yeşil renkte etiketlendi ve macentadaki sub serebral projeksiyon nöronları, retrograd izleyici CTB488'in yedi haftalıkken ponsa enjekte edilmesiyle görüntülendi. Bu, kortikal alanların yaklaşık konumlarını göstermek için en üstteki görünümdür. İşte sub serebral projeksiyon nöronlarını gösteren CTB488 floresansının ve kortikal projeksiyon nöronlarını gösteren tdTomato floresansının eğik görünümleri ve bu birleştirilmiş görüntüdür.

İki hücre tipinin hücre gövdeleri, çok çeşitli beyin bölgelerinde görülebiliyordu ve optik kesitler periyodik mikro sütunlar gösteriyordu. Bu görüntü, bir Crym-eGFP faresinin optik bölümünde eGFP eksprese eden alt serebral projeksiyon nöronlarının hücre gövdelerini ve apikal dendritlerini göstermektedir ve bu görüntü, antikor Ölçeği yöntemi ile bir C57 Black 6 faresinin ponsuna CTB488 enjekte edilerek yeşil ve macenta ile etiketlenmiş alt serebral projeksiyon nöronlarında parvalbümin eksprese eden hücreleri göstermektedir. Bu prosedürü takiben, serebral organizasyonun kantitatif karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için 3D görüntü işleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, kortikal biyoloji alanındaki araştırmacıların fare beynindeki yeni modüler organizasyonu keşfetmelerinin yolunu açtı.