Name: Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Keşfedin fare neokorteksindeki hücresel örgütü büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik sinirbilim araştırmalarında yapı ve fonksiyon analizi için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Atsushi Miyawaki ve Hiroshi Hama AbScale deneyler, Charles Yokoyama yazması, düzenleme için onların tavsiye için Eriko Ohshima ve Miyuki Kishino onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Japonya'nın bilimsel araştırma için T.H. RIKEN araştırma fonlarından T.H. ve Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (yenilikçi alanları "Mezoskopik Neurocircuitry"; 22115004) ve S.S. (25890023).

Tüm deneysel yordamlar RIKEN Wako hayvan deneyleri Komitesi ve RIKEN genetik rekombinant deneyi Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan imkanları RIKEN beyin bilim kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen Enstitüsü.
1. hazırlık Chambers'ı görüntüleme
<ol><li>
Odası19 görüntüleme
	<ol>
<li>Silikon kauçuk sayfalarını kullanarak, bir oda çeşitli kalınlıklarda yaklaşık 5 mm ve zemin plakaları kalınlığı ile hazırlayın. Ayrıca, Petri yemekler ve cam alt (Şekil 1A) olmadan hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dilim rondela
	<ol>
<li>Silikon kauçuk yaprak kalınlığı 0,5 mm (Şekil 1 c) kullanarak örnekleri, tutmak için boşluk ekleyiciler hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izleme enjeksiyon
Not: enjeksiyonları pons (2.1) veya üstün olacaklar (2.2) içine alın. Görsel bölgede üstün olacaklar etiketleri alt beyin projeksiyon sinirlerde içine enjeksiyon sırasında görsel ve motor alanlar da dahil olmak üzere geniş beyin bölgesi pons etiket alt beyin projeksiyon nöronlarda içine enjeksiyon. Kontrol deneyleri için fluorescently etiketli Kolera toksini alt birim B. yerine serum enjekte Steril koşul bakım için steril ekipmanları ve etanol ile temizlenmiş plastik eldiven kullanın.
<ol><li>
Yetişkin fareler pons içine enjeksiyonu yapmak.
	<ol>
<li>Bir fluorescently etiketli Kolera toksini alt birimi B 1 µL çizmek (25 µg/µL PBS içinde) 26 G Hamilton şırınga içine.</li>
		<li>Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.</li>
		<li>Şırınga ve pompa stereotaksik araç üzerinde yerleştirilen bir manipülatör araç sahibinin yerleştirin. Manipülatör 12 ° dikey eksenden özafagusu eğ.</li>
		<li>İntraperitoneally sodyum Fentobarbital enjekte edilerek bir erkek veya kadın yetişkin (C57BL/6J veya fare Tlx3-cre/Ai9) anestezi (60 mg/kg vücut ağırlığı) veya isoflurane (2-%3) yönetmek. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.</li>
		<li>Stereotaksik araç üzerinde fareyi getirin.</li>
		<li>Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi, 10 mm bregma ve lambda görünecek şekilde kesilmiş bir jilet kullanarak saç dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir pipet kullanarak %1 lidokain 0.1 mL yönetmek. Böylece bregma ve lambda aynı z düzeyde sahip stereotaksik cihazda ağızlık dikey konumunu ayarlayarak baş açısını ayarlamak.</li>
		<li>Manipülatör konumunu kaydetmek ve şırınga ucu bregma yakın olması stereotaksik araç üzerinde kaydırarak manipülatör konumunu ayarlayın. Şırınga manipülatör üzerinde araç tutucu taşıyarak geri çek.</li>
		<li>Manipülatör hareket 5.4 mm özafagusu ve 0.4 mm yanal. Böylece kafatası üzerinde giriş noktası ucu yakındır şırınga ilerlemek. Şırıngayı geri çekmek ve giriş noktası işareti.</li>
		<li>İşaretli konumda yaklaşık 1 mm çapında bir delik.</li>
		<li>Bu bregma ölçülen daha fazla ipucu derinlik 6.9 mm böylece şırınga ucu delikten yerleştirin.</li>
		<li>0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 1 µL enjekte.</li>
		<li>Şırınga beyinden kaldırın.</li>
		<li>Gerekirse, maruz kalan beyin microfibrillar hemostat ve anlık yapışkan küçük parçaları ile kapak.</li>
		<li>Bir pipet ile teslim salin enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi dikiş kullanarak maruz beyin durulayın.</li>
		<li>Fare stereotaksik araç kaldırın. Fareyi anestezi genellikle için 1 h 30 ˚C adlı bir kuluçka kurtarmak izin verir. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Tam olarak kurtarıldı sonra fare diğer hayvanlar şirkete geri dönün.</li>
		<li>Fare 3-7 gün boyunca korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yetişkin fareler üstün olacaklar içine enjeksiyonu yapmak.
	<ol>
<li>Cam Pipet ucu çapı 30 – 50 µm ile hazırlayın.</li>
		<li>Cam Pipet Hamilton şırınga plastik tüp (Şekil 2A) aracılığıyla bağlayın.</li>
		<li>Cam Pipet, plastik tüp ve Hamilton şırınga parafin sıvı ile doldurun.</li>
		<li>Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.</li>
		<li>Cam Pipet manipülatör yerleştirin ve manipülatör özafagusu dikey eksen (Şekil 2B) üzerinden 60 ° tilt.</li>
		<li>2.1.4–2.1.9 gerçekleştirin. Manipülatör 1.4 mm arka, 0,5 mm lateral lambda için konumdur.</li>
		<li>Kafatasında bir küçük plastik parafin film yeri, sonra yaklaşık 1 µL izleyici çözüm üzerine koydum. Hızlı bir şekilde Cam Pipet ilerlemek ve izleyici çözüm en az 0,5 µL ile doldurun.</li>
		<li>İpucu derinliğidir beyin yüzeyinden 3.0 mm Cam Pipet ekleyin.</li>
		<li>0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 0.5 µL enjekte.</li>
		<li>Cam Pipet beyinden kaldırın.</li>
		<li>2.1.13–2.1.16 gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fiksasyon ve düzeltme
<ol><li>Sodyum Fentobarbital (60 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneally (C57BL/6J veya Tlx3-cre/Ai9, ya da 2. adımda açıklandığı şekilde tracer enjeksiyon olmasın. bir fare içine enjekte. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.</li>
	<li>Fare fare transcardially%20 0,9 serum fizyolojik ile ventriküler tarafından insanca ötenazi.</li>
	<li>Ventriküler tarafından20 fare saptamak 0.1 M fosfat tampon (pH 7.5) % 4 paraformaldehyde (PFA).</li>
	<li>
Kafatası açıklanan20olarak ortaya çıkarmak için makas kullanarak kafa derisi kesilmiş.
	<ol>
<li>Makas kullanarak maruz kafatasının orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak kafatasını.</li>
		<li>Bregma ve lambda konumunu işaretleme gerekli ise, önce bir yarımküre kafatası kaldırın. Beyin bregma ve beyin üzerinde kalan kafatasındaki lambda pozisyonlarda ince tungsten iğne takın, sonra kalan kafatası kaldırın. Not: Beyin 4 ˚C PBS içinde depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İnhibitör nöronlar antikor boyama gerçekleştirmek için beyin örnekleri dilimler halinde kesin.
	<ol>
<li>Beyin örnek bir vibratome yerleştirin.</li>
		<li>En fazla 500 µm oda sıcaklığında PBS içinde kalın dilimler kesin ve adım 5 (AbScale yöntemi)'e devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikor boyama gereksizdir, trim beyin örnek (ilâ 3 mm kalınlığında) engeller bir tıraş bıçağı (Şekil 3) kullanarak ve adım 4 (SeeDB yöntemi)'e devam edin. Not: Beyin PBS içinde 4 ° C'de kesme veya düzeltme sonra saklanır. AbScale yöntemi daha az zaman gerektirir çünkü antikor boyama gerekmediğinde SeeDB yöntemi tercih edilir.</li>
</ol>4. takas antikor boyama (SeeDB yöntemi)
<ol><li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve % 40 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %60 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %100 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80.2 (w/w) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 24 h için kuluçkaya. Not: örnek dikkatle deformasyonlar olabildiğince küçük tutmak için baş. Örnekleri hızla opak olabilirsiniz gibi örnekleri belirtilenden daha uzun kuluçkaya değil.</li>
	<li>Örnek %80.2 fruktoz çözüm (Şekil 1B) ile dolu bir görüntüleme odası katıştırın. Gerekirse, örnek kauçuk yapıştırıcı küçük parçalar koyarak düzeltmek. Odası örnekleri yerleştirmeden önce odasında bir yere plaka koymak çok derin değilse.</li>
	<li>Görüntüleme odası cam kapaklı Petri kabına yerleştirin ve çanak ve görüntü confocal veya iki fotonlu mikroskobu uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile kullanarak su koyun. Uyarma dalga boylarında ve emisyon filtreler Tablo 1' de açıklanmıştır. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.</li>
</ol>5. (AbScale yöntemi) boyama antikor ile takas
<ol><li>Reaktifler Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Bir spatula 4 mL ani kalp durması/eS0 çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri aktarın ve onlara nazik 37 ° C'de (Şekil 4B) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 36 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eB4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 24 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>1 ml AbScale çözüm 48-72 h 37 ° C'de nazik sallayarak ile (Şekil 4 c) için birincil antikorlar (Tablo 3) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak bir 5 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>AbScale çözüm için 2 h 2 kez oda sıcaklığında hafif sallayarak ile 4 ml kuluçkaya.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Fluorescently etiketli ikincil antikorlar (Tablo malzemeler, 1: 100) AbScale çözüm 37 ° C'de nazik sallayarak ile 48 saat için 1 ml ile kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir spatula 4 mL AbScale çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri kaldırmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve 4 mL AbScale çözeltisi ekleyin ve 2 kez nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 2 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırın ve 4 mL % 4'lük ekleyin PFA ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eS4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya</li>
	<li>Bir cam slayt üzerinde spacer yer ve dilimleri içinde spacer yer ve ani kalp durması/eS4 çözüm dilimlerle batırmayın. Rondela (Şekil 1 d) bir cam ile kapatın.</li>
	<li>Su cam ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal veya iki fotonlu mikroskobu kullanarak resim koymak. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın. Not: örnek derin bölgelerinde önemli bir etiketleme önyargı yokluğu onaylamak için yüzeysel bölümlerine benzer şekilde etiketli olup olmadığını kontrol edin. Not: Penetrasyon test antikorların Tablo 3' te tanımlanmıştır.</li>
</ol>6. hücre konumu belirleme
<ol><li>Taranan görüntülerde her bir pozisyon için bir üç boyutlu görüntü filtresi14 (Şekil 5A-5D) kullanarak korelasyon değerleri hesaplar.</li>
	<li>Correlation değeri (Şekil 5 d) doruklarına konumları belirler.</li>
	<li>Görüntüleri hücreleri (Şekil 5E) bulmak için zirveleri etrafına araştırmak.</li>
</ol>

<ol><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462(2015).</li>
<li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+Challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+column%3A+a+structure+without+a+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li>
<li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+cortical+column+would+that+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose cortical column would that be?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li>
<li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li>
<li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kim, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortical cep kapsamlı analiz izin verebilirsiniz org...

Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo 1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.
Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu10temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks10innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri11.
Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar14 hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar14hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi14 örgü ve fare beyin12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni13alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.14. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.
Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks14konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.
Son zamanlarda, teknikleri kalın doku15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler12ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3-cre/Ai9 fareler17tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi18 antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi19 diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 514doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgenik fareler</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgenik fareler</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdDomates fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX # 7909</td><td></td></tr><tr><td>Silikon kauçuk levha</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0,5 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Silikon kauçuk levha</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Silikon kauçuk levha</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 555 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksin alt birimi B (rekombinant), Alexa Fluor 647 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Enjektör pompası</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons enjeksiyon</td></tr><tr><td>Enjektör pompası</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Üstün colliculus enjeksiyon</td></tr><tr><td>Manipülatörü</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentil</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidokain</td><td>AstraZeneca</td><td>Ksilokain enjeksiyonu epinefrin</td><td></td>ile %1</tr><tr><td>Matkap</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Aviten mikrofibriller kanama durdurucu</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi ipek</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hibridizatör</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot çektirmesi</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Parafin Sıvı, hafif</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Salin</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten iğne</td><td>Inter medical</td> <td>& Phi; 0.1 * L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tiyogalirol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fruktoz</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>İki fotonlu mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleri</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleri</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu sahne</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Semrock</td><td>FF03-525 / 50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Semrock</td><td>FF03-575 / 25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-629 / 56</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Chroma</td><td>D605 / 55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastik tüp</td><td>BIR</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastik tüp</td><td>Eppendorf ve nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>Üre</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D (-) - sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&beta;-siklodekstrin</td><td>Tokyo kimya endüstrisi</td><td>M1356</td><td></td></tr> <tr><td>ve gama; - Siklodekstrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-L-hidroksiprolin</td><td>Cilt Temel Aktifleri</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20 (1.1 g / mL)</td> <td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Suya daldırma uzun çalışma mesafesi hedefleri</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sınır Enstitüsü</td><td>PV-Go-AF460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Yarımadası Laboratuvarları</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.

Kortikal projeksiyon nöronlar tdTomato Tlx3-creiçinde ifade tarafından /Ai9 transgenik fareler etiketli ve retrograd izleyici CTB488 pons enjekte edilerek alt beyin projeksiyon nöronlar görüntülenir. Beynin sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile donatılmış iki fotonlu mikroskop kullanarak inceden inceye gözden geçirmek (25 X, N.A. 1.1, çalışma mesafesi 2 mm) ve motorlu bir sahne. 401 görüntü yığınını (512 x 512 pikse...

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Bu yöntem, neokorteksin yapısının ve işlevinin analizi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, beyindeki büyük ölçekli üç boyutlu yapıyı ortaya çıkarabilmesidir. Bu yöntem neokorteks hakkında bilgi sağlayabilse de, omurilik gibi diğer sinir sistemlerine de uygulanabilir.İzleyiciyi yetişkin farelerin ponsuna enjekte etmek için, önce 26 gauge Hamilton şırıngaya bir mikrolitre floresan etiketli Kolera toksin alt birimi B çekin. Şırınganın üzerine bir enjektör pompası yerleştirin, ardından şırıngayı ve pompayı stereotaksik bir alet üzerindeki bir manipülatörün alet tutucusuna yerleştirin. Manipülatörü dikey eksenden 12 derece arkaya doğru eğin.Daha sonra, fareyi stereotaksik aletin üzerine yerleştirin. Enfeksiyonu önlemek için bir tıraş bıçağı kullanarak tüylerini alın. Daha sonra kafa derisinin 10 milimetresini kesin, böylece bregma ve lambda görünür hale gelir.Bir pipet kullanarak 0.1 mililitre% 1 lidokain uygulayın. Ağızlığın stereotaksik alet üzerindeki dikey konumunu, bregma ve lambda aynı Z seviyesine sahip olacak şekilde ayarlayarak başın açısını ayarlayın. Daha sonra, manipülatörün konumunu, şırınganın ucu bregmaya yakın olacak şekilde stereotaksik aletin üzerine kaydırarak ayarlayın.Manipülatörün konumunu kaydedin. Alet tutucuyu manipülatör üzerinde hareket ettirerek şırıngayı geri çekin. Daha sonra manipülatörü 5,4 milimetre arkaya ve 0,4 milimetre yanal olarak hareket ettirin.Şırıngayı, ucu kafatasındaki giriş noktasına yakın olacak şekilde ilerletin, ardından şırıngayı geri çekin ve giriş noktasını işaretleyin. İşaretli konumda, yaklaşık bir milimetre çapında bir delik açın. Şırınga ucunu, uç derinliği bregmada ölçülenden 6,9 milimetre daha fazla olacak şekilde delikten geçirin.Ardından, dakikada 0,2 mikrolitre pompayı kullanarak bir mikrolitre izleyici enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, şırıngayı beyinden çıkarın. Gerekirse, açıkta kalan beyni küçük mikrofibriller hemostat parçaları ve anında yapıştırıcı ile örtün.Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisini dikmek için açıkta kalan beyni tuzlu suyla silin. Ardından, fareyi stereotaksik aletten çıkarın. Farenin yaklaşık bir saat boyunca 30 santigrat derecede bir inkübatörde anesteziden kurtulmasına izin verin.Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra fareyi diğer hayvanların şirketine geri koyun. Beyin dokusunu toplamak için, kafatasını ortaya çıkarmak için bir makas kullanarak kafa derisini kesin.Ardından, bir makas kullanarak açıkta kalan kafatasının orta hattını kesin. Ardından, forseps kullanarak kafatasını çıkarın. Bregma ve lambdanın konumunu işaretlemek gerekirse, önce kafatasının bir tarafını çıkarın.Daha sonra beyne bregma ve lambda pozisyonlarında ince tungsten iğneleri sokun, ardından kalan kafatasını çıkarın. Ardından, beyin örneğini vibratom platformuna yerleştirin. Oda sıcaklığında PBS'de 500 mikrometre kalınlığa kadar olan bölümleri kesin.Bu prosedürde, dilimleri dört mililitre Scale S0 çözeltisi içeren beş mililitrelik bir plastik tüpe aktarın. Daha sonra 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin. 12 saat sonra, bir pipet kullanarak çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek A2 çözeltisi ekleyin.Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 36 saat inkübe edin. 36 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek B4 çözeltisi ekleyin. Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 24 saat inkübe edin.24 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre Ölçek A2 çözeltisi ekleyin. Dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin. 12 saat sonra, çözeltiyi tüpten çıkarın ve dört mililitre PBS ekleyin.Dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak altı saat inkübe edin. Daha sonra, dilimleri dikkatlice iki mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın. Hafifçe çalkalayarak 37 santigrat derecede 48 ila 72 saat boyunca bir mililitre AB Scale çözeltisinde bir birincil antikor ile inkübe edin.Daha sonra, dilimleri dikkatlice beş mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın. Onları dört mililitre AB Scale solüsyonunda iki saat boyunca oda sıcaklığında iki kez hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra, dilimleri dikkatlice iki mililitrelik plastik bir tüpe çıkarın.Hafifçe çalkalama ile 37 santigrat derecede 48 saat boyunca bir mililitre AB Scale çözeltisinde floresan etiketli bir ikincil antikor ile inkübe edin. Dilimleri, dört mililitre antikor Ölçeği çözeltisi içeren beş mililitrelik bir plastik tüpe dikkatlice çıkarın ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak altı saat inkübe edin. Çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre AB Scale çözeltisi ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak iki kez iki saat inkübe edin.Daha sonra, çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre% 4 PFA ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak bir saat inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve dört mililitre PBS ekleyin ve dilimleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak bir saat inkübe edin. Solüsyonu çıkarın ve dört mililitre Scale S4 solüsyonu ekleyin ve dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe çalkalayarak 12 saat inkübe edin.Ardından, ara parçayı bir cam slayt üzerine yerleştirin ve dilimleri ara parçaya yerleştirin ve dilimleri Ölçek S4 çözeltisine daldırın. Ara parçayı bir kapak camı ile kapatın. Kapak camına biraz su koyun ve suya daldırmalı uzun çalışma mesafeli objektif ile konfokal veya iki foton mikroskobu kullanarak dilimleri görüntüleyin.Bu çalışmada, Tlx3-cre AI9 transgenik farelerde kortikal projeksiyon nöronları tdTomato ekspresyonu ile yeşil renkte etiketlendi ve macentadaki sub serebral projeksiyon nöronları, retrograd izleyici CTB488'in yedi haftalıkken ponsa enjekte edilmesiyle görüntülendi. Bu, kortikal alanların yaklaşık konumlarını göstermek için en üstteki görünümdür. İşte sub serebral projeksiyon nöronlarını gösteren CTB488 floresansının ve kortikal projeksiyon nöronlarını gösteren tdTomato floresansının eğik görünümleri ve bu birleştirilmiş görüntüdür.İki hücre tipinin hücre gövdeleri, çok çeşitli beyin bölgelerinde görülebiliyordu ve optik kesitler periyodik mikro sütunlar gösteriyordu. Bu görüntü, bir Crym-eGFP faresinin optik bölümünde eGFP eksprese eden alt serebral projeksiyon nöronlarının hücre gövdelerini ve apikal dendritlerini göstermektedir ve bu görüntü, antikor Ölçeği yöntemi ile bir C57 Black 6 faresinin ponsuna CTB488 enjekte edilerek yeşil ve macenta ile etiketlenmiş alt serebral projeksiyon nöronlarında parvalbümin eksprese eden hücreleri göstermektedir. Bu prosedürü takiben, serebral organizasyonun kantitatif karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için 3D görüntü işleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Geliştirildikten sonra, bu teknik, kortikal biyoloji alanındaki araştırmacıların fare beynindeki yeni modüler organizasyonu keşfetmelerinin yolunu açtı.

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir...

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Bu çalışma, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve ex vivo örneklerde bir kontrast maddeyi birleştirerek yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme adımlarını açıklamaktadır. Bu görüntülerde beyin boyutunu ve şeklini ölçmek için temel morfometrik analizleri açıklıyoruz.

Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Keşfedin fare neokorteksindeki hücresel örgütü büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik sinirbilim araştırmalarında yapı ve fonksiyon analizi için güçlü bir çerçeve sunar.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Daha fazla video keşfet