Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Bu yöntem, kromatin etkileşimlerinin rolü gibi transkripsiyonel düzenleme alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilgi bir çekirge için etkileşimleri nispeten tarafsız bir yakalama sağlar. Bu yöntem, organizatör arttırıcı etkileşimleri hakkında bilgi sağlasa da, diğer renk etkileşimlerini tanımlamak için de uygulanabilir.

Genellikle, bu yönteme yeni bireyler protokol için birkaç gün sürer, çünkü mücadele edecek ve astar tasarımı deneme yanılma ve atipik astar oryantasyon gerektirir. Tercih edilen hücrelerdeki kromatin etkileşimlerini korumak için, 10 milyon hücre başına PBS'ye %1 elektron mikroskobu sınıfı formaldehit in 9.5 mililitre ekleyerek çapraz bağlantı kurun. Oda sıcaklığında 10 dakika sallayarak hücreleri kuluçkaya yatırın.

Çapraz bağlantı reaksiyonu söndürmek için buz reaksiyonu için reaksiyon tüpleri aktarın ve 0.125 azı lakin son konsantrasyonuna buz gibi bir azı glisin ekleyin ve nazik inversiyon ile karıştırın. Metin protokolüne göre hücreleri santrifüj edip yıkadıktan sonra, %0,5 SDS ve bir X proteaz inhibitörleri ile beş milimolar EDTA'nın 125 mikrolitresinde peleti askıya alın. Hücre süspansiyonuna 10 dakika kuluçkaya yat.

Hücre lise sinin tamamlandığından emin olmak için, altı mikrolitre hücreyi altı mikrolitrelik trypan mavisi mikrolitreyi mikroskop slaytına karıştırın ve üzerini kapak fişi ile kapatın. Lysed hücrelerinin içini mavi ve unlysed hücrelerin beyaz görmek için bir mikroskop altında görüntüleyin. İlk kısıtlama sindirim için hücre süspansiyon için 10 X restriksiyon enzim tampon 30 mikrolitre ekleyin ve 27 mikrolitre 20% Triton X-100 ve su ile 300 mikrolitre toplam hacmi ayarlayın.

15 mikrolitrelik bir aliquot çıkarın ve sindirilmemiş kontrol olarak dört derece santigrat de saklayın. Kalan reaksiyon karışımı için 200 restriksiyon enzim bir birleştirir ekleyin. 900 RPM ajitasyon ile sallayarak ısıtma bloğunda enzim için uygun sıcaklıkta gece boyunca kuluçka.

Ertesi gün, enzim ek 200 birim ekleyin ve bu kuluçka gece devam edin. 15 mikrolitrelik bir aliquot çıkarın ve sindirilmiş kontrol olarak dört derece santigrat de saklayın. Sindirim verimliliğini belirlemek için her sindirilmemiş ve sindirilmiş kontrollere 82,5 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl, pH 7,5 ekleyin.

Formaldehit çapraz bağlanmasını tersine çevirmek için 65 santigrat derecede 2,5 mikrolitre proteinaz K ve kuluçka ya da 65 derece ye ekleyin. Sindirilmiş DNA'yı izole etmek için tüpe 100 mikrolitre fenol kloroform ekleyin. Artık protein kontaminasyonunu gidermek için birkaç hızlı inversiyon ile karıştırın.

Santrifüj 16, 100 Gr oda sıcaklığında beş dakika. Santrifüjden sonra sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Tüpe sodyum asetat, glikojen ve %100 etanol ekleyin ve ters çevrilerek hafifçe karıştırın.

DNA'yı çökeltmek için eksi 80 derecede bir saat kuluçkaya yat. Tüpü 16, 100 G's'de 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve sonra DNA pelet yıkamak için% 70 etanol 500 mikrolitre ekleyin.

Santrifüj 16, 100 Gr oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant hava çıkardıktan sonra iki dakika boyunca oda sıcaklığında pelet kuru artık etanol kaldırmak için. Re 50 mikrolitre nükleaz serbest su kurutulmuş pelet askıya ve metin protokolüaçıklandığı gibi QPCR tarafından sindirim verimliliğini belirlemek için devam.

Ligasyon için hazırlamak için, ısı ve 65 santigrat derece 20 dakika tüp kuluçka tarafından restriksiyon enzimi etkinleştirin. Sonra 50 mililitrelik konik tüp için tüp içeriğini aktarın ve nükleaz içermeyen su ekleyin, 10 X ligaz tampon, ve T4 DNA ligaz. Girdap yaparak hafifçe karıştırın ve gece boyunca 16 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin.

Çapraz bağlantı ters çevirmek için proteinaz K 15 mikrolitre ekleyin ve 65 santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün 30 mikrolitre RNase A ekleyin ve 37 santigrat derecede 45 dakikada kuluçkaya yatın. Kromatin izolasyonu ile devam etmek için, fenol kloroform yedi mililitre ekleyin ve birkaç hızlı inversions tarafından karıştırın.

Tüpü 3, 300 G'de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, sulu fazı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve çekirdeksiz su, üç molar sodyum asetat, glikojen ve %100 etanol ekleyin. İçeriği karıştırın ve bir saat boyunca negatif 80 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra tüpü 3, 900 G'de 4 derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve sonra buz soğuk 10 mililitre ile pelet yıkayın 70%etanol. Santrifüj 3, 300 G'de 4 santigrat derecede 15 dakika.

Supernatant çıkarın ve kısaca oda sıcaklığında pelet kuru. Pelet 150 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl pH 7.5 37 santigrat derece çözün. Negatif 20 santigrat derecede saklayın veya metin protokolünde açıklandığı gibi ikinci kısıtlama sindirim, ligasyon ve DNA arınması ile devam edin.

DNA arınmasını takiben, metinde açıklandığı gibi bilinmeyen etkileşimli dizilerin ters PCR amplifikasyonu için amplifikasyon döngülerinin sayısını belirlemek için ters PCR astarları ve siber ve ROX boyaları kullanarak QPCR gerçekleştirin. Dna'yı sıralamaya hazırlamak için, ters PCR'nin saflaştırılmış bir ürününün bir mikrogramını ve restriksiyon enzim monitörünü sindirerek üçüncü kısıtlama sindirimi ile yem dizilerini kesinleştirin. Sindirilmiş restriksiyon enzimini veya RE monitörünü beklenen parçalara uygun bir konsantrasyonun agarose jeli üzerinde çalıştırın.

Sindirim verimi jel elektroforez ile belirlendikten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ters PCR ürün arınması ve sıralama kitaplığı hazırlanması ile devam edin. Dairesel kromozom onay yakalama yeni nesil sıralama için üçüncü kısıtlama sindirim bu protokolde önemlidir. Bu sindirim kromatin konumlar belirlenmesini kolaylaştırabilir yem dizileri kapalı kırpar.

Sindirilmiş RE monitörün Agarose jel elektroforezi, paralel olarak sindirilen ters PCR ürününün yeterli şekilde sindirimini göstermiştir. Dört C sıralama okuma bittikten sonra kesilmiş ve insan referans genom hg38 eşlenen, BWA yazılım paketi kullanılarak. Okumaların çoğu beklendiği gibi HindiIII sitelerine bitişik olan hindiiii veya CviQ1I sitelerinde hizalanır.

Bu işlemi denerken hücrelerinizin lysed ve kromatin yeterince sindirilir emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kromatin immün çökeltisi veya CHIP gibi diğer yöntemler, kromatin etkileşimlerinde rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi gibi ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra kromatin alanındaki araştırmacıların fiziksel düzenleyici ağları keşfetmelerinin önünü açmıştır.