Name: Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin, 4C-seq protokolünü kullanarak kromatin etkileşimlerini ve transkripsiyonel düzenlemeyi nasıl çalışacağınızı. Bu yöntem, gen düzenleyici ağları incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIAMS (R01AR065523) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C+technology%3A+Protocols+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+%284C-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Transcriptional+and+Post-Transcriptional+Gene+Expression+Regulation%22%5BJournal%5D)">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li>
<li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+%284C-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Polycomb+Group+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li>
<li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+%284C-seq%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulatory+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li>
<li>Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic4Cseq%3A+An+R%2FBioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li>
<li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-ker%3A+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li>
<li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FourCSeq%3A+analysis+of+4C+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li>
<li>Williams, R. L. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li>
<li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li>
<li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li>
<li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787(2017).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

4C sonuçları önceden bilinmeyen düzenleyici elemanlarının tanımlayabilirsiniz kromatin etkileşimleri ve/veya bir belirli biyolojik bağlamda24,25,26yılında önemli hedef genleri ortaya potansiyeline sahip. Ancak, teknik engellerin Bu deneylerden elde edilen veriler sınırlayabilir. 4 C protokolleri şablonunda aşırı amplifikasyon kaynaklanan PCR önyargı olasıdır. Bu iletişim kuralı döngüleri amplifikasyon en uygun sayısı objektif bi...

Gen ekspresyonu için düzenleyici elemanlarının tanımlaması tarafından kapsamlı bir şekilde insan genomu1,%280'i için fonksiyonel etkinlik açıklamalı DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) proje kolaylaştırdı. Vivo transkripsiyon faktörü bağlama, DNaseI aşırı duyarlılık ve epigenetik histon ve tek hücre türleri olarak DNA metilasyonu değişiklikleri için sitelerin kimlik fonksiyonel analizleri aday düzenleyici açtı öğeler için hedef gen ekspresyonu. Bu bulgular ile silahlı, biz düzenleyici elemanlarının ve genler arasındaki işlevsel Birleştiricisi belirleme sorun ile karşı karşıya olan. Özellikle, belirli hedef gen ve onun enhancer(s) ilişkisi nedir? Kromatin conformation yakalama (3C) yöntemi doğrudan bir bölge ilgi ve etkileşim dizileri ile yakalanan olayların sabit kromatin3 aday arasında tanımlayıcı fiziksel ve büyük olasılıkla fonksiyonel, etkileşimler tarafından bu soru adresleri . Etkileşimleri kromatin anlayışımız olarak, ancak, bu önceden seçilmiş aday loci incelenmesi gen-artırıcı etkileşimleri tam bir anlayış sağlamak yetersiz olduğu açıktır. Örneğin, kodla insan genomu (44 loci ayarla % 1, pilot) küçük bir bölümünü incelemek için kullanılan yüksek üretilen iş kromozom conformation yakalama karbon kopya (5 C) yöntem ve karmaşık Birleştiricisi loci bildirdi. Genler ve arttırıcılar ile tanımlanan etkileşimleri birçoğu kilobases doğrusal alanı4uzaklıkta bulunan yüzlerce edildi 2 – 4 farklı etkileşen ortakları ortalama. Ayrıca, Li ve ark. Çiftli-bitiş etiketi sıralama (çim) göre kromatin etkileşimi analiz bütün-genom organizatörü etkileşimleri analiz ve RNA polimeraz II bağlayıcı siteleri % 65'i kromatin etkileşimleri dahil bulundu için kullanılır. Bu etkileşimler bazıları büyük, çok gen kompleksleri kilobases genomik mesafe ve içeren, ortalama olarak, yüzlerce spanning her58-9 genler sonuçlandı. Birlikte, bu bulgular kromatin etkileşimleri sorguya tarafsız bütün-genom yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Bu yöntemlerden bazıları Schmitt ve arkiçinde incelenir. 6.
Kromatin conformation yakalama çalışmaları için daha yeni yöntemler bilinmeyen dizileri faiz6bölge ile etkileşim keşfi yeni nesil (Hi-C ve 4 C-seq) sıralama etkinleştir ile birleştiğinde. Özellikle, yeni nesil sıralama (4C-seq) ile dairesel kromozom conformation yakalama yakalanan kromatin proksimal için gelen DNA sekanslama tarafından bir tarafsız şekilde7 ilgi bir dizi ile etkileşim loci tanımlamak için geliştirilmiştir 3B alanda ilgi bölgesi. Kısaca, kromatin Restriksiyon enzimi ile i ciddi ve daha sonra etkileşen loci (Şekil 1) biyolojik ilgili "düğüm" yakalamak için sulu şartlarda bakmaksızın onun yerli protein-DNA etkileşimleri korumak için sabittir. Çapraz bağlantılar böylece ek bölünme için kullanılabilir DNA ile ikinci bir Restriksiyon enzimi bırakarak protein kaldırmak için tersine çevrilir. Son ligasyonu etkileşen loci daha küçük daireler oluşturur. Astar ilgi sıralaması için daha sonra aşağı akım sonraki nesil sıralama tarafından takip circularized parçaları, bilinmeyen sıralarının güçlendirilmiş bir kütüphane oluşturmak için kullanılır.
Numune hazırlama üzerinde duruluyor, burada anlatılan Protokolü varolan 4 C-seq yöntemleri8,9,10,11,12iki önemli değişiklikler yapar. İlk olarak, ampirik olarak amplifikasyon en uygun sayısı 4 C-seq Kütüphane hazırlık adımları için döngüleri ve böylece kitaplıkları aşırı amplifikasyon dallanma PCR önyargı olasılığını açığının belirlemek için qPCR tabanlı yöntemi kullanır. İkinci olarak, bu bir ek kısıtlama Özet adım bir çaba doğru Bankası-tarafından sıralama enstrüman arama engel ve dolayısıyla, benzersiz, bilgilendirici sırası her okuma en üst düzeye çıkarır bilinen "yem" dizileri tekdüzelik azaltmak için kullanılır. Diğer iletişim kuralları bu sorun birçok (12-15)8 4 C-seq kitaplıklar farklı yem dizileri ve/veya kısıtlama siteleri, diğer laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir olmayabilir deneyler hacmi ile havuzu tarafından aşmak. Burada sunulan değişiklikler izin ver deneyler, az sayıda örnekleri ve/veya dizin ve bir tek şeride havuzlu çoğaltır.

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonükleotid primerleri</td><td>IDT</td><td></td><td>Okuyucu tarafından tasarlanmak üzere</td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit, metanol içermeyen</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Nutatör</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>%20 SDS çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama ısı bloğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg / mL glikojen</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>qPCR döngüleyici</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>qPCR plakaları</td><td>Thermo Fisher</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Magnezyum klorür</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreotol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin trifosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uzun Şablon PCR Sistemini Genişletin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Termo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Yeşil I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA Uç Onarım Takımı</td><td>Lucigen</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Hızlı DNA Ligasyon Sistemi</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli</td><td>Termo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieve Agaroz</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB70054</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4c-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Verilen hedef gen düzenleyici elemanlarının tanımlaması için bir hedef gen düzenleyici elemanlarının konumlandırma ve etkisi boyutları değişkenlik nedeniyle önemli bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bazı bioinformatic tahmin varlığı ve proksimal korunmuş transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri kullanarak aktif gen ekspresyonu ile ilişkili epigenetik değişiklikler fonksiyonu ile ilerlemeler kaydedilmiştir. Kromatin conformation yakalama çalışmaları yeteneğimizi fiziksel kromatin kişiler dizileri arasında ve tüm bir genom içinde bile keşfetmek için devrim. Dairesel kromatin conformation yakalama (4 C-seq), yeni nesil sıralama ile birleştiğinde özellikle, belirli bir sıra için olası tüm fiziksel kromatin etkileşimler (bakış), ilgi keşfetmek için bir hedef gen veya bir düzenleyici gibi tasarlanmıştır geliştirici. Geçerli 4C-seq stratejileri doğrudan bakış açısı içinde sıra ama çok sayıda gerektiren ve aynı anda üniforma teknik sorunları önlemek için sıralı için farklı bakış açıları (görüntüleme) arama sonraki nesil sıralama platformları ile baz. Bu birimin deney birçok laboratuarlar için pratik olmayabilir. Burada, bir ek Restriksiyon enzimi Özet ve farklı sıra okuma büyük bir yakalama kolaylaştırmak ve olasılığını azaltmak için tasarlanmış qPCR tabanlı amplifikasyon adımları içermektedir 4 C-seq protokolü için değiştirilmiş bir yaklaşım raporu PCR önyargı, anılan sıraya göre. Bizim tarihinde 4C mükellef kromatin mimari değerlendirmek için standart moleküler biyoloji laboratuarında yöntemidir.

Birincil insan Lenfositi 2-3 atılan yenidoğan foreskins izole edildi, havuza alınan ve kültürlü takıma KSFM 30 µg/mL ile sığır hipofiz özü, 0,26 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü ve 0.09 mM kalsiyum klorür (CaCl2 ) 37 ° c, % 5 karbon dioksit. Hücreleri iki şişe ayrılmış ve bir şişeye CaCl2 ek tarafından Proliferasyona üzerinden 72 h. 107 hücreler her için 1,2 mM son bir konsantrasyon için Ayrıştırılan ve nüfus % 1'sabit keratinosit farklılaş...

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Bu yöntem, kromatin etkileşimlerinin rolü gibi transkripsiyonel düzenleme alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilgi bir çekirge için etkileşimleri nispeten tarafsız bir yakalama sağlar. Bu yöntem, organizatör arttırıcı etkileşimleri hakkında bilgi sağlasa da, diğer renk etkileşimlerini tanımlamak için de uygulanabilir.Genellikle, bu yönteme yeni bireyler protokol için birkaç gün sürer, çünkü mücadele edecek ve astar tasarımı deneme yanılma ve atipik astar oryantasyon gerektirir. Tercih edilen hücrelerdeki kromatin etkileşimlerini korumak için, 10 milyon hücre başına PBS'ye %1 elektron mikroskobu sınıfı formaldehit in 9.5 mililitre ekleyerek çapraz bağlantı kurun. Oda sıcaklığında 10 dakika sallayarak hücreleri kuluçkaya yatırın.Çapraz bağlantı reaksiyonu söndürmek için buz reaksiyonu için reaksiyon tüpleri aktarın ve 0.125 azı lakin son konsantrasyonuna buz gibi bir azı glisin ekleyin ve nazik inversiyon ile karıştırın. Metin protokolüne göre hücreleri santrifüj edip yıkadıktan sonra, %0,5 SDS ve bir X proteaz inhibitörleri ile beş milimolar EDTA'nın 125 mikrolitresinde peleti askıya alın. Hücre süspansiyonuna 10 dakika kuluçkaya yat.Hücre lise s

high-throughput-identification-gene-regulatory-sequences-using-next

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Embriyonik kök hücrelerden üretilen embriyoid cisimlerde yüksek iş eldeli sıralamanın ardından kantitatif kromozom konformasyon yakalama uygulamasını rapor ediyoruz. Bu teknik, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında belirli bir genin putatif arttırıcılar ve promotör bölgeleri arasındaki temasları tanımlamaya ve quantitate sağlar.

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Öğrenin, 4C-seq protokolünü kullanarak kromatin etkileşimlerini ve transkripsiyonel düzenlemeyi nasıl çalışacağınızı. Bu yöntem, gen düzenleyici ağları incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq) (Video) | JoVE Journal

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Daha fazla video keşfet