Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Bu yöntem, periferik sinir yaralanması ve rejenerasyonu alanlarında, periferik bir sinirin morfometrisi nedir, kaç tane akson bulunur, miyelinleşme durumu nedir ve fibrotik doku var mı gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinir özelliklerinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine izin vermesidir. Anestezi uygulanmış bir fareyi bir diseksiyon matının üstüne yüzüstü pozisyonda yerleştirerek başlayın.

% 1-2 izofluran ile anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi yerleştirin. Yeterli anestezi derinliğini sağlamak için, hayvanları pedal çekme ve arka ayakların palpebral refleksleri açısından test edin. Uygun bir anestezi derinliği elde edildikten sonra, arka bacakların kıllarını tıraş edin ve traş edilen alanları %70 etanol ile sterilize edin.

Kesi için uygun yeri belirlemek için uyluk kemiğini palpe edin. Femur, siyatik sinirin en erişilebilir segmentinin hemen yakınında bulunur. Dizden daha büyük trokantere kadar arka bacak boyunca deride iki ila üç santimetrelik bir kesi yaptıktan sonra, pazı femoris kası ile gluteus maximus kası arasındaki düzlemi bulun.

Ardından, alttaki fasyayı ayırmak ve alttaki siyatik sinirin iki ila üç santimetresini açığa çıkarmak için mikrodiseksiyon makası kullanın. İki kas arasındaki boşluğu genişletmek için bir ekartör kullanın. İnce forseps ve iris makası ile siniri çevredeki bağ dokusundan dikkatlice ayırın, siniri sıkıştırmamaya veya kesmemeye büyük özen gösterin.

Ardından, açıkta kalan siniri Trump'ın Sabitleyicisi ile örtün ve 10 dakika bekletin. Gerekirse, açıyı iyileştirmek için arka bacağın altına gazlı bez yerleştirin, böylece boşluğa daha fazla sabitleyici eklenebilir. Sabitleyiciyi 10 dakika sonra çıkarın ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın.

Diseksiyon mikroskobu altında, ince diseksiyon makası kullanarak siyatik siniri her iki taraftan kesin, siniri germemeye veya sıkıştırmamaya dikkat edin. Sinir bölümlerini hemen Trump'ın Fiksatifini içeren 15 mL'lik tüplere koyun ve bir hafta boyunca dört santigrat derecede sabitleyin, fiksatifi her 48 saatte bir değiştirin. Fiksasyon sonrası, sinirden kalan yağ ve bağ dokularını dikkatlice çıkarın ve siniri yaklaşık beş milimetre uzunluğunda segmentlere ayırmak için keskin bir neşter kullanın.

Sinir segmentleri farklı etiketli tüplere ayrılabilir. Sinir segmentlerini iki saat boyunca taze hazırlanmış% 2 osmiyum tetroksit içine daldırın. Bir epoksi gömme kiti kullanarak, son gömme karışımını hazırlayın.

Epoksi gömme ortamını DDSA çözeltisi ile karıştırın ve epoksi gömme ortamını NMA çözeltisi ile karıştırın. Her iki çözeltiyi de manyetik bir karıştırıcı ile en az 20 dakika karıştırın. Kullanmadan hemen önce, hızlandırıcı DPM'sini çözüm B ile birleştirin ve ardından bunu, hızlandırıcının nihai oranı toplam hacmin bir nokta beş ile %2'si arasında olacak şekilde A çözümüyle birleştirin.

Sinir segmentlerini bir nokta beş mililitrelik tüplere aktarın ve PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'yi her biri 10 dakika boyunca artan konsantrasyonlarda aseton ve damıtılmış su ile değiştirerek dehidrasyon işlemine başlayın, ardından her biri 10 dakika boyunca% 100 asetonda. Kritik bir adım doku dehidrasyonudur. Su ve reçine etkileşime girmeyecektir, bu nedenle dokuda kalan herhangi bir su, reçine tarafından sızmayacak ve histolojik niteliklerden yoksun bölümde delikler bırakacaktır.

Reçine infiltrasyonu için, önce sinir segmentlerini 30 dakika boyunca bire bir gömme karışımı ve% 100 aseton karışımına yerleştirin. 30 dakika sonra, segmentleri 30 dakika boyunca ikiye bir gömme karışımı ve% 100 aseton karışımına aktarın. Sinir bölgelerini silikon kauçuk gömme kalıplarına yerleştirin ve reçineyi sinirlerin üzerine nazikçe ekleyin, hava kabarcıklarından kaçınırken tüm sinir segmentini kapladığınızdan emin olun.

Reçineyi gece boyunca 60 santigrat derecede polimerleşmeye bırakın. Trapez tarafı yukarı bakacak şekilde ultramikrotom tutucusuna gömülü siniri olan bir reçine bloğu yerleştirin. Ultramikrotom dürbününden bakarken, sinir dokusunu çevreleyen fazla reçineyi kesmek için tek kenarlı bir bıçak kullanın.

Osmiyum tetroksit ile koyu renkli boyanması ile tanınabilen sinir segmentinin uzunlamasına yüzeyine nüfuz etmeyin. Ultramikrotom üzerinde düz bir cam bıçakla, sinirin düzgün bir kesit yüzeyini ortaya çıkarmak için birden fazla kesit yapın. Bu yapıldıktan sonra, oda sıcaklığında damıtılmış su ile doldurulmuş tekne ile bir cam bıçağa geçin ve ince kesitleri kesmek için ultramikrotomu bir ila iki mikrona ayarlayın.

Yüzen ince bölümleri cam bıçak teknesinden bir cam kaydırak üzerindeki bir damla deiyonize suya aktarmak için metal bir halka kullanın. Bir diğer kritik adım, ince kesitin cam bıçaktan slayta aktarılması sırasındadır. Bu ince bölümler çok kırılgandır ve kırılabilir veya katlanabilir.

Bölümlere ayırdıktan sonra, bir sürgüyü alevin üzerinden birkaç kez geçirerek slaytların üzerindeki bölümleri kurutun ve bölümlerin aşırı ısınmamasına dikkat edin. Slaytlar, toluidin mavisi ile hemen boyanmazsa, oda sıcaklığında birkaç gün saklanabilir. Sinir bölümlerini boyamak için, sinir bölümlerinin üstüne bir damla toluidin mavisi çözeltisi eklemek için plastik bir pipet veya mikropipetleyici kullanın.

20 ila 30 saniye sonra, slaytları bir deiyonize su kavanozuna hafifçe daldırarak ve bölümler temizlenene kadar üç ila dört kez tekrarlayarak tüm toluidin mavisi solüsyonu fazlalığını durulayın. Slaytları 60 santigrat derecede en az 15 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Kuruduktan sonra, normal montaj ortamı ekleyin ve bölümleri bir lamel ile örtün.

Son olarak, monte edilen bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin. G oranlarını hesaplamak için ayrıntılı görüntüler için 100X yağa daldırma lensi önerilir. Reçine ortamına gömülü ve toluidin mavisi ile boyanmış siyatik sinir bölümleri, büyütmeyi 10X'ten 20X, 40X ve 60X'e çıkarırken optimum çözünürlüğe sahip net görüntüler gösterdi.

Bu yöntem sinir yapısını korur ve B etiketli okla gösterilen akson çapının A etiketli toplam lif çapına oranı olan g-oranı gibi çeşitli parametrelerin ölçümünü kolaylaştıran yüksek çözünürlüklü, yüksek büyütmeli görüntülemeye izin verir. Yetersiz dehidrasyon nedeniyle bölümde delikler de oluşabilir. Prosedürdeki bir başka olası hata, cam slayt üzerine kesit transferi için aşılayıcı halkalar kullanılarak giderilebilen bölümlerin katlanmasıdır.

Bu prosedürü takiben, rejeneratif bir sinirdeki rejenerasyon derecesi nedir gibi ek soruları yanıtlamak için akson kantifikasyonu gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, sinir morfometrisini değerlendirmek için bir ila iki mikron periferik sinir kesitinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.