Name: Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin periferik sinir morfolojisini toluidin mavisi boyama ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol, sıçan iskias sinirinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayarak akson sayımı ve miyelinasyon analizi yapılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar naklinden Jenkins mikroskobu tesisinde Wyoming Üniversitesi için onların yardım ve üyeleri Bushmen lab, Kelly Roballo, Hayden doğru Wupu Osimanjiang ve harun Dhunghana, hayvan bakımı yardım için istiyorum. Bu yayın bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant # 2P20GM103432 altında mümkün yapıldı.

Yetişkin Sprague Dawley rat bu projede kullanılan ve tüm yordamları Wyoming Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ameliyat ve Vivo sinir fiksasyon
Not: Tüm malzeme ve cihazları bu protokol için için satıcı bilgileri Malzemeler tablolistelenir.
Not: Vivo içinde sinir fiksasyon dokuyu korumak ve ölüm saati ve sinirleri topluluğu arasında oluşan yapısal bozulma azaltmak için kullanılır. Vivo doku fiksasyon histoloji, sinir sistemi doku hazırlanması için standart bir uygulama burada perfüzyon kez bu habercisi olmasıdır. Yerleşimi ve boyutu periferik sinirlerin yerinde fiksasyon için izin. Biz toplama ve ötenazi doku yıkımı olasılığı nedeniyle sonra doku fiksasyon önermiyoruz.
<ol><li>Fare için genel anestezi ile % 2-3 isoflurane, bir indüksiyon odasında koyarak hazırlamak sonra imzalat sıçan yüzükoyun üst kısmında bir diseksiyon mat yerleştirin ve isoflurane anestezik burun konisi üzerinden % 1-2 korumak. Yeterli anestezi derinliği sağlamak için hayvanlar arka ayak pedalı çekilmesi için sınav ve palpebral refleksleri gözleri, yokluğu için göz medial canthus dokunarak kontrol. Not: Ketamin mayi enjeksiyon inhale isoflurane yaygın olarak kullanılan bir alternatiftir.</li>
	<li>Siyatik sinir göstermek için hind limb(s) saç tıraş ve % 70 etanol ile traş alanları temiz. Bir neşter ya da makas ile hind bacak diz daha büyük trochanter kadar birlikte deride 2-3 cm kesi yapmak nereye belgili tanımlık kesme uygun konumunu sağlamak için steril neşter kullanarak femur palpasyonla. Uyluk kemiği sadece proksimal siyatik sinir en kolay bölümüne yer alır. Bu bir hayatta kalma ameliyat olsa bile, steril teknikleri korumak.</li>
	<li>Cilt kesi yaptıktan sonra pazı kemiği kas ve gluteus maksimus kas arasında uçak bulun ve mikrodiseksiyon makas kullanarak temel fasya ayrı ve 2-3 cm, alt çizgi siyatik sinir ortaya çıkarmak. Siyatik sinir net bir bölümünü göstermek için bir Retraktörü iki kas (Şekil 1A) arasındaki boşluğu genişletmek için kullanın. İyi forseps ve Iris makas ile dikkatli bir şekilde bağ dokusu, sıkıştırmak veya sinir kesmek için çok dikkat çekici çevre sinir ayırın.</li>
	<li>Yeterli Trump'ın sabitleştirici (%4 formaldehit, 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz) ile NaH2PO4· 1.16 g %1 oxazolidin Ekle H2O 100 mL başına) maruz sinir sinir kapak ve 10 dakika oturup bekleyin içeren kavite içine. Gerekli, hind altında yer gazlı bez daha fazla sabitleştirici boşluğa eklenebilir açı geliştirmek için bacak. 10 dakika sonra sabitleştirici kaldırmak ve bu iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop kullanarak genişletmek ya da siyatik sinir, çimdik emin ince diseksiyon makası kullanarak her iki taraftan sinir ve hemen Trump'ın sabitleştirici değişen bir hafta için 4 ° C'de içeren 15 mL tüpler sinir bölümlerde koydu sabitleştirici her 48 h.</li>
	<li>Hayvanlar, herhangi bir bölümünü cerrahi işlem sırasında sahipsiz bırakmayın. Sinir çıkarıldıktan sonra rahim ağzı çıkık iken anestezi altında tarafından hayvanlar ötenazi.</li>
</ol>2. osmiyum Tetroxide tedavi ve reçine katıştırma
<ol><li>Fiksasyon sonrası, dikkatle herhangi bir kalan yağ ve bağ dokusu sinir kaldırmak ve sinir bölümler 5 mm uzunluğunda (segmentlere ayrılmış ve etiketli farklı tüplerde sinir) yaklaşık halinde kesmek için keskin bir neşter kullanın. Taze % 2 osmiyum tetroxide Trump'ın sabitleştirici çözümde seyreltilmiş hazırlamak ve bir cam tüp içinde tutun. % 2 osmiyum tetroxide 2 h, plastik tüplerde kısa bu süre için olabilir için sinir segmentlerinde bırakın. Not: Bazı plastik tüpler osmiyum osmiyum tetroxide Plastik tüpler uzun süreli depolama tavsiye edilmez bu yüzden bir çözümü, karartma neden tetroxide ile tepki.</li>
	<li>Orta kiti gömme bir epoksi kullanarak, son katıştırma formül hazırlayın:<ol>
<li>Orta DDSA çözüm (dodecenylsuccinic anhidrit; karışım A) katıştırma epoksi mix ve orta NMA çözüm (methylnadic anhidrit; karışım B) katıştırma epoksi karışımı. A ve B en az 20 dakika karıştırarak mıknatıslı bir karıştırıcı ile tarafından karıştırın her iki karışımları izin.</li>
		<li>Hemen kullanmadan karışım A ve B mix ve Hızlandırıcı DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) karışımı toplam hacminin 1.5-%2.0 oranındaki. ekleyin DPM-30 çözüm tam blok koyu renkli ve kırılgan olmasını önlemek için ölçülmelidir unutmayın. Tüm reçine kimyasal toksik maddelerdir; Ciltle temas veya inhalasyon önlemek için ekstra dikkat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL tüpler kullanarak, yıkama PBS olan sinir kesimi ve farklı aseton/distile su pasajlar sinir kesimleri yerleştirerek dehidratasyon işlemini başlatmak: % 30, % 60, %90, konsantrasyonları 10 dk sonra 10 dakika için 3 kez %100 aseton.  Not Bu etanol aseton yerine kullanılabilir.</li>
	<li>1 yarı final gömme karışımı karışımı sinir segmentlerinde ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk sonra son katıştırma karışımı 2 bölümden oluşan bir karışım ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk içinde için reçine infiltrasyon için yer , ve sonunda sinir kesimleri finalde yer katıştırma karışımı 30 dk için.</li>
	<li>Sinir kesimleri silikon kauçuk kalıpları katıştırma koymak (biz 106 mm Uzunluk x 71 mm genişlik x 7 mm derinlik kullandık; blok boyutu 11 mm Uzunluk x 6 mm genişlik x 3 mm derinlik). Yavaşça bütün sinir segmentleri kapsayacak ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçınmak emin sinirler üzerine reçine ekleyin. 60 ° C'de gecede polimerize reçine olan sinir kesimi içeren kalıp bırakın.</li>
</ol>3. kesit Ultramicrotome tarafından
<ol><li>Cam bıçak cam bıçak maker (Şekil 1B) kullanarak hazırlamak ve sinir bölümleri distile su üzerinde yüzen toplamak için kullanılan tekneler (Şekil 1 c), bıçaklarla cam yapmak.</li>
	<li>Gömülü reçine sinir blokları ultramicrotome yuvasına trapez yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ultramicrotome kapsamı kullanarak, herhangi bir fazla reçine sinir dokusu çevreleyen trim ve yamuk şekli yüz blok yapmak ve sinir jilet gibi tek taraflı bir bıçak kullanarak mümkün olduğunca boyuna yüzeyine yakın. Osmiyum tetroxide tarafından karanlık onun boyama tarafından algılanabilmesini sinir segmentin boyuna yüzeye nüfuz değil. Not: Aşırı reçine kesme kesitli ve bıçak performans ve kesme sonraki adımda geliştirmek için reçine alanı azaltmak.</li>
	<li>Ultramicrotome kullanarak, birden çok kesit düzgün kesit yüzeyi düz cam bıçak kullanarak sinir dokusunun ortaya çıkarmak yeterli olun. Bu yapıldıktan sonra tekne kimin oda sıcaklığında distile su ile dolu bir cam bıçak geçin ve ultramicrotome ince kesitler kesmek için 1-2 mikron için ayarlayın.</li>
	<li>Kayan ince kesitler cam bıçak tekne metal döngü (Şekil 1 d) kullanarak cam slayt üzerinde bir damla deiyonize su aktarın. Bölüm bölümleri ısınmasına emin bir kaç saniyeliğine bir alev üzerinde birkaç kez geçirerek içeren slaytlar kuru. Kurutulmuş bölümlerle hemen toluidin mavi leke veya boyama önce birkaç gün boyunca oda sıcaklığında saklayın. Not: Bölümler de sıcak bir tabak 60 ° C'de 15 dakikadır kullanarak kurumuş. Yavaş bir kurutma işlemi bölümler pürüzsüz yapar.</li>
</ol>4. toluidin Blue boyama
<ol><li>Toluidin blue çözümünün %1 100 mL deiyonize su, sodyum borat, 2 g çözülerek hazırlamak sonra toluidin mavi 1 g ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Filtre kağıdı kullanarak çözüm filtre (gözenek boyutu: 11 µm) ve çözüm opak bir şişenin içine oda sıcaklığında iki haftaya kadar tutun.</li>
	<li>Bir plastik pipet veya mikro pipettor kullanarak, sinir bölümleri üst toluidin blue çözüm bir damla ekleyin ve 20-30 s için bırakın.</li>
	<li>Yavaşça slaytlar deiyonize su kavanoza daldırma tarafından tüm toluidin blue çözüm aşırı durulama ve bölümler berraklaşana kadar 3 - 4 kez tekrarlayın. Slaytlar en az 15 dk 60 ° c veya gecede oda sıcaklığında kuru ve sonra bölümleri düzenli montaj orta kullanarak bir coverslip ile kapağı. Bağlı slayt hemen incelemek veya oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Işık mikroskop altında incelemek. Bir 100 X yağı daldırma lens g-oranları hesaplamak için kullanılan detaylı görüntüler için önerilir.</li>
</ol>

<ol><li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development%3A+What+small+animal+models+can+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li>
<li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury%3A+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li>
<li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li>
<li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5%3A+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobioly%22%5BJournal%5D)">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li>
<li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue+and+Lugol%27s+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li>
<li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22A+manual+of+applied+techniques+for+biological+electron+microscopy%22">A manual of applied techniques for biological electron microscopy</a>. , Plenum. New York. 257(1993).</li>
<li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li>
<li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/joces/s3-105/69/99.full.pdf">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li>
<li>Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+Part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li>
<li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+nerve+biopsies%3A+A+practical+guide+for+neuropathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li>
<li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li>
<li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2004.27.3.161">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li>
<li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2007.30.1.27">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+stains%3A+A+literature+review+and+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Health+Science%22%5BJournal%5D)">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li>
<li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+and+nonporous+nerve+conduits%3A+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li>
<li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79(2017).</li>
</ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Periferik sinir hasarı ve rejenerasyon morfolojik yapılarının imtihanlarını çalışma13sık konularıdır. Bu protokol için reçine bloklar halinde gömülü ve toluidin blue ile lekeli sıçan siyatik sinir dokusu kullanarak histolojik veri quantifications için yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereken adımları açıklar. Bu tekniğin sinir morfoloji içinde sinir rejenerasyon akson sayısı, myelination, infiltrative fibrotik doku varlığı ve sağlığı sinirler ölçerek sayısal bir görüntü sağlar. Yeterli<s...

Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar1ile innerve vücut boyunca uzanır. Tarafından tıbbi bozukluklar periferik sinirleri hataları neden ve travma büyük kamu sağlık kaygı temsil ve büyük ekonomik etkileri2,3. Periferik sinir yaralanmaları sonuçlarını değerlendirmek ve sinir rejenerasyon anlama gelişmeler rağmen sinir Histoloji ve teknikleri boyama gibi geleneksel yöntemleri nitelik ve nicelik sinir sağlık değerlendirmek için gerekli araçları vardır. bir terminal sonucu ölçüyü hayvan modelleri veya eksize insan dokusu. Bu kez neden işlevsel sinir rejenerasyon mi ya da olmamış nerede morfometri ortaya çıkarabilir periferik sinir fonksiyonu, elektrofizyolojik ölçümleri ile eşleştirilmiş olan.
Toluidin blue gömülü reçine periferik sinirleri yarı ince bölümlerini boyama myelinated sinir lifleri, yüksek kalite sağlayan görüntüleme için özel bir yöntemdir ve sinir yapıları4,5,6 detaylı görüntülerini temizlemek . Toluidin blue 18567' de, William Henry Perkin tarafından keşfedilen bir acidophilic metakromatik leke ve çeşitli tıbbi uygulamalar8' kullanılır. Toluidin periferik sinirleri mavi lekeli bölümleri reçine gömülü sinir kesimleri elde sinir yapıları net görselleştirme için sağlar. Görselleştirme miyelin kılıf yapısının osmiyum tetroxide sonrası fiksasyon4,9kullanımı ile gelişmiş olabilir. Osmiyum tetroxide starkly tanımlanmış lipid zengini miyelin kılıf10dakika sonra sonuçlanan lipidler, Çift bonolarını ile etkileşimde bulunan bir toksik oksidan ve lipid sabitleştirici ajandır. Ancak, osmiyum tetroxide toksik, pahalı, sinir segmentlerinin uzun bir kuluçka için ve her zaman kullanılmaz.
İşleme ve boyama alternatif yöntemler periferik sinirleri morfoloji görselleştirme için geliştirilmiştir; Boya çözüm periferik sinirleri rejenerasyon 11,12 morfolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan veya parafin, kriyojenik kesit ve epoksi reçine gömülü sinir kesit toluidin blue ile boyama tarafından takip . Bu yöntemler her aksonlar, miyelin kalınlığı, akson çapı ve akson çapı myelinated lif çapı (g-oran) 11,13,14,15 sayısı avantaj ve verim temel veri var .
Birincil reçine-bu iletişim kuralı içinde katıştırma o sinir histolojik özellikleri korunarak reçine sertliği nedeniyle 1-2 mikron kalınlık kesit alma kolaylaştırır ayrımdır. Bu ince kesitler, gömme, parafin elde 4-5 mikron kalınlığı bölümleri aksine periferik sinir bölümlerde axon myelination, g-oranı, olamaz gibi daha doğru bir miktar için izin veren yüksek çözünürlüklü daha kalın kesitler16' dan elde. Kriyojenik kesit 1-2 µm bölümler elde etmek için kullanılan iken, bizim deneyim daha bölümlerde çok sayıda büyük çatlak olmadan elde etmek zor oldu. Kırık tür bölümleri akson sayısı ve myelination yönleri yanlış sayım neden olabilir.
Toluidin blue yanı sıra17boyama yöntemi18 ve Masson'ın trichrome boyama4 boyama bir gümüş de sinir aksonlar göstermek için kullanılabilir. Oysa toluidin blue boyama açık miyelin kılıf görüntü gösterdi ve -ebilmek kolayca Ancak, reçine sıçan medyan sinir bölümlerini katıştırma kullanarak ya Hematoksilen ve eozin veya Masson'ın trichrome gösterdi zayıf miyelin kılıf ve tanınmayan yapıları ile lekeli quantified4yaşında. Bazı sınırlamaları rağmen toluidin gömülü reçine periferik boyama mavi sinir sinir morfolojisi yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerekli olduğunda kullanılabilecek değerli bir teknik var.
Reçine katıştırma için birincil dezavantajı bu zaman alan ve parafin ve donmuş gömülü bölümleri teknikleri ile karşılaştırıldığında antijen alma zorluğu nedeniyle aynı doku immunostaining için izin vermez olduğunu. Bu nedenle, reçine-toluidin blue boyama için katıştırma üzerinden işlenir immunostaining için aynı doku kullanmak genellikle mümkün değildir. Her ne kadar değil immünhistokimya isteniyorsa burada, kullanılan reçine katıştırılmış kesitler, glikol metakrilat reçineleri katıştırma kullanımı verir için doku bölümler üzerinde gerçekleştirilecek immünhistokimya; nispeten pahalı19yaşında Bu biraz periferik sinirleri ayrı kesimleri, bazı reçine katıştırma için ve diğerleri için immunostaining içine doğrudan fiksasyon sonra kesim tarafından azaltılabilir.
Toluidin blue reçine boyama işlemi en histopatolojik analizi ile fiksasyon, su kaybı da dahil olmak üzere, gömme, kesit ve20boyama beş aşamada bölünmüştür gibi periferik sinirler, katıştırılmış. Biz burada katıştırılmış sıçan siyatik sinir bölümleri lekeli reçine toluidin elde etmek için mavi yüksek kaliteli görüntüler ile kullanmak için bir iletişim kuralı ve pratik kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponu Tuzlu</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin</td><td>Mavisi O Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Tetraborat Dekahidrat</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi Gömme Ortamı</td><td>Kiti Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Trump'ın fiksatif pH'ını ayarlamak için</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit</td><td>Çözeltisi Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Mikro Slaytlar, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Cam</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Gömme</td><td>Dökme Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Cam Bıçak Makinesi</td><td>RMC Ürünleri</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC Ürünleri</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Tüp</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Cam Flakon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Reçine bloğunu kesmek için</td></tr><tr><td>Mükemmel Döngü Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>70944</td><td>İnce reçine bölümlerini almak için</td></tr><tr><td>Ultra Cam Bıçak Şeritleri 6,4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Fırın</td><td>Değirmeni&nbsp;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Whatman Filtre Kağıdı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastik pipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Mikro cerrahi Kiti</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus floresan mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Çift CCD Renkli ve Tek Renkli Kamera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidin blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar ile innerve vücut boyunca uzanır. Yaygın dağıtım nedeniyle periferik sinirler sık travma veya hastalık nedeniyle zarar görmüş. Periferik sinir yaralanma hayvan modellerinde, işlev ve rejenerasyon, değerlendirmek için geliştirilmiştir yöntemleri ve stratejileri gibi periferik sinirleri morfometri analiz bir temel terminal sonuç ölçü haline gelmiştir. Toluidin sinir çapraz boyama Mavi bölümler gömülü reçine sinir bölümlerden elde edilen nitel ve nicel değerlendirmeler periferik sinir, görselleştirme akson sayısı Morfoloji ve derecesi etkinleştirme için tekrarlanabilir bir yöntemdir myelination. Bu teknik yöntemlerle birçok diğer histolojik olarak öğrenmek ve standart yazılı protokolleri kullanarak master zor olabilir. Bu yayının amacı bu nedenle toluidin videografisi siyatik sinirleri sıçanlarından emir hasat kullanarak yöntemi ile periferik sinirleri boyama mavi yazılı protokollerde vurgulamak için. Bu protokol için in vivo periferik sinirleri fiksasyon ve doku ve sonrası fiksasyon ile % 2 osmiyum tetroxide, topluluğu tarif epoksi reçine ve ultramicrotome sinir için 1-2μm kalınlık kesit sinirleri katıştırma. Sinir bölümleri bir cam slayt transfer ve sonra onlar nicelik ve nitelik değerlendirilir toluidin blue ile lekeli. En sık görülen sorunlar örnekleri yanı sıra bu sorunları azaltıcı adımlar gösterilmiştir.

Reçine periferik sinirleri toluidin ile mavi lekeli bölümleri doğru histolojik veri quantifications için izin gömülü. Yordamı genel bakış (Şekil 2' de) gösterilir. Siyatik sinir bölümleri reçine ortamda gömülü ve toluidin mavi net gösterdi görüntüleri en iyi çözünürlük (Şekil 3) ile lekeli. Sinir hasarı pek çok değişiklik sinir morfolojik yapıları, örneğin, sinir lifi, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığı değişikliklere neden olabilir. Bu yö...

Burada güzel yapıları periferik sinir alma ve 1-2 µm bölümlerle toluidin blue boyama görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut

Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Bu yöntem, periferik sinir yaralanması ve rejenerasyonu alanlarında, periferik bir sinirin morfometrisi nedir, kaç tane akson bulunur, miyelinleşme durumu nedir ve fibrotik doku var mı gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinir özelliklerinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine izin vermesidir. Anestezi uygulanmış bir fareyi bir diseksiyon matının üstüne yüzüstü pozisyonda yerleştirerek başlayın.% 1-2 izofluran ile anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi yerleştirin. Yeterli anestezi derinliğini sağlamak için, hayvanları pedal çekme ve arka ayakların palpebral refleksleri açısından test edin. Uygun bir anestezi derinliği elde edildikten sonra, arka bacakların kıllarını tıraş edin ve traş edilen alanları %70 etanol ile sterilize edin.Kesi için uygun yeri belirlemek için uyluk kemiğini palpe edin. Femur, siyatik sinirin en erişilebilir segmentinin hemen yakınında bulunur. Dizden daha büyük trokantere kadar arka bacak boyunca deride iki ila üç santimetrelik bir kesi yaptıktan sonra, pazı femoris kası ile gluteus maximus kası arasındaki düzlemi bulun.Ardından, alttaki fasyayı ayırmak ve alttaki siyatik sinirin iki ila üç santimetresini açığa çıkarmak için mikrodiseksiyon makası kullanın. İki kas arasındaki boşluğu genişletmek için bir ekartör kullanın. İnce forseps ve iris makası ile siniri çevredeki bağ dokusundan dikkatlice ayırın, siniri sıkıştırmamaya veya kesmemeye büyük özen gösterin.Ardından, açıkta kalan siniri Trump'ın Sabitleyicisi ile örtün ve 10 dakika bekletin. Gerekirse, açıyı iyileştirmek için arka bacağın altına gazlı bez yerleştirin, böylece boşluğa daha fazla sabitleyici eklenebilir. Sabitleyiciyi 10 dakika sonra çıkarın ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın.Diseksiyon mikroskobu altında, ince diseksiyon makası kullanarak siyatik siniri her iki taraftan kesin, siniri germemeye veya sıkıştırmamaya dikkat edin. Sinir bölümlerini hemen Trump'ın Fiksatifini içeren 15 mL'lik tüplere koyun ve bir hafta boyunca dört santigrat derecede sabitleyin, fiksatifi her 48 saatte bir değiştirin. Fiksasyon sonrası, sinirden kalan yağ ve bağ dokularını dikkatlice çıkarın ve siniri yaklaşık beş milimetre uzunluğunda segmentlere ayırmak için keskin bir neşter kullanın.Sinir segmentleri farklı etiketli tüplere ayrılabilir. Sinir segmentlerini iki saat boyunca taze hazırlanmış% 2 osmiyum tetroksit içine daldırın. Bir epoksi gömme kiti kullanarak, son gömme karışımını hazırlayın.Epoksi gömme ortamını DDSA çözeltisi ile karıştırın ve epoksi gömme ortamını NMA çözeltisi ile karıştırın. Her iki çözeltiyi de manyetik bir karıştırıcı ile en az 20 dakika karıştırın. Kullanmadan hemen önce, hızlandırıcı DPM'sini çözüm B ile birleştirin ve ardından bunu, hızlandırıcının nihai oranı toplam hacmin bir nokta beş ile %2'si arasında olacak şekilde A çözümüyle birleştirin.Sinir segmentlerini bir nokta beş mililitrelik tüplere aktarın ve PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'yi her biri 10 dakika boyunca artan konsantrasyonlarda aseton ve damıtılmış su ile değiştirerek dehidrasyon işlemine başlayın, ardından her biri 10 dakika boyunca% 100 asetonda. Kritik bir adım doku dehidrasyonudur. Su ve reçine etkileşime girmeyecektir, bu nedenle dokuda kalan herhangi bir su, reçine tarafından sızmayacak ve histolojik niteliklerden yoksun bölümde delikler bırakacaktır.Reçine infiltrasyonu için, önce sinir segmentlerini 30 dakika boyunca bire bir gömme karışımı ve% 100 aseton karışımına yerleştirin. 30 dakika sonra, segmentleri 30 dakika boyunca ikiye bir gömme karışımı ve% 100 aseton karışımına aktarın. Sinir bölgelerini silikon kauçuk gömme kalıplarına yerleştirin ve reçineyi sinirlerin üzerine nazikçe ekleyin, hava kabarcıklarından kaçınırken tüm sinir segmentini kapladığınızdan emin olun.Reçineyi gece boyunca 60 santigrat derecede polimerleşmeye bırakın. Trapez tarafı yukarı bakacak şekilde ultramikrotom tutucusuna gömülü siniri olan bir reçine bloğu yerleştirin. Ultramikrotom dürbününden bakarken, sinir dokusunu çevreleyen fazla reçineyi kesmek için tek kenarlı bir bıçak kullanın.Osmiyum tetroksit ile koyu renkli boyanması ile tanınabilen sinir segmentinin uzunlamasına yüzeyine nüfuz etmeyin. Ultramikrotom üzerinde düz bir cam bıçakla, sinirin düzgün bir kesit yüzeyini ortaya çıkarmak için birden fazla kesit yapın. Bu yapıldıktan sonra, oda sıcaklığında damıtılmış su ile doldurulmuş tekne ile bir cam bıçağa geçin ve ince kesitleri kesmek için ultramikrotomu bir ila iki mikrona ayarlayın.Yüzen ince bölümleri cam bıçak teknesinden bir cam kaydırak üzerindeki bir damla deiyonize suya aktarmak için metal bir halka kullanın. Bir diğer kritik adım, ince kesitin cam bıçaktan slayta aktarılması sırasındadır. Bu ince bölümler çok kırılgandır ve kırılabilir veya katlanabilir.Bölümlere ayırdıktan sonra, bir sürgüyü alevin üzerinden birkaç kez geçirerek slaytların üzerindeki bölümleri kurutun ve bölümlerin aşırı ısınmamasına dikkat edin. Slaytlar, toluidin mavisi ile hemen boyanmazsa, oda sıcaklığında birkaç gün saklanabilir. Sinir bölümlerini boyamak için, sinir bölümlerinin üstüne bir damla toluidin mavisi çözeltisi eklemek için plastik bir pipet veya mikropipetleyici kullanın.20 ila 30 saniye sonra, slaytları bir deiyonize su kavanozuna hafifçe daldırarak ve bölümler temizlenene kadar üç ila dört kez tekrarlayarak tüm toluidin mavisi solüsyonu fazlalığını durulayın. Slaytları 60 santigrat derecede en az 15 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Kuruduktan sonra, normal montaj ortamı ekleyin ve bölümleri bir lamel ile örtün.Son olarak, monte edilen bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin. G oranlarını hesaplamak için ayrıntılı görüntüler için 100X yağa daldırma lensi önerilir. Reçine ortamına gömülü ve toluidin mavisi ile boyanmış siyatik sinir bölümleri, büyütmeyi 10X'ten 20X, 40X ve 60X'e çıkarırken optimum çözünürlüğe sahip net görüntüler gösterdi.Bu yöntem sinir yapısını korur ve B etiketli okla gösterilen akson çapının A etiketli toplam lif çapına oranı olan g-oranı gibi çeşitli parametrelerin ölçümünü kolaylaştıran yüksek çözünürlüklü, yüksek büyütmeli görüntülemeye izin verir. Yetersiz dehidrasyon nedeniyle bölümde delikler de oluşabilir. Prosedürdeki bir başka olası hata, cam slayt üzerine kesit transferi için aşılayıcı halkalar kullanılarak giderilebilen bölümlerin katlanmasıdır.Bu prosedürü takiben, rejeneratif bir sinirdeki rejenerasyon derecesi nedir gibi ek soruları yanıtlamak için akson kantifikasyonu gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, sinir morfometrisini değerlendirmek için bir ila iki mikron periferik sinir kesitinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare doku veri toplama maksimize etmek için farklı teknikler bir arada sunulmaktadır.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Periferik duyusal sinir lifi alt tiplerinin İmmünositokimyasal kimlik (ve orada protein ekspresyonu tespit), periferik hissi altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için kilit öneme sahiptir. Burada periferik duyusal sinir lifleri belirli immün için, deri ve bacak kemikleri gibi periferik / visseral doku örnekleri, hazırlama yöntemleri açıklanmaktadır.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Bu video, toluidin mavisi kullanılarak reçine gömülü, osmiyum tetroksit ile tedavi edilmiş sıçan periferik sinir bölümlerinin boyama tekniğini göstermektedir. Lekeli sinir bölümleri, periferik sinirlerin ince yapılarını görselleştirmeye yardımcı olur.

Periferik Sinir Bölümlerinin Toluidin Mavisi Boyaması: Periferik Sinir Yapısının Görüntülenmesi İçin Miyelinli Sinir Liflerini Boyama Tekniği

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Bir retina uyarıcı içinde tek tek elektrotlar doğrudan bitişik retina hücre mimarisini görselleştirmek teknikleri.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

Koku ensheathing hücreleri (OECS), birincil koku nöronların büyümesine izin vermek nöral tepe hücreleri bulunmaktadır. Bu özel özellik, hücresel nakli için de kullanılabilir. Burada bir gırtlak sinir yaralanması modelinde OECS kullanımına göre hücre transplantasyonu bir model mevcut.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Dinamik boyuna görüntüleme ve muhabiri transgenik farelerin sinir uçlarının selektif lazer lezyon için protokol sunulmuştur.

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Demiyelinizan hastalıklar, lizolesitinin CNS'ye fokal olarak uygulanmasıyla hayvanlarda modellenebilir. Fare omuriliğine tek bir lizolesitin enjeksiyonu, zamanla kendiliğinden onarılan bir lezyon oluşturur. Amaç, de- ve remiyelinizasyon ile ilgili faktörleri incelemek ve onarımı geliştirmek için ajanları test etmektir.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Burada, stiril piridinyum boyalarla boyama ve lekelenme sırasında fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının canlı mızrak şeklinde duyusal terminallerini görüntülemek için yeni bir hazırlığı açıklıyoruz.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Öğrenin periferik sinir morfolojisini toluidin mavisi boyama ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol, sıçan iskias sinirinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayarak akson sayımı ve miyelinasyon analizi yapılmasına olanak tanır.

Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Daha fazla video keşfet