Name: Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin, akış sitometresi ile mikrobiyal topluluk dinamiklerini analiz etmeyi. Bu yöntem, saf kültürler ve doğal ekosistemlerde hızlı, maliyet etkin izleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz minnetle Michael Jahn ve Yuting Guo yordam ve datasets saf kültür ve aktif çamur topluluk, sırasıyla sağlamak için kabul. Biz daha fazla Katrin Mörters Biyogaz toplum örnekleri analiz etmek için teşekkür ederim. Bu eser Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, proje Biyogaz-parmak izi Nr. 22008313) tarafından Alman Federal Bakanlığı adına gıda ve Tarım (BMEL), merkezi yenilik programı için KOBİ'lerin (ZIM) federal bakanlık için finanse edildi ekonomik işler ve enerji (BMWi) (INAR ABO'lar, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, proje isteğe bağlı cep von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve Araştırma (BMBF) (FZK 03XP0041G) ve Program odaklı Helmholtz Derneği'nin finansman (POF III R31 konu 3 Biyoenerji).

<ol><li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445(2015).</li>
<li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173(2014).</li>
<li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://pubs.sciepub.com/jaem/5/1/2/">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li>
<li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li>
<li>Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities%3A+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li>
<li>Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification%2C+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180(2017).</li>
<li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li>
<li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains%2C+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li>
<li>Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li>
<li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/plankt/article/36/1/243/1519288">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li>
<li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462(2016).</li>
<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
<li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li>
<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
<li>Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).</li>
<li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://digital.csic.es/bitstream/10261/5293/1/planktonic.pdf">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li>
<li>Gasol, J. M., Morán, X. A. G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/8623_2015_139">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li>
<li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/2041-210X.12607">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li>
<li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li>
<li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li>
<li>Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprints%3A+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273(2014).</li>
<li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29265528">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li>
<li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization%3A+Flow+Cytometric+Fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li>
<li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26909672">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrobiyal nüfus ve toplulukların başarılı bir analizini iyi ayarlanmış cytometers, hücre parametreleri uygun bir seçim ve örnekleme ve fiksasyon ölçüm ve veri değerlendirme doğru güvenilir bir iş akışı gerektirir. Seçili hücre parametreler kullanılabilir uyarma dalgaboyu ile eşi gerekir. Biz kullanmak ve çok düşük konsantrasyonlarda hassas DAPI öneririz; Ama bir UV-hangi genellikle standart sitometresi set-up oluşur değil lazer, heyecanlı gerekiyor. Diğer boya, SYBR gibi yeşil ben, aynı zamanda leke bütün nüfus veya topluluklar ama genellikle düşük kaliteli çözümler sunmak. Balık yordamlar veya canlılık testleri mikrobiyal topluluklarda kullanma önerilmez. Bu yaklaşımlar ölçmek, doğrulamak ve toplumda bireysel türler üzerindeki etkileri belirsiz olduğundan denetlemek imkansız. Tipik topluluklar önemli bir kısmı hala saf bir kültür olarak kullanılabilir olduğu sürece onlar güvenilir, sınanamıyor.
Kritik adımlar protokolündeki hücre sıralama yanı sıra, örnekleme ve fiksasyon yordamlar içerir. Örnekleme eğilimi bazı saf kültürler ve flocs için toplamak veya örnek matris parçacıklar için uygun mikrobiyal topluluklar tarafından karmaşık. Bu toplamları dağılımı ve güvenilir sonuçlar güvence altına almak için akış sitometrik çözümlemesi için giriş önce ayrı bir hücreler için gereklidir. Sunulan hazırlık protokolleri tek hücre Analizi etkinleştirmek için optimize. Son 50 µm filtrasyon daha önce herhangi bir kalıntı toplamları kaldırmak ve hücre sıralayıcısı 70 µm meme ve akış küvet Çözümleyicisinin tıkanma dan engellemek için ölçüm gerçekleştirilir. Hücre flocs gelen Atıksu arıtma tesisleri özellikle bol, sağlam ve sisteminin işlevi için çok önemli. Biz planktonik araştırdık ve çamur oluşturulmuş protokol test etmek için bir tam ölçekli Atıksu arıtma tesisi farklı tankları mikrobiyal topluluklarda dayalı. Toplamları açıkça harcanmış hücre şekillendirme çamur ve topluluk kompozisyon sabit kalmıştır. Ayrıca, planktonik ve çamur tabanlı toplulukların aralarındaki tüm üç örneklenen tank (Şekil 8, ek dosya 1-S10) olağanüstü benzerlik sergiledi. Bu sonuçlar bir formaldehit ve etanol fiksasyonlu karşılaştırmalı 16S rDNA amplicon sıralama, bir taze-, bir formaldehit tedavi-, tarafından doğrulanmadı-ve sıralanmış örnek10. Yine de, olağanüstü güçlü biyofilmler veya sıkıca bağlı zincirler içinde büyüyen bakteriler gibi çevre örnekleri zorlu dağıtmak mümkün olabilir. Her yerde parçacıklar histogram içinde görünür ve hücreleri tarafından dik bereket karanlık gibi toprak örnekleri özellikle sorunlu olabilir. Bu gibi durumlarda, geleneksel sıralama yöntemleri uygulanması gereken.
Her yeni örnek kümesi fiksasyon istikrar sonucu geçerliliği garanti için deney tasarlamadan önce test edilmelidir. İyi fiksasyon istikrar da havuza alınan boyama ve birden çok örnek zaman puan ölçümü tek bir günde sağlar. Ayrıca çoğaltma ölçümleri ve geriye dönük olarak hücre belirleyici zaman noktaları sonuç ve denemenin son değerlendirme sonra sıralama sağlar. Saf kültür fiksasyon kararlılığını 28 gün içinde (Şekil 9) doğrulandı. Örnek taşıma dahil olmak üzere yerinde deneyler için fiksasyon istikrar (Bu durumda, aktif çamur topluluk için 60 gün Biyogaz toplum, ek dosya 1-S9 için 195 gün) daha uzun süre üzerinde test edilmelidir.
Boyama genellikle sorunlu değil ama bioinformatic değerlendirme araçları izin vermek için biyolojik bir standart ile kontrol gerekmektedir. Biz sahte zorlanma E. coli BL21 kullanılan (DE3), hangi ASC protokole göre saplantısı ve boyama her toplu olarak kullanılmak üzere depolanmış.
DAPI, SYBR yeşil dışında ben başarılı bir şekilde birkaç yıl14,23,24,25,26mikrobiyal topluluklar gidermek için uygulanmıştır. SYBR yüksek ve düşük nükleik asit alt kümeleri (HNA ve LNA) topluluklar çözmek yeşil bir online modus canlı hücrelerde kullanma. DAPI, DNA için onun bağlamada daha belirlidir ve 50'den fazla subcommunities bir örnek küme ayrım sağlar ancak boyama önce bir fiksasyon adım gerektirir.
Hücre sıralama bu yaklaşımın dikkat çekici bir özelliği ve bazı subcommunities daha fazla ilgi varsa uygulanabilir. Bu ne PFA-(sadece 30 dk yapılır) ne de etanol tedavi veya10 boyama DAPI sonraki 16S amplicon sıralama üzerinde olumsuz bir etkisi olduğunu vurguladı gerekiyor. Potansiyel fiksasyonu etkiler ve subcommunity metagenome ilgili yordamlar boyama analizleri hala test edilmesi gerekir.
Topluluk işlevlerine ve eğilim dinamikleri hakkında bilgi bir sürü bağımsız sıralama yaklaşım toplumun özellikleri sanal bir hücre hücre düzeyinde çözümlemek ve bu özellikleri ile abiyotik bağlanmak Biyoinformatik araçlarını içeren ne zaman elde edilebilir parametreleri.
Son zamanlarda, bir dizi yeni Biyoinformatik değerlendirme aracı, her iki SYBR için tüm yararlı yeşil ben ve DAPI yaklaşımlar, sitometrik topluluk desenleri gidermek için geliştirilmiştir. Bunlar FlowFP27, paketleri bu çalışmada (flowCHIC20, flowCyBar28), tatlı su topluluklar29 ile kurulan bir deconvolution model ve suşların kendi fizyolojik göre ayrımcılık için kullanılan bir araç kullanılan özellikleri30. Ayrıca, sitometrik çeşitlilik kararlı25 olabilir ve mikrobiyal topluluklar hatta istikrar özelliklerini şimdi bir çevrimiçi araç10ile takip edilebilir.
Böylece, akış sitometrik analizleri mikrobiyal topluluklar ve olası abiyotik parametre korelasyon hızlı değerlendirilmesi konusunda büyük bir avantaj var. Ancak, hala yöntemine sınırlamalar vardır. Gerçekten online flowCyBar aracıyla nedeniyle deneyimli tabanlı kapı ayarı yordam uygulanamaz. Ayrıca, özel yapım, kullanımı kolay akışı cytometers gelişimi büyük ölçüde akış sitometrik microbiome analiz yaklaşımı yayılması ilerlemek. Bu yönde ilk adım üstlenmiş28vardır.
Mikrobiyal akış sitometresi gelecekteki uygulamalar mikrobiyal ekoloji, bakteri üretimi kez aralığında yüksek frekans izleme sağlar ve ekolojik paradigmalar sitometrik veri5 tabidir gösterilmiştir gibi öngörülen ,10. İsviçre31yılında zorunlu içme suyu denetimleri gibi doğal ortamlarının rutin izlemek için çok yararlı bir yöntemdir. Bu da insan15 veya hayvan32 microbiome tarama gibi tıbbi uygulamalar için değerli bir araç olabilir. Buna ek olarak, biyoinformatik son gelişmeleri işlem denetimleri, yönetilen mikrobiyal sistemlerinin ayrılmaz bir sensör olmak mikrobiyal akış sitometresi sağlayabilir. Mikrobiyal topluluk sitometresi da belirli topluluk alt kümeleri genomik araştırmalar daha yüksek çözünürlük sağlayan hücre sıralama, bir tarama aracı sağlar.

Mikroorganizmaların insan birçok yönden canlı hayati bir rol oynamaktadır. Onlar gezegen karbon, azot, fosfor ve kükürt döngüsü1ve2,3 aşağılayıcı yanı sıra4 Biyokatalizörler Atıksu arıtma tesisleri gibi çeşitli sektörlerde sentezleme olarak hareket ana biyotik sürücüleri vardır 5 ya da biyoteknoloji6. Onlar bile insan sağlığı ve metabolizma7,8doğrudan etkileyen insan microbiome oluşturmaktadır. Bu nedenle, yapı, fonksiyon ve yakın çevreleri, yanıt olarak mikroorganizmaların dinamik davranış hakkında bilgi, amacımız tam olarak anlamak ve bu sistemlerin manipüle etmek gereklidir. Yeni nesil (NGS) sıralama microbiome yapısı ve fonksiyonu9çözmek için kurulan teknoloji değildir. Ancak, analiz ve değerlendirme NGS veri Niceliksel bilgileri verim değil ve hala pahalı, zaman alıcı ve hiçbir şekilde performans koridorları içinde yerinde sonuçlar sağlamak hazır. Bazı bakteri üretimi kez 1 h ve sürekli değişen toplum yapıları bazı ortamlar10neden aşağıdaki görüntüler. Böyle dynamics sıralama yaklaşımları kullanarak en bilimsel labs mali ve iş gücü kapasitesi aşabilir.
Buna ek olarak, akış sitometresi daha yüksek bir zaman, işgücü ve maliyet verimliliği koruyarak topluluk parmak NGS veri için benzer sağlar. Burada, akış sitometrik teknikleri mikrobiyal topluluk dinamikleri,-line tek hücre düzeyde uygulayabilmek için mevcut. NGS, aksine akış sitometresi filogenetik ilişki veya bilgi fonksiyonel genler sağlamaz ancak nicel hücre sayıları sunar. Akış Sitometresi kullanılarak, mikrobiyal toplulukları içine subcommunities farklı ışık saçılım ve floresan özellikleri (hücre boyutu ve parçalı yapı, sırasıyla ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) sağlamak) ile çözülebilir. Sunulan yaklaşım ağırlıklı olarak hücre boyutu - kullanır ve DNA belirli hücre tipleri ve fizyolojik (büyüme) Birleşik ilişkili ilgili bilgileri tutar. DNA içeriği UV telaşlı 4', A-T zengin DNA bölgelerine bağlanır ve hatta farklı kromozom düzeyleri çözümlemek için 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) boya kullanarak sayılabilir. DAPI floresans ve FSC birleştirerek 50'den fazla subcommunities seçkin ve zenginliği saat11üzerinde değiştirmek için izlenir. Subcommunity bereket varyasyonları pH ve ürün titreleri gibi12, genel parametrelerini, hava13,14gibi veya bağırsak ya da tükürük ile mikro çevre çevresinde değişikliklerle ilişkili olabilir bazı tıbbi tedaviler15ile microbiomes. Bu korelasyonlar anahtar subcommunities sorumlu tüm toplumun metabolik ağdaki belirli işlevleri için ortaya koyuyor. Anahtar subcommunities daha sonra özellikle terfi veya çevredeki mikro-ortamları değiştirerek bastırılır veya sonraki sıralama15 veya proteomik soruşturma için16sıralanmış.
Ancak, mikrobiyal toplum akış sitometresi henüz yaygın olarak oldukça düşük sayıda akış sitometrik aygıtları mikrobiyal nüfus veya topluluklar düzgün çözme yeteneğine sahip olması nedeniyle kurulmuş değildir. Ayrıca, deneyim, topluluk analiz boru hatları ve etkili veri değerlendirme eksikliği microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için bir giriş bariyeri oluşturabilecek. Biz bu sorunları çözmek için kapsamlı iş akışları kurduk. Onların genel uygulanabilirliği göstermek için biz onları üç örnek örnek setlerinde (ek dosya 1-S1), yani ben sunacak) tanımlanmış net Orta (Pseudomonas putida KT 2440 üzerinde yetiştirilen biyoteknolojik uygulamaları için saf Kültür (PC) glikoz), II) net Orta (aktif çamur topluluğa (ASC) sentetik Atıksu) ve III karmaşık laboratuvar toplumda) yoğun matris (Biyogaz topluluğa (M.Ö.) Mısır Silaj) doğal ortamlarda karmaşık bir topluluktan.
Çeşitli faktörler her bu örnek kümeleri için protokol seçimi etkiler. Derin dondurucu zehirli kimyasalların kullanımı forgoes ama çoğunlukla kullanılması dolayısıyla laboratuvar ortamlarına şok buzlanma için sıvı azot sınırlıdır. Formaldehit istikrar ve sonraki etanol fiksasyon toplu örnekleme aliquot hazırlık için gerek kalmadan sağlar ve uzun sürelerle kararlı olduğu ispatlanmıştır. Ancak, protein flocs, denaturized formaldehit tarafından olumsuz sinyal-gürültü oranı neden olabilir çünkü insan tükürük15 gibi protein açısından zengin örnekleri sorunlu olabilir. Örnek kurutma yordamlar en zaman (yaklaşık toplam 1 h) Bu karşılaştırmada alacak ama sitesinde toksik kimyasallar olmadan yapılabilir. Soğutma veya ek tehlike önlemler kolayca gönderilebilir tüpler istikrarlı granül verimleri. Buna ek olarak, alternatif fiksasyon yöntemleri bol önerilen11olmuştur. Güçlü yeni örnek kümesi sokarken farklı protokolleri çözünürlük ve fiksasyon kararlılığını test etmek için tavsiye ederiz.
Biz iki farklı akış cytometers kümeleri olarak çözümlemeye: i) bir son derece karmaşık ve pahalı, araştırma hücre sıralayıcısı ve yerinde uygulama5için daha uygun görünen II) bir uygulama odaklı tezgah üst analizörü merkezli. PC ve ASC hücre sıralayıcısı ile ölçüldü iken M.Ö tezgah üst analyzer ile ölçüldü. Üç örnek örnek analizi en iyi duruma getirilmiş tekrarlanabilirlik, örnek istikrar ve iş akışı kolaylık sağlamak için gerekli farklı yordamlar ayarlar. Aşağıdaki protokol için üç farklı sistem bölümleri belirtir.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q sistemi Sentez A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltrasyon Kartuşu</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Eski hücre sıralayıcı</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (ABD)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, Kaliforniya, ABD</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı tüpler R928 ve R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 yazılımı</td><td>Beckman-Coulter, Brea, Kaliforniya (ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 & mikro; m&nbsp; FluoSpheres</td><td>Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)</td> <td>F8815</td><td>350/440 mavi floresan</td></tr><tr><td>2 & mu; m YG FluoSpheres</td><td>Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)</td> <td>F-8827</td><td>505/515 sarı-yeşil floresan boncuklar&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 ve mu; m Floresbrit BB Karboksilat mikroküreler</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (ABD)</td> <td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 & mu; m Floresbrit BB Karboksilat mikroküreler</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (ABD)</td> <td>17458</td><td>360/407 mavi floresan</td></tr><tr><td>1 ve mikro; mYG FluoSpheres</td><td>Moleküler Problar, Eugene, Oregon (ABD)</td> <td>F-13081</td><td>505/515 sarı-yeşil floresan boncuklar&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japonya)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UV Laser Genesis CX,</td> <td>Coherent, Inc, Santa Clara (ABD)</td><td></td> <td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 serisi PMT'ler</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonya)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FloMax yazılımı</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tüm optik filtreler</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (ABD)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (ABD)</td><td></td><td>Yapı numarası: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><<td>a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karakteristik microbiome dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Saf kültürler incelenmesi ve mikrobiyal topluluk dinamiklerini izleme doğal ekosistemler ve teknik uygulamaları mikroorganizmalar tarafından tahrik anlama ve denetleme için çok önemlidir. Yeni nesil sıralama yöntemleri yaygın olarak microbiomes gidermek için kullanılmaktadır, ancak genellikle kaynak ve zaman yoğun ve çoğunlukla nitel bilgi sunmak. Akış sitometrik microbiome analiz bu dezavantajları zarar vermez ve göreli subcommunity zenginliği ve mutlak sağlayabilir hücre, satır numaraları. Her ne kadar doğrudan filogenetik bilgi teslim etmez, analiz derinliği ve çözünürlük yaklaşımlar sıralama, geliştirebilirsiniz. Araştırma ve rutin ayarları tıbbi uygulamalar keskin aksine, akış sitometresi microbiome analiz için hala yaygın olarak kullanılır. Örnek hazırlama ve veri analiz boru hatları üzerinde eksik bilgileri bir giriş engeli sık ders kitabı akış sitometresi uygulamaları olurdu microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için oluşturabilir. Burada, biz üç kapsamlı iş akışları saf kültürler için mevcut, karmaşık topluluklarda zorlu matrisler, orta ve karmaşık topluluklarda sırasıyla temizleyin. Biz bireysel örnekleme ve fiksasyon yordamlar açıklar ve ilgili örnek kümeleri için protokolleri boyama en iyi duruma getirilmiş. Biz merkezli karmaşık bir araştırma ile sitometrik Analizi ve bir uygulama odaklı tezgah üst aygıt ayrıntılı yordam sıralama hücre tanımlamak ve veri analiz paketleri öneririz. Ayrıca önemli deneysel kontrolleri teklif ve sunulan iş akışları ilgili örnek kümeleri için geçerlidir.

Aşağıdaki temsilcisi sonuçlar çoğaltır gerekliliğini vurgulamak ve farklı veri görselleştirme ve analiz teknikleri her biri bu üç örnek Grup örnekler. Olası veri değerlendirme boru hatları sonuçlarını ilgili kümesi hakkında standart araştırma soruları yanıtlayan için uygun gösteriyorlar. Ancak, sunulan teknikleri ile sunulan örnek ayarlamak için özel değildir. Akış Sitometresi ham veri FlowRepository kimliği FR-FCM-ZY46 ile herkesin hazır hale getirilmiştir. Daha önce yüklenen ASC veri kimliği FR-FCM-ZYD7 altında kullanılabilir.
Biyolojik ve teknik çoğaltır alınan, kurumlara ve yayımlanmış protokolleri11göre analiz. PC ve ASC biyolojik çoğaltır üç paralel şişeler alınmıştır. Biyolojik çoğaltır, MÖ bir pilot ölçek bitki bir yerde üç sonraki örnekleme olarak alınmıştır. Üç aliquots bir örnek sabit, lekeli ve teknik tekrarlanabilirlik emin olmak için analiz. Yöntemleri tekrarlanabilirlik daha önce yayımlanmış yordamlar11göre değerlendirildi. Bir kapı şablonu bir örnek kümesi (ek dosya 1-S6) tüm örnekleri için kapı başına standart sapma (%) hesaplamak için kullanıldı.
Ortalama standart sapma %2.13 (Şekil 1) iken PC için göreli bereket maksimum standart sapması %3.44, oldu. Ortalamalar, standart sapmalar ve %2.13 %0,21 (ek dosya 1-S8) ASC ve BC için göreli zenginliği maksimum standart sapmalar %1,27 ve %0,88, bulunmuştur.
Standart bir prosedür, saf suşu kültür, soruşturma zaman lag faz, üretimi süreleri ve hücre yoğunluğu belirli koşullar altında analiz etmek için bir büyüme eğrisi hazırlıktır. Bu yordamı ile akış sitometrik analiz iş akışı sistemi (Şekil 2) daha derin bir anlayış elde etmek için birlikte. FSC vs DAPI floresans araziler toplu iş kültürünün farklı noktalarda kültür hücre döngüsü durumları ortaya koyuyor. Ana kapısı şablonu (ek dosya 1-S6) bir (c1n), hücre oranı ölçmek için kurulan iki (c2n) ve birden fazla kromozom (cXn, Şekil 2B<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank"></a>

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Bu yöntem, mikrobiyal ekoloji ve biyoteknolojideki, örneğin herhangi bir ekosistemi hangi ekolojik kavramların yönlendirdiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kısa aralıklı örnekleme rejimi ile takip edilen hızlı mikrobiyom dinamiklerini kapatmak için kullanılabilirken, yüksek maliyet etkin kalmasıdır. Bu yöntem, biyoteknolojik ve doğal mikrobiyal topluluklar hakkında bilgi almak için ve ayrıca beslenme ve sağlık durumları için hayvan ve insan mikrobiyomları hakkında bilgi almak için kullanılabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdaki teknisyen ve SediMeter operatörü Florian Schattenberg olacaktır. Bir biyogaz topluluk örneğini kurutmak için, 200 mikrolitre viskoz digestatı 1,7 mililitre PBS içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarmak için modifiye edilmiş bir mililitre pipet ucu kullanın. İyice karıştırdıktan sonra, büyük hücre agregatlarını dağıtmak ve bitki hücresi kalıntılarına yapışan hücreleri bağlamak için tüpleri bir dakika boyunca ultrasonik bir banyoya yerleştirin.Sonikasyondan sonra, numuneyi iyice karıştırın ve hücreleri 50 mikrometre gözenekli örgü süzgecinden 2 mililitrelik bir plastik tüpe süzün. Süzüntüyü dört adet 400. mikrolitrelik alikota bölün ve alikotları iki kez santrifüjleyin, mikrop örneğini mümkün olduğunca iyice mekanik olarak susuzlaştırmak için süpernatanı her iki seferde de tamamen atın. Ardından, stabil bir pelet oluşturmak için numuneyi ısıtılmış bir vakum santrifüjünde kurutun ve peleti ışıktan korunarak dört santigrat derecede saklayın.Aktif çamur numunelerinin stabilizasyonu ve fiksasyonu için, hücrelerin dört mililitresini santrifüjleyin ve peleti PBS'de dört mililitre yüzde iki formaldehit içinde yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, stabilize hücre örneğini santrifüjleyin ve peleti eksi 20 santigrat derece saklama için dört mililitre% 70 etanol içinde sabitleyin. Sabit hücre süspansiyonunun 0.6 mililitresini 1.4 mililitre PBS içeren bir cam tüpe karıştırın ve aktarın ve iyice karıştırdıktan sonra, gösterildiği gibi 10 dakika boyunca sonikat yapın.Sonikasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti iki mililitre taze PBS'de yeniden askıya alın. İyice karıştırdıktan sonra, hücreleri beş dakika boyunca gösterildiği gibi sonikasyon yapın ve OD 700 nanometreyi taze PBS ile 035'e ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, oda sıcaklığında 20 dakikalık inkübasyon için 0.11 molar sitrik asit ve 4.1 milimolar ara 20 içeren bir mililitre permeabablizasyon tamponunda iyice karıştırarak yeniden süspanse edin.Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, oda sıcaklığında en az 60 dakikalık inkübasyonda, ışıktan korunarak 0.68 mikromolar DAPI içeren iki mililitre boyama solüsyonunda iyice yeniden süspanse edin. Boncuk kalibrasyonu için, doğrusal kalibrasyon için boncuk karışımını akış sitometresine yükleyin ve cihazı doğrusal aralıkta önceden kalibre etmek için nozul ve lazer optik konumlarını manipüle ederken boncukları sürekli olarak ölçün. Boncuk tepe noktaları önceden ayarlanmış bir kalibrasyon şablonuna sığdırılabildiğinde, günlük moduna geçin ve bir logaritmik kalibrasyon boncuk numunesi yükleyin.Cihazın donanımına ince ayar yapmak için logaritmik boncuk tepe noktalarını önceden ayarlanmış kalibrasyon şablonlarına sığdırın ve boncuk konumunda gerekli son ayarlamaları yapmak için fotoçoğaltıcı tüp kazanç ayarını kullanın Bu prosedürün en kritik yönü, deneyler arasında karşılaştırılabilirliğe izin vermek için tutarlı ölçümler sağlamaktır. Bu nedenle, günlük sitometre kalibrasyonu ve biyolojik güdük kapaklarında boncuk kullanımı, yavaş sitromik mikrobiyom diyalizinin başarısı için hayati önem taşır. Hücreler hazır olduğunda, numuneleri karıştırın ve süzün ve logaritmik boncuk karışımını hücrelere ekleyin.Şimdi numuneyi karıştırın ve sitometreye yükleyin ve lekeli hücreleri dahil etmek ve gürültüyü ve boncukları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ardından, hücre kapısı içinde 250.000 hücre tespit edilene kadar numune setini saniyede maksimum 3.000 olay hızında art arda analiz edin. Akış sitometrisi verilerini analiz etmek için, tüm numunelerde kullanılmak üzere bir ana kapı şablonu geliştirin.Akış sitometrisi standart dosyalarını uygun bir akış sitometrisi analiz programına yükleyerek başlayın ve numuneleri art arda işleyin. Örnekleri yükleyin, bir ölçüme çift tıklayın ve ilgili açılır menülerden X ve Y ekseni parametrelerini seçerek DAPI'ye karşı ileri saçılma floresan grafiğini açın. Boncukları ve gürültüyü dışlamak için önceden oluşturulmuş ölçüm hücresi kapısını yeniden oluşturmak için çokgen çizim aracını kullanın ve kapıyı buna göre adlandırın.Hücre kapısı girişini tüm örnekler grup listesine sürükleyin ve yalnızca hücre olaylarını seçici olarak görüntülemek için hücre geçidini çift tıklatın. Eliptik kapı aracıyla bir örnekte yaygın olan alt toplulukları tanımlayın ve bunları bir havuzda toplayın. Ardından, ana geçit şablonu tüm örneklere uyana kadar ek alt topluluk ayırmaları ve sonraki örnekler ekleyin.Birbirine yakın kümelenen alt toplulukları çözmek için ana kapının şablonunu yan saçılma tarama yöntemiyle kontrol edin. Ardından, tüm alt toplulukları tablo düzenleyicisine ekleyin ve çıktı istatistiğini üst öğe sıklığı olarak ayarlayın. Göreli alt topluluk bolluklarını uygun bir elektronik tablo yazılımına aktarmak için tablo düzenleyiciyi kullanın ve veri biçimlendirmesini kenar çubuğu kılavuzundaki yönergelere göre uyarlayın.Ardından, alt topluluk dinamiklerini ve bağıntılarını görselleştirmek için R paketini yükleyip yükleyin ve txt dosyasını yükleyip normalleştirin. DAPI floresan grafiklerine karşı ileri saçılma, bir parti kültüründeki farklı noktalarda saf gerinim kültürlerinin hücre döngüsü durumlarını ortaya çıkarır. Bir ana geçit şablonunun kullanılması daha sonra bir, iki veya çoklu kromozomlu hücrelerin oranının ölçülmesine izin verir, bu da örneğin bu temsili mikrobun kromozomlarını üretim süresinden daha hızlı kopyalama yeteneğini ortaya çıkarır.Zaman içinde karmaşık mikrobiyal toplulukları araştırırken, topluluk değişiminin hızı ve önemi bir nokta grafiği dizisiyle kolayca görselleştirilebilir. Deneyin farklı aşamalarındaki baskın alt topluluklar, sitometrik barkod aracı kullanılarak açıkça tanımlanabilir. Bu verilerin göreceli alt topluluk bolluklarının frekans dağılımı ile birleştirilmesi, kilit zaman noktalarında önemli bolluk değişikliklerini gösteren kapıların seçimine izin verir.Bu verilerin metrik olmayan çok boyutlu bir ölçeklendirme grafiğinde görselleştirilmesi, topluluk dinamiklerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Biyogaz toplulukları, ajitasyon sınırlamaları nedeniyle potansiyel olarak mekansal heterojenliklerle karşı karşıya kalabilir. Örnek biyogaz topluluğu örnek noktaları çok az mekansal, ancak belirgin zamansal heterojenlik sergiler.Ürün sıkılaştırıcılar gibi abiyotik parametrelerle güçlü pozitif veya negatif korelasyonlar, ekosistemlerin ve biyoteknolojik süreçlerin anlaşılmasına ve optimize edilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, daha sonraki sıralama ve analiz için özel ilgi kapılarının tanımlanmasını kolaylaştırırlar. Bu prosedür oluşturulurken, her yeni numune seti için performanslarını ve stabilitelerini değerlendirmek için farklı fiksasyon ve boyama prosedürlerinin değerlendirilmesi tavsiye edilir.Sıralamadan sonra, metabolik yolakların aktivite durumları hakkında proto genetik bağlantı hakkında bilgi veren en iyi toplulukları seçmek için ampliconsic fencing, metagenomik ve proteomik gibi daha ileri yaklaşımlar uygulanabilir. Bu yöntem, mikrobiyal ekolojistlerin ve biyoproses mühendislerinin mikrobiyom dinamiklerini, doğal ve kontrollü ekosistemleri makul bir kaynak yatırımı ile takip etmelerinin yolunu açtı.

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Bu protokol, fotoototrofik şeker salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mayalar dahil olmak üzere ko-kültürlerin kurulumu ve kantitatif izlenmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Bozulmamış ağaç floemini korumak ve gözlem için hazırlamak için bir teknik sağlıyoruz.  Eklembacaklıların, mikropların ve floem dokularında yaşayan diğer organizmaların tanıtılmasına ve gözlemlenmesine izin veren floem sandviç adı verilen bir aparat oluşturuyoruz.

Ağaç Dokuların içinde eklembacaklı ve Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi için Tekniği

Yabani hayvanlar genellikle çok çeşitli helmintler tarafından parazitlenir. Dört ana helmint türü "yuvarlak kurtlar" (nematodlar), "dikenli başlı solucanlar" (akantosefalanlar), "parazitler" (trematodlar) ve "tenyalar" (sestodlar). Burada helmintlerin omurgalı bir hayvandan nasıl toplandığını ve nasıl korunduğunu ve taksonomik olarak nasıl tanımlandığını açıklıyoruz.

Yaban Hayatından Helmint Toplama ve Tanımlama

Öğrenin, akış sitometresi ile mikrobiyal topluluk dinamiklerini analiz etmeyi. Bu yöntem, saf kültürler ve doğal ekosistemlerde hızlı, maliyet etkin izleme sağlar.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Daha fazla video keşfet