Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Bu yöntem, mikrobiyal ekoloji ve biyoteknolojideki, örneğin herhangi bir ekosistemi hangi ekolojik kavramların yönlendirdiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kısa aralıklı örnekleme rejimi ile takip edilen hızlı mikrobiyom dinamiklerini kapatmak için kullanılabilirken, yüksek maliyet etkin kalmasıdır. Bu yöntem, biyoteknolojik ve doğal mikrobiyal topluluklar hakkında bilgi almak için ve ayrıca beslenme ve sağlık durumları için hayvan ve insan mikrobiyomları hakkında bilgi almak için kullanılabilir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdaki teknisyen ve SediMeter operatörü Florian Schattenberg olacaktır. Bir biyogaz topluluk örneğini kurutmak için, 200 mikrolitre viskoz digestatı 1,7 mililitre PBS içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarmak için modifiye edilmiş bir mililitre pipet ucu kullanın. İyice karıştırdıktan sonra, büyük hücre agregatlarını dağıtmak ve bitki hücresi kalıntılarına yapışan hücreleri bağlamak için tüpleri bir dakika boyunca ultrasonik bir banyoya yerleştirin.

Sonikasyondan sonra, numuneyi iyice karıştırın ve hücreleri 50 mikrometre gözenekli örgü süzgecinden 2 mililitrelik bir plastik tüpe süzün. Süzüntüyü dört adet 400. mikrolitrelik alikota bölün ve alikotları iki kez santrifüjleyin, mikrop örneğini mümkün olduğunca iyice mekanik olarak susuzlaştırmak için süpernatanı her iki seferde de tamamen atın. Ardından, stabil bir pelet oluşturmak için numuneyi ısıtılmış bir vakum santrifüjünde kurutun ve peleti ışıktan korunarak dört santigrat derecede saklayın.

Aktif çamur numunelerinin stabilizasyonu ve fiksasyonu için, hücrelerin dört mililitresini santrifüjleyin ve peleti PBS'de dört mililitre yüzde iki formaldehit içinde yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, stabilize hücre örneğini santrifüjleyin ve peleti eksi 20 santigrat derece saklama için dört mililitre% 70 etanol içinde sabitleyin. Sabit hücre süspansiyonunun 0.6 mililitresini 1.4 mililitre PBS içeren bir cam tüpe karıştırın ve aktarın ve iyice karıştırdıktan sonra, gösterildiği gibi 10 dakika boyunca sonikat yapın.

Sonikasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti iki mililitre taze PBS'de yeniden askıya alın. İyice karıştırdıktan sonra, hücreleri beş dakika boyunca gösterildiği gibi sonikasyon yapın ve OD 700 nanometreyi taze PBS ile 035'e ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, oda sıcaklığında 20 dakikalık inkübasyon için 0.11 molar sitrik asit ve 4.1 milimolar ara 20 içeren bir mililitre permeabablizasyon tamponunda iyice karıştırarak yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, oda sıcaklığında en az 60 dakikalık inkübasyonda, ışıktan korunarak 0.68 mikromolar DAPI içeren iki mililitre boyama solüsyonunda iyice yeniden süspanse edin. Boncuk kalibrasyonu için, doğrusal kalibrasyon için boncuk karışımını akış sitometresine yükleyin ve cihazı doğrusal aralıkta önceden kalibre etmek için nozul ve lazer optik konumlarını manipüle ederken boncukları sürekli olarak ölçün. Boncuk tepe noktaları önceden ayarlanmış bir kalibrasyon şablonuna sığdırılabildiğinde, günlük moduna geçin ve bir logaritmik kalibrasyon boncuk numunesi yükleyin.

Cihazın donanımına ince ayar yapmak için logaritmik boncuk tepe noktalarını önceden ayarlanmış kalibrasyon şablonlarına sığdırın ve boncuk konumunda gerekli son ayarlamaları yapmak için fotoçoğaltıcı tüp kazanç ayarını kullanın Bu prosedürün en kritik yönü, deneyler arasında karşılaştırılabilirliğe izin vermek için tutarlı ölçümler sağlamaktır. Bu nedenle, günlük sitometre kalibrasyonu ve biyolojik güdük kapaklarında boncuk kullanımı, yavaş sitromik mikrobiyom diyalizinin başarısı için hayati önem taşır. Hücreler hazır olduğunda, numuneleri karıştırın ve süzün ve logaritmik boncuk karışımını hücrelere ekleyin.

Şimdi numuneyi karıştırın ve sitometreye yükleyin ve lekeli hücreleri dahil etmek ve gürültüyü ve boncukları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ardından, hücre kapısı içinde 250.000 hücre tespit edilene kadar numune setini saniyede maksimum 3.000 olay hızında art arda analiz edin. Akış sitometrisi verilerini analiz etmek için, tüm numunelerde kullanılmak üzere bir ana kapı şablonu geliştirin.

Akış sitometrisi standart dosyalarını uygun bir akış sitometrisi analiz programına yükleyerek başlayın ve numuneleri art arda işleyin. Örnekleri yükleyin, bir ölçüme çift tıklayın ve ilgili açılır menülerden X ve Y ekseni parametrelerini seçerek DAPI'ye karşı ileri saçılma floresan grafiğini açın. Boncukları ve gürültüyü dışlamak için önceden oluşturulmuş ölçüm hücresi kapısını yeniden oluşturmak için çokgen çizim aracını kullanın ve kapıyı buna göre adlandırın.

Hücre kapısı girişini tüm örnekler grup listesine sürükleyin ve yalnızca hücre olaylarını seçici olarak görüntülemek için hücre geçidini çift tıklatın. Eliptik kapı aracıyla bir örnekte yaygın olan alt toplulukları tanımlayın ve bunları bir havuzda toplayın. Ardından, ana geçit şablonu tüm örneklere uyana kadar ek alt topluluk ayırmaları ve sonraki örnekler ekleyin.

Birbirine yakın kümelenen alt toplulukları çözmek için ana kapının şablonunu yan saçılma tarama yöntemiyle kontrol edin. Ardından, tüm alt toplulukları tablo düzenleyicisine ekleyin ve çıktı istatistiğini üst öğe sıklığı olarak ayarlayın. Göreli alt topluluk bolluklarını uygun bir elektronik tablo yazılımına aktarmak için tablo düzenleyiciyi kullanın ve veri biçimlendirmesini kenar çubuğu kılavuzundaki yönergelere göre uyarlayın.

Ardından, alt topluluk dinamiklerini ve bağıntılarını görselleştirmek için R paketini yükleyip yükleyin ve txt dosyasını yükleyip normalleştirin. DAPI floresan grafiklerine karşı ileri saçılma, bir parti kültüründeki farklı noktalarda saf gerinim kültürlerinin hücre döngüsü durumlarını ortaya çıkarır. Bir ana geçit şablonunun kullanılması daha sonra bir, iki veya çoklu kromozomlu hücrelerin oranının ölçülmesine izin verir, bu da örneğin bu temsili mikrobun kromozomlarını üretim süresinden daha hızlı kopyalama yeteneğini ortaya çıkarır.

Zaman içinde karmaşık mikrobiyal toplulukları araştırırken, topluluk değişiminin hızı ve önemi bir nokta grafiği dizisiyle kolayca görselleştirilebilir. Deneyin farklı aşamalarındaki baskın alt topluluklar, sitometrik barkod aracı kullanılarak açıkça tanımlanabilir. Bu verilerin göreceli alt topluluk bolluklarının frekans dağılımı ile birleştirilmesi, kilit zaman noktalarında önemli bolluk değişikliklerini gösteren kapıların seçimine izin verir.

Bu verilerin metrik olmayan çok boyutlu bir ölçeklendirme grafiğinde görselleştirilmesi, topluluk dinamiklerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Biyogaz toplulukları, ajitasyon sınırlamaları nedeniyle potansiyel olarak mekansal heterojenliklerle karşı karşıya kalabilir. Örnek biyogaz topluluğu örnek noktaları çok az mekansal, ancak belirgin zamansal heterojenlik sergiler.

Ürün sıkılaştırıcılar gibi abiyotik parametrelerle güçlü pozitif veya negatif korelasyonlar, ekosistemlerin ve biyoteknolojik süreçlerin anlaşılmasına ve optimize edilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, daha sonraki sıralama ve analiz için özel ilgi kapılarının tanımlanmasını kolaylaştırırlar. Bu prosedür oluşturulurken, her yeni numune seti için performanslarını ve stabilitelerini değerlendirmek için farklı fiksasyon ve boyama prosedürlerinin değerlendirilmesi tavsiye edilir.

Sıralamadan sonra, metabolik yolakların aktivite durumları hakkında proto genetik bağlantı hakkında bilgi veren en iyi toplulukları seçmek için ampliconsic fencing, metagenomik ve proteomik gibi daha ileri yaklaşımlar uygulanabilir. Bu yöntem, mikrobiyal ekolojistlerin ve biyoproses mühendislerinin mikrobiyom dinamiklerini, doğal ve kontrollü ekosistemleri makul bir kaynak yatırımı ile takip etmelerinin yolunu açtı.