Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Bu yöntem, birden fazla insan sinir hücresi tipi arasındaki hücreler arası iletişimin sinaptik devre oluşumuna ve işlevine nasıl katkıda bulunduğuna ilişkin sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, hızlı ve sistematik bir şekilde, insan pluripotent kök hücrelerinden işlevsel olarak olgunlaşmış astrositlerin ve nöronların üç boyutlu kokültür kürelerini üretir. Bunlar titiz deneysel araştırmalar için kullanılabilir.

Bu protokolün tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği, ortaya çıkan organoid teknolojilerine tanımlanmış bir alternatiftir. Bunlar, yaralanma veya hastalıktan sonra nörorejenerasyonu teşvik etmek için yeni ilaç geliştirme ve hücresel aşılama tedavisi için umut vaat etmektedir. Rho-kinaz inhibitörü Y-27632 içeren iki mililitre HPSC ortamındaki HPSC kümelerini ECM kaplı altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna oturtarak başlayın.

Kök hücreleri yaklaşık% 50 birleşene kadar koruyun, daha sonra nöral indüksiyonu teşvik etmek için ortamı SB431542 ve DMH1 içeren nöral ortama değiştirin. Hücreler yaklaşık% 95 birleştiğinde, her bir kuyucuğu birden altıya kadar yeni ECM kaplı oyuklara bölün. 14. günde, hücreleri ayırma çözeltisi ile ayırın ve agrega oluşumunu teşvik etmek için her bir oyuğun içeriğini, Y-27632 içeren ortam ile kaplanmamış bir T25 şişesine aktarın.

Kendiliğinden oluşan 3D agregalarda astrosit progenitörleri ve astrositler oluşturmak için, EGF ve FGF2 içeren nöral ortama geçin ve astrosit kimliği dört ila altı ayda doğrulanana kadar her üç ila dört günde bir besleyin. Varsayılan olarak, bu protokol dorsal kortikal astrositler üretir. Bununla birlikte, astrosit alt tipleri, istenirse, desen morfojenlerinin eklenmesiyle bölgesel olarak belirlenebilir.

Haftada bir kez, karanlık merkezler ortaya çıktığında, küreleri santrifüjleme ile toplayın, ardından H-astro agregalarını ayırma çözeltisi ile nazikçe ayırın. CNS olmayan ve nöral olmayan hücrelerin geçmesini önlemek için sadece kendiliğinden bağlanmayan küreleri yeniden plakalayın. Dört ila altı aylık genişlemeden sonra, üreticinin talimatlarına göre dondurma ve kriyo koruma ortamında hücre kimliğini doğrulayın veya deney için hemen kullanın.

Nöronlarda veya H-nöronlarında transgenik olmayan nöronal progenitörlerin üretilmesi için, day-14 HPSC'den türetilmiş nöral progenitörleri, iki mililitre nöral ortam ve oyuk başına Y-27632 içeren ECM kaplı altı oyuklu plakalara tohumlayın. Doksisiklin ile indüklenebilen iNeuronlarla çalışıyorsanız, farklılaşmayı indüklemek ve gen ekspresyonunu aktive etmek için hücreler yaklaşık% 35 birleştiğinde doksisiklin içeren nöral ortam ekleyin. İki gün sonra, transgenik ve transgenik olmayan hatları günde bir kuyu başına iki mililitre nöral medya ile besleyin.

Hücreler% 70 birleşme hızında kalkmaya hazır olana kadar devam edin. Kokültürler için, önce H-astros'u 3D agregalardan ayırma çözeltisi ile nazikçe ayırın. Ardından, H-nöronlarını veya iNeuron'ları 2B tek katmandan ayırmaya devam edin.

İlk olarak, ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın ve tek katmanlı kültürler içeren her bir oyuğa 500 mikrolitre ayırma çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bağlı hücreleri çıkarmak için yavaşça iki ila üç mililitre DMEM-F12 ortamı ekleyin.

Daha sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte ortamda toplayın ve bir dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, bir mililitre taze ortam ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 1.000 mikrolitrelik bir mikro pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak her hücre tipini sayın.

İstenilen ayrışmış H-astros ve H-nöronlarının veya iNeuron'ların oranını, bir mikroplakanın her bir oyuğuna toplam iki mililitre hacimde ekleyin. Plakayı üç dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin ve iki gün boyunca inkübatöre geri dönün. Bir gün sonra, plakada yoğun şekilde paketlenmiş mikro küreler oluşmuş olmalıdır.

Mikro kuyucuklardan küreleri nazikçe çıkarmak için 1.000 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanın. Yapışmış ek küreleri çıkarmak için orta dereceli mikro kuyucukların dibine hafifçe kuvvet uygulayın. Tüm küreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte topladıktan sonra yerleşmesine izin verin.

Ardından, önce eski ortamı aspire ederek ve ardından en az iki mililitre taze ortam ekleyerek küreleri yıkayın. Küreleri 50 ila 60 mililitre ortam içeren bir eğirme şişesine ekleyin. Şişeyi inkübatöre 60 RPM'ye ayarlanmış manyetik bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin.

Sinaps oluşumu için kültürde en az üç hafta gereklidir. Yüzeyi hidrofilik hale getirmek için her bir çoklu elektrot dizisinin veya MEA'nın yüzeyini bir mililitre poliornitin ile kaplayarak başlayın ve en az dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından poliornitini çıkarın ve her bir MEA'nın yüzeyini deiyonize su ile yıkayın.

Daha sonra bir mililitre hücre dışı matris ekleyin ve en az dört saat boyunca inkübatöre geri dönün. Hazır olduğunda, hücre dışı matrisi çıkarın, ardından küreleri 1,5 mililitre ortamda MEA yüzeyine uygulayın ve kürelerin elektrot dizisinin üzerine yerleştirildiğinden emin olun. İki gün yapışmasına izin verin.

Nöral kürelerin elektriksel aktivitesini ölçmek için, MEA'yı sıcaklık kontrollü bir kafa aşamasına yerleştirin. Spontan elektriksel aktiviteyi kaydetmek için beş Hertz'lik bir yüksek geçiren filtre ve 200 Hertz'lik bir alçak geçiren filtre ve standart sapmanın beş katı bir ani yükselme eşiği kullanın. İstatistiksel analiz için ani yükselme frekansı ve genlik dahil olmak üzere ham verileri kaydedin.

Nöronlar için MAP2 ve astrositler için GFAP gibi nöral hücre tipi kısıtlı protein belirteçleri, 3D küreler içindeki nöronlardaki astrositlerin eşit dağılmış düzenini ve olgunluğunu görsel olarak gösterir. Astrosit morfolojisi ve dallanmasının maksimum izdüşümü, zara bağlı GFP ile seyrek olarak etiketlenmiş H-astros ile temsili bir 3B kürede gösterilir. Olgun H-astros, GFAP dahil olmak üzere belirteçleri ifade eder.

iNeuronlar, soldaki resimde gösterildiği gibi pre ve postsinaptik proteinleri eksprese etse de, sinaptik yoğunluk, H-astros ve kokültürün varlığı ile önemli ölçüde artar. Kayıtlar sırasında, MEA'lara yerleştirilen sağlıklı iNeuron küreleri, tutarlı ateşleme frekansları ile kendiliğinden 40 mikrovolttan daha büyük voltaj yükselmeleri ortaya çıkaracaktır. Kokültür küreleri, H-astroların varlığıyla daha fazla ağ bağlantısı gösterir ve bu da senkron ağ ani patlamalarının artmasına neden olur.

Bu prosedürü takiben, astrositlerin sinaptik aktiviteye fizyolojik tepkisini ölçmek için kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler de yapılabilir. Ek olarak, önceden var olan sinaptik devrelerle bağlantıyı araştırmak için hayvan modellerine transplantasyon yapılabilir. Bu biyomühendislik yaklaşımını izleyerek, beyinde meydana gelen karmaşık sinyallemeyi modellemek için hücre dışı biyomalzemeler ve oligodendrositler, mikroglian ve etelyal hücreler gibi ek hücre tipleri belirli oranlarda dahil edilebilir.