Name: Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel olgun astrosit ve nöronların 3D kokültür kürelerini nasıl üreteceğinizi. Bu yöntem, sinaptik devre aktivitesini incelemek ve nörorejenerasyon araştırmaları için ölçeklenebilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Erik Ullianlıların (UCSF) tasarımı iNeuron farklılaşması üzerine teknik danışmanlık için Dr Michael Ward (NIH) ve Saba Barlas ön görüntü analizi için bu yordamları, entelektüel girişi için teşekkür etmek istiyorum.

1. hücre kültür ve reaktif hazırlık
Not: Bu bölümde Protokoller'de farklılaşma Protokolü (Bölüm 2) göründükleri sırayla yazılır. Malzeme ve Katalog numaraları Tablo reçetesi görmek.
<ol><li>
Kaplamalı plakalar hücre kültürü için hazırlayın.
	<ol>
<li>Hücre dışı matriks (ECM) kaplama çözüm 1 mg/mL stok çözüm hazırlamak için DMEM/F12 medya ile sulandırmak. Aliquot seyreltilmiş ECM çözümü 3 mL 30 konik tüpler içine stok ve hemen saklamak-20 ° c ' Çalışan bir çözüm için ECM stokunun 3 mL 33 mL 80 µg/mL bir konsantrasyon için 36 mL toplam hacim getirmek önceden soğutulmuş DMEM/F12 medyanın içine resuspend.</li>
		<li>6-şey hücre kültür plaka ECM çalışma çözüm ile kuyu başına 1 mL kat. Bir ek 1 mL DMEM/F12 iyi ücret ekleyin (gerekliyse) kuyu yüzeyi tamamen kaplıdır emin olmak için. Kaplamalı 6-şey hücre kültür plakaları oda sıcaklığında en az 1 h kullanmadan önce oturmak izin. Not: Kaplamalı plakalar kuluçka veya 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medya formülasyonları, büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlayın.
	<ol>
<li>İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) orta27500 mL hazırlamak 20 x ve üreticilerin talimatlarına göre 500 x takviyeleri ekleyin.</li>
		<li>Sinirsel Orta (NM) 500 mL hazırlamak için heparin 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon, antibiyotik/antimycotic çözüm, özel sayı: 1 x B27 veya DMEM/F12 500 mL şişe 1 x N2 ek L-glutamin takviyesi ile 1 x daha önce ayrıntılı28ekleyin.</li>
		<li>10 mM hazırlamak için (1, 000 x) stok çözüm Rho-kinaz inhibitörü Y27632 (Y), tozu 10 mg 3 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Filtre, aliquot, sterilize ve mağaza-20 ° C'de 10 µM çalışma konsantrasyonu medya kullanır.</li>
		<li>20 mM hazırlamak için (10, 000 x) stok SB431542 çözüm, dimetil sülfoksit (DMSO) 1.3 mL 10 mg tozu ekleyin. 2 mM hazırlamak için (1, 000 x) stok DMH1 çözüm, DMSO 13.1 mL 10 mg tozu ekleyin. Filtre, aliquot, sterilize ve her çözüm-20 ° C'de depolayın Her biri 2 µM çalışma konsantrasyonu medya (NM + SB431542 + DMH1) kullanın. Not: Bu protokol 2 µM çalışma her iki SB431542 konsantrasyonları önerir ve bu konsantrasyon etkili hPSCs gelen sinir indüksiyon teşvik belirten29 bizim gözlem ve raporları diğerlerinden DMH1 dayalı. Daha yüksek konsantrasyonlarda de bildirilen30olmuştur. Buna ek olarak, alternatif medya ile bu da küçük moleküller yüksek sinirsel dönüşüm31için gerekli değildir gösterilmiştir. Böylece, çalışma konsantrasyonları alternatif hücre kültür ortamları bağlı olarak değişir ve en uygun konsantrasyonlarda bireysel araştırmacılar tarafından test edilmelidir.</li>
		<li>Bireysel 100 µg/mL hazırlamak için (10, 000 x) epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF2), hisse senedi çözümleri 1 mg her PBS + %0,1 BSA 10 mL içine ekleyin. Aliquot EGF ve FGF2 çözümler 50 µL aliquots stok ve-80 ° C'de depolayın Her biri 10 ng/mL çalışma konsantrasyonu medya kullanın; Örneğin, 5 µL EGF ekleyip 5 µL Nm (NM + EGF + FGF2) 50 ml FGF2.</li>
		<li>Doksisiklin hidroklorür (Dox) stok çözeltisi hazırlamak için ilk 100 mg/mL DMSO içinde toz geçiyoruz ve -20 ° C'de depolayın 2 mg/mL yapmak için daha fazla seyreltik (1, 000 x) stok PBS ve mağaza-20 ° C'de çözümde 2 µg/mL çalışma konsantrasyonu medya kullanır; Örneğin, 50 µL eklemek Dox Nm (NM + Dox) 50 ml. Not: çözümleri çözdürme sonra yeniden dondurma değil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nesil insan indüklenen Pluripotent hücreler (hPSCs) üzerinden sinirsel türlerinden
Not: Tüm hücre kültürlerinde bir kuluçka %5 CO2 37 ° C'de muhafaza edilmelidir Alt düzeyleri kullanıldığında rağmen bu kültürler Oda oksijen düzeyleri sürdürülür.
<ol><li>
Oluşturmak ve korumak astrocyte ataları (hAstros)--dan hPSCs. Not: Bu bölüm kısa ve Basitleştirilmiş farklılaşması Protokolü sağlar. (Embryoid vücut oluşumu, rozet seçimi ve bölgesel desenlendirme adımları ile) ayrıntılı bir açıklama için daha önce açıklanan protokol28 için (Şekil 1A,) yeşil kutu noktalı bakın.<ol>
<li>HPSCs (Şekil 1B) (bkz. Adım 1.1) ECM kaplı 6-şey plakalar üzerine tohum kümeleri hPSC Orta + Y 2 mL iyi ücret ile. Kök hücreler her gün yaklaşık %50 konfluent ve split gerektiği gibi onlar kadar yem.<ol>
<li>HPSCs bölmek için 1 mL passaging reaktif wells için ekleyin ve 1 dk. Incubate hücreleri 5 min için oda sıcaklığında hPSC orta 1 mL ekleyin ve toplamları 1:10 yeni ECM kaplı wells hPSC Orta + Y 2 mL başına iyi üzerine split sonra Aspire edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kadar yaklaşık %50 birleşmesi, daha sonra değişiklik medya NM + SB431542 + DMH1 sinirsel farklılaşma (0 gün) ikna etmek için kök hücreleri korumak. Ne zaman yaklaşık % 95 hücrelerdir birleşmesi, aynı ortamda yeni ECM kaplı kuyu içine 1:6 Böl.</li>
		<li>14 günde dekolmanı çözüm ve toplamları oluşumu tanıtmak için Y ile bir sigara kaplı şişesi aktarmak hücrelerle ayırmak. Not: Y ek hücre hayatta kalma ve küre oluşumu tanıtmak için kullanılan ancak her besleme sırasında dahil değildir.</li>
		<li>Nöronal ataları ve nöronlar (hNeurons) nesil için bu gün-14 hücreler aşağıda açıklandığı gibi kullanın. Alternatif olarak, bu hücreler monolayer veya küre kültürlerden daha sonraki zaman noktalarda nöronal olgunlaşma oluşur veya gliogenesis başlamadan önce kullanmaktadır. Not: varsayılan olarak, bu iletişim kuralını dorsal-kortikal astrocytes üretir. Ancak, astrocyte alt türlerinden bölgesel morfojenlerdeki28,32,33istenirse biçimlenme ek belirtilebilir. Retinoik asit (RA) hücre omurilik caudalize için süre sonic kirpi (SHH), fenotipleri agonist (SAG) smoothened veya purmorphamine ventral fenotipleri üretecek eklenebilir.</li>
		<li>Astrocyte ataları ve 3D toplamları (hAstrospheres) kendiliğinden oluşan astrocytes nesil, NM + EGF + FGF2 için geçiş ve haftalık (veya sabit pH emin olmak için gerektiği gibi) daha önce ayrıntılı34yem.<ol>
<li>Zaman karanlık merkezleri ve görünür kendiliğinden eklemek küreler kaldırmak yavaşça hAstro toplamları dekolmanı çözüm ile ayırmak. Küreler yavaşça küre sağlığını korumak için ve nekrotik çekirdek önlemek için haftada bir kez sonu. Not: dekolmanı çözüm ile tedavinin 5 dk fazla olamaz.</li>
			<li>Genişleme, 4-6 ay onayladıktan sonra hücre kimliğini ve ya dondurma Orta (göre üretici yönergelerine) veya alternatif depolama koşulları uzun vadeli korunması için sıvı azot veya kullanım için hemen donma deneme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HAstrospheres donmuş bir hazır yaz için hızlı bir şekilde bir şişe, oda sıcaklığında, bir boş 15 mL konik tüp ve 1 dk. 300 x g , santrifüj içindekilere dikkatle süpernatant Aspire DMEM/F12 ile yıkama ve iki yıkama toplam için tekrar transfer tezcan adımları. T25 şişesi NM, EGF + FGF2 + Y 6 mL toplam hacmi ile eklemek (veya gerektiği gibi büyütmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oluşturmak ve korumak indüklenebilir neurons (iNeurons) hPSCs.
	<ol>
<li>ECM kaplı 6-şey plakaları hPSC Orta + Y 2 mL (yukarıda transgenik olmayan satırları için açıklandığı gibi) iyi ücret ile tohum transgenik hPSCs (ile bir istikrarlı doksisiklin indüklenebilir neurogenin 2 transgene35). Besleme 2 mL % 70 confluency kaldırmaya hazır olana iyi başına medya ile her gün. 2.1.2. adımda açıklandığı gibi hücreleri bölün.</li>
		<li>Ne zaman % 35 hücrelerdir konfluent, eklemek NM + Dox farklılaşma iNeurons içine ikna etmek için. NM + Dox monolayer kültür olarak 3,2 adıma geçmeden önce 2 gün boyunca korumak. Not: Hücre nöronal ataları geçiş ama değil olacak henüz neurites (Şekil 1 c) genişletir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hazırlık ve 3D küre Cocultures bakım
<ol><li>HAstros (2.1.5.1 adımda anlatıldığı gibi) süspansiyon 3D toplamları üzerinden ayırmak.</li>
	<li>
HNeurons veya iNeurons üzerinden 2D monolayer ayırmak.
	<ol>
<li>6-şey tabaktan medyayı çıkarın ve dekolmanı çözeltinin 500 µL her şey monolayer kültürleri içeren ekleyin. 5 dk. yavaşça eklemek için 2-3 mL iliştirilmiş hücrelerdeki kaldırmak için DMEM/F12 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri ve 15 mL konik tüp ve santrifüj vasıl 300 x g 1 dk. aspiratı süpernatant, medya toplamak 1 mL taze medya ekleyin ve yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon ulaşmak için hafifçe bir 1000 µL micropipette ile pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microwell kültür plakaları kullanarak form 3D küre.
	<ol>
<li>Plaka microwell plaka her şey için 0.5 mL Anti-bağlılık yıkama çözeltisi ekleyerek hazırlayın. 2.000 x g 5 dk. aspiratı durulama çözüm için plaka santrifüj kapasitesi, 1 mL DMEM/F12 yıkamak ve tekrar Aspire edin her şey ekleyin. Not: Her zaman santrifüj kullanım sırasında dengeli olun.</li>
		<li>Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak her hücre türü say. Disosiye hAstros ve hNeurons veya iNeurons istenen oranını 2 mL NM + Y (iNeurons kullanılmaktadır Dox içerir) toplam hacmi her kuyuya ekleyin. Plaka 100 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve kuluçka makinesi için dönün. Not: 24 de microwell plakaları ( Tablo reçetesigörmek) iyi başına 300 microwells içerir. 6 x 105 hücreleri (2 x 103 hücre her küre için) en az ve en fazla 6 x 106 hücreler (için 2 x 104 hücre her küre) medya iyi başına 2 mL ekleyin. Bu Aralık içindeki belirli bir yoğunluk uygun alanlarda, tanımlanmış bir miktar hücre kullanın ve küre başına hücre sayısını hesaplamak için 300 bölün. Alternatif küre şekillendirme yöntemleri ve araçları da isterseniz yararlı. Hücre yoğunluğu kabul edilebilir aralıkları üreticisinin yönergelerini izleyin.</li>
		<li>Hücre içine microwell tabak içinde yoğun paketlenmiş küreler önümüzdeki 2 gün (Şekil 2A) kendi kendine bir araya sağlar. Kültür sararma Eğer % 50 ortamı değiştirin. Not: sadece yarısı ortam değişimi ve yavaşça çıkarırken ve ortam küreler rahatsız değil sırayla ekleme pipet. Küre microwells kaldır ve daha yüksek güç ile birlikte sigorta.</li>
		<li>2 gün sonra microwells bir 1000 µL micropipette (Şekil 1 d) ile küreler yavaşça kaldırın. Hafifçe microwells ile herhangi bir ek yapıştırılır küreler kaldırmak için kitle iletişim araçları altına kuvvet uygulamak. Bir 15 mL konik tüp içinde yerleş, eski medya Aspire edin, taze medya ekleyin küreler izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D küreler şekillendirme için spinner şişesi biyoreaktör sistem kurmak.
	<ol>
<li>% 70 etanol ile manyetik heyecan plaka yüzeyi temizlemek, hücre kültürü kuluçka makinesi yerleştirin. Otoklav bireysel spinner şişe sterilize etmek için.</li>
		<li>Her değer değişimi şişesi küreler en az 50-60 mL medya ekleyin (Şekil 1 d, iç metin). 60 rpm'de ayarla manyetik heyecan plaka üzerinde şişeye koyun. Kültür alanlarında kadar veri toplama için hazır değer değişimi şişeler. Not: En az 3 hafta kültür synapse oluşumu için gereklidir. Spinner şişesi biyoreaktör sistem istenmiyorsa, küreler hücre kültür şişeler veya yemekleri sabit koşullarında kültürlü. Küreler de ECM veya hidrojel gömülü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Multielectrode diziler (ölçü) ile canlı sinaptik Fizyoloji ölçümü
<ol><li>
Bana hücre kültürü için hazırlayın.
	<ol>
<li>Her MEA temiz yüzey 1 mL steril deiyonize (DI) su ile 1 h. durulama için deterjan ile sterilize etmek için % 70 etanol ile durulayın ve biyogüvenlik UV ışık altında dolap kuru hava. Not: Bana DI su steril koşullarda 4 ° C'de kullanımı kadar saklanabilir.</li>
		<li>Poli-ornitin (PLO) 0,5 mg/mL çözümünün PLO 50 mg 100 mL Borik asit arabelleği içine çözülerek hazırlayın. Her MEA yüzeyle 1 mL yüzey hidrofilik işlemek ve 4 h kaldır FKÖ'ün en az 37 ° C'de kuluçkaya, yüzey DI su ile yıkayın, ECM 1 mL eklemek Devleti'nin kat (bkz. Adım 1.1.1) ve en az 4 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>ECM kaldırmak ve yerine küreler ortam küreler elektrot dizi üzerine konumlandırılmış sağlamak bir MEA yüzeyde 1.5 ml (rakamlar 3A, 3A'). 2 gün boyunca bağlı kalmak için izin verir. 2-3 günde bir (veya daha fazla kez gerekirse), küre değil rahatsız sağlanması medya yarısı değiştirin. Not: Ek büyüme faktörlerinin kültür yaşatma ve olgunlaşma artırabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinirsel küreler elektriksel aktivitesinin ölçmek.
	<ol>
<li>Isı kontrollü headstage bir multielectrode dizi (MEA) sistemi kurma. Bir yazılım programı 5 Hz yüksek geçiren filtre ve 200 Hz alçak geçiren filtre ve 5 x standart sapma (SD) bir spike eşiği ile oluşturun.</li>
		<li>MEA headstage ve kayıt spontan elektriksel aktivite üzerinde (Şekil 3BB') koyun. Spike frekans ve genlik istatistiksel analiz için de dahil olmak üzere ham verileri kaydetmek. Not: Bir perfüzyon sistemi ile MEA farmakolojik eklemek veya uzun süreli kayıt için taze medya akışını artırmak için yararlı. Ek Post-Processing sivri istenen36,37gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunocytochemistry ile sinaptik yoğunluğu ölçümü
<ol><li>
Reaktifleri hazırlayın.
	<ol>
<li>500 mL stok çözeltisi % 4 paraformaldehyde (PFA) yapmak için 400 mL 1 x PBS bir cam kabı veya heyecan plaka havalandırılmış başlıklı ekleyin. 60 ° c karıştırma sırasında heyecan bar ve ısı ekleyin; kaynatın değil. 20 g PFA tozu ısıtmalı PBS ekleyin ve yavaş yavaş dropwise 1 N NaOH ekleyerek pH 6,9 için yükseltmek. Not: bölünmemeli ve 4 ° C'de depolanmış bir ay için % 4 İngiltere'de yılın çözüm olabilir.</li>
		<li>20 g veya sukroz 30 g sükroz, % 20 ve % 30 çözümler sırasıyla yapmak için PBS için 100 mL ekleyin.</li>
		<li>Deterjan 1 mL % 10 hisse senedi çözüm hazırlamak için PBS için 10 mL ekleyin. Homojenize için birkaç kez tersine çevirin.</li>
		<li>250 µL % 10 deterjan hisse senedi çözüm (son konsantrasyonu % 0.25) ve 500 µL her keçi ve eşek serumlar (%5 her son konsantrasyonu) 10 birincil engelleme arabellek hazırlamak için mL için PBS ekleyin.</li>
		<li>100 µL her keçi ve eşek serumlar (Son %1 konsantrasyon) 10 mL ikincil engelleme arabellek hazırlamak için PBS ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numuneleri hazırla.
	<ol>
<li>Küreler 15 mL konik tüp içine transfer tüp alt kısmında yerleşmek izin ve eski medya Aspire edin. Küreler PBS, yerleşmek ve PBS Aspire izin 500 µL ile yıkayın. 4 500 µL Ekle % PFA (veya küreler örtecek kadar) ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PFA Aspire edin ve yavaşça iki kez PBS ile yıkayın. % 20 sükroz çözüm ekleyin ve birkaç saat için 4 ° C'de kuluçkaya veya bir gece. Dikkatle Aspire edin, % 30 sükroz çözüm, ekleyin ve birkaç saat için 4 ° C'de kuluçkaya veya bir gece. Not: Örnekleri PBS veya sukroz 4 ° C'de için sonraki adıma devam etmeden önce 1 hafta kadar depolanabilir. Değilse dilimleme, 3D küre (Şekil 4A-C) bir 1,5 mL tüp olarak korumak ve 5.3 adıma geçin.</li>
		<li>Dikkatle küreler dilimleme, küreler bir gömme kriyojenik kalıp Kuru buz üzerine aktarın. % 30 sükroz çözüm Aspire edin ve yavaş yavaş kadar tamamen hava kabarcıkları kaçınarak örnek kapsar çözüm kalıp içine gömme doku dökün. Çözüm donuyor ve-80 ° C'de cryostat Dilimleme kadar saklamak kadar bekleyin.</li>
		<li>-20 ° C, dilim katıştırılmış blokları 30 µm bölümlere (veya istediğiniz gibi) ve cam slaytlara transferi bir cryostat kullanarak. -80 ° C'de leke için hazır kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostain küre.
	<ol>
<li>Slaytların kenarlarını sıvı dökülmesi önlemek için bir hidrofobik PAP kalemle anahat. Birincil ve ikincil engelleme çözümleri ( Tablo reçetesigörmek) antikorları ile hazırlayın. Her slayta veya tüp birincil engelleme arabelleği 500 µL eklemek ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Sıvı kaldırmak, taze birincil engelleme arabelleği seyreltilmiş birincil antikorlar ile 500 µL her slayta veya tüp eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Birincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.</li>
		<li>Her slayt veya tüp 500 µL seyreltilmiş ikincil antikorlar ile ikincil engelleme arabelleği ekler ve 1 h. ikincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ile 3 x 10 min için yıkama için 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Tablo reçetesiönerilen antikorlar listesi sağlanır. Diğer antikorlar veya boyalar kullanılıyor olabilir istediğiniz gibi. Floresan örnekleri (ileriye adım 5.3.3) gün ışığına maruz bırakmayın.</li>
		<li>Çözüm dropwise ve bir coverslip kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde dikkatle yer yüzey kapağı montaj 50 µL ekleyin. Slaytlar için 24 saat oda sıcaklığında kuru ve 4 ° C'de depolamak izin</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slaytları görüntü.
	<ol>
<li>63 X yağı daldırma amaç görüntü öncesi ve sonrası sinaptik protein bereket ve colocalization içinde küre dilimleri (Şekil 4 d) ile confocal veya iki fotonlu floresan mikroskop kullanın. X 20 veya 40 X amaç hAstros morfolojik özellikleri görselleştirmek için kullanın.</li>
		<li>ImageJ yazılımı ile açık floresan görüntü dosyaları. Kullanarak el ile hücre tarafsız bir sayım yöntemi daha önce ayrıntılı38olarak veya alternatif yöntemler kullanarak sayaç eklentisi, öncesi ve sonrası sinaptik puncta saymak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için sinirsel cocultures 3D küre imalatı için sistematik bir yöntem açıklanmaktadır. Küre astrocytes ve bağımsız olarak hPSCs elde edilen neurons oluşur. Odağı değil bu protokol rağmen saf astrocytes hPSCs28 üzerinden olasılığını nesil kritik bir adımdır ve deneyiminiz gerçekleştirdiyseniz Teknik olarak zor olabilir. Bu ilk adım bu sinaptik Mikri şemalar nesil titiz zamanlama ve detaylara dikkat ile yapılmalıdır. HPSC elde edilen astrocytes kullanımı uzun Farklılaşma süreci kısıtlamadı...

Astrocytes pek çok yapısal destek ötesinde fonksiyonel sorumlulukları ile merkezi sinir sistemi (MSS) içinde son derece bol gliyal hücre tipi vardır. Salgılanması çözünür synaptogenic faktörler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinin kurulması ve geliştirme1sırasında olgun sinapslarda kümeleme astrocytes yardım. Ayrıca sağlık ve plastisite sinapslarda ile hücre dışı sinyal2,3,4,5kritik bir rol oynamaktadır ve homeostatik için uzun vadeli istikrar katkıda hücre dışı potasyum ve glutamat yanı sıra enerji yüzeylerde ve ATP6,7,8salgılanmasını düzenleyerek ortamlar. Son olarak, onlar için neurotransmission extrasynaptic akımları9etkileyen tarafından katkıda bulunabilir ve etkinlik myelination10teşvik gibi diğer hücre türleri aracılığıyla dolaylı olarak etkileyebilir. Önemlisi, anormallik veya astrocytes disfonksiyon birçok nörogelişimsel sendromları ve yetişkin nevropatoloji yol açabilir çünkü sırayla için geliştirilmiş bir astrocytes nöronlar mühendislik sinir ağları içinde yanında dahil etmek için bir açık gerek yoktur endojen beyin çevre modeli. Astrocytes ayrılmaz bir özelliği ile nöronal sinapslarda1,11,12formu dinamik etkileşimler için onların yeteneğidir. Glia yokluğunda, genel de fonksiyonel olgunluk13eksikliği sinapslarda sınırlı sayıda neurons oluşturur.
İnsan astrocytes, transkripsiyon, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri görüntülemek — artan büyüklüğü ve karmaşıklığı dallanma, hem de species-specific gen gibi — kemirgenler12,14', değil recapitulated 15. Sonuç olarak, çalışmalar insan pluripotent kök hücre (hPSC) kullanan-türetilmiş sinir hücreleri haline yaygın olarak kabul yeni tedaviler, yaralanma modelleri ve kültür paradigmalar16 geliştirirken CNS bağlı hastalıklar vitro incelenmesi aracı olarak ,17. Ayrıca, hPSCs insan synapse oluşumu ve işlev birincil doku18,19gerek kalmadan çalışma izni.
İnsan beyninin ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik ile onun sinaptik ağları özetlemek uygun bir platform için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, faiz 3D kültür sistemleri üretiminde ortaya çıkmıştır (genel olarak 'organoids' bilinen 'pulcuklarının' veya 'mini beyin') karmaşık üç boyutlu (3D) modelleme20 yapıları cep ve makro düzeyde. 3D kültür sistemleri tipik 2D coculture paradigmalar21,22sırasında normalde bulunmadığından veya sınırlı ECM ve hücre-hücre etkileşimleri korur. Teknikleri bir bolluk var 3D sinirsel pulcuklarının23,24,25kültür için; Ancak, birçok uzun kültür dönemleri gerektirir (ay-yıl) spontan gelişimi ve katman korunması için Kullanıcı ile çok az çıktı üzerinde denetime sergilenmesi.
Burada, biz hızlı bir şekilde sistematik bir yönteme göstermek ve sürekli genetiğinin sinirsel etkileşim arasında birden çok hücre tipleri (önceden farklı nöronlar ve astrocytes) hPSCs küre cocultures ('asteroitler')26 hücreleri birleştirerek elde edilen 3D insan özgü morfolojik karmaşıklığı özetlemek. Bu yüksek yoğunluklu sinir sistemi zamanla olgun özellikleri almak ve ekranlı veya bir yüksek-den geçerek şekilde denetlesinler eşit dağınık sinirsel alt türlerini oluşturur. Biz insan astrocytes sinaptik ağ veri bloğu etkinliğinde bu 3D cocultures neden ilk kez göstermek. Ayrıca, bu iletişim kuralını küreler farklı boyutlarda, farklı bölgesel MSS kimliklere belirtilen hücreleri kullanmak ve istediğiniz gibi birden çok hücre tiplerinin etkileşimleri çalışmaya oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Ayırma çözümü</td></tr><tr><td>AggreWell plaka</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma Önleyici Durulama</td><td>Çözeltisi Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7010</td><td>Hücreyi önleyin Mikrokuyu plakalarına yapışma</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Ortam Takviyesi</td></tr><tr><td>BrainPhys nöronal ortam</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5790</td><td>Nörofizyolojik bazal ortam alternatifi</td></tr><tr><td>Dairesel cam lameller</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Kök Hücre Teknolojiler</td><td>7930</td><td>%10 DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td> içeren kriyoprezervasyon ortamı <td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>GlutaMAX takviyeli</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>73634</td><td>TEHLİKE: Yutulması halinde toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 &mu; M Eşek</td></tr><tr><td>serumu</td><td>Lampire Biyolojik Laboratuvarları</td><td>7332100</td><td>Çalışma konsantrasyonu: Birincil engelleme tamponunda %5, ikincil engelleme tamponunda %1</td></tr><tr><td>Doksisiklin Hidroklorür (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>TEHLİKE: Hamile kadınlar için toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fluoromount-G montaj solüsyonu</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cam kaydıraklar</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Lampire Biyolojik Laboratuvarları</td><td>7332500</td><td>Çalışma konsantrasyonu: Birincil blokaj tamponunda %5, ikincil blokaj tamponunda %1</td></tr><tr><td>Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı</td><td></td><td></td> Heparin Sigma H3149-50KU AMQAX1000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Yaşam Teknolojileri Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL</td></tr><tr><td>Manyetik plaka</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel membran matrisi</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>ECM kaplama çözümü. Çalışma konsantrasyonu: 80 &mu; g/ml'dir. Buz üzerinde hazırlayın ve pipetlerin, tüplerin ve ortamın önceden soğutulduğundan emin olun.</td></tr><tr><td>MEA 2100 Sistem</td><td>Çok Kanallı Sistemler</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Montaj çözümü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Ortam Takviyesi</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Kriyoseksiyon için doku gömme çözümü</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>TEHLİKE: Solunması halinde toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: PBS'de %4</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poli-l-ornitin (PLO)</td> <td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 0.5 mg / mL</td></tr><tr><td>Dikdörtgen cam kapak kaymaları</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5872</td><td>Ayrılma ve pasaj reaktif</td></tr><tr><td>Rho-Kinaz İnhibitörü Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72234</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 2 &mu; M</td></tr><tr><td>Döner şişeler</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>S5-3</td><td>Çalışma konsantrasyonu: PBS T25 Kültür Şişesinde %20 veya %30</td></tr><tr><td></td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Havalandırmalı kapaklar</td></tr><tr><td>T75 Kültür Şişesi</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>Havalandırmalı kapaklar</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Deterjan. Çalışma konsantrasyonu:% 1</td></tr> <tr><td>TeSR-E8 bazal ortam</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5940</td><td>İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) ortamı</td></tr><tr><td>TeSR-E8 takviyeleri</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5940</td><td>İnsan pluripotent kök hücre ortamı için takviyeler</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Hücre geçirgenliği için deterjan. Çalışma konsantrasyonu: Blokaj tamponunda% 0.25</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Birincil antikor; astrositler perisinaptik</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Birincil antikor; astrositler</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Birincil antikor; astrositler</td></tr><tr>Dr<td>. Jeffrey Rothstein'dan</td><td>Glt1</td> Hediyesi <td>n/a</td><td>Birincil antikor; astrositler</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>160 011</td><td>Birincil antikor; nöronlar, post-sinaptik</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>188 004</td><td>Birincil antikor; nöronlar</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Birincil antikor; nöronlar, post-sinaptik</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Birincil antikor; astrositler</td></tr><tr><td>Sinapsin 1</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>106 103</td><td>Birincil antikor; nöronlar, pre-sinaptik</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-tübülin (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Birincil antikor; nöronlar</td></tr></tbody></table>

sinaptik microcircuit modelleme 3d cocultures astrocytes ve neurons insan pluripotent kök hücre ile

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan beyni çalışmak için ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Bu soruna yönelik bir gelişen teknoloji 'organoids' veya 'pulcuklarının', hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere hücre adezyon molekülleri uzun vadeli korunması için ifade edilen üç boyutlu (3D) sinir hücre kültürleri, kullanmaktır. Ancak, bu kültür zaman alıcı ve sistematik olarak oluşturulan sistemlerdir. Burada, biz hızla ve sürekli nöronların 3D cocultures üretmek için bir yöntem detay ve astrocytes gelen insan pluripotent kök hücre. İlk, önceden farklılaşmış astrocytes ve nöronal ataları ayrışmış ve sayılır. Küre-oluşturan hücreler daha sonra birleştirilir yemekleri ile bir Rho-kinaz inhibitörü ve küreler tekrarlanabilir boyutta üretmek için belirli oranları. Kültür kayan küreler olarak birkaç hafta sonra cocultures ('asteroitler') son olarak immunostaining için kesitli veya sinaptik yoğunluğu ve gücü ölçmek için multielectrode diziler kaplama. Genel olarak, bu protokol olgun hücre türü kısıtlanmış işaretleyicileri görüntülemek, fonksiyonel sinapslarda formu ve spontan sinaptik ağ veri bloğu aktivite sergilemek 3D sinirsel küreler verecektir bekleniyor. Birlikte, bu sistem uyuşturucu tarama ve mekanizmaları soruşturmalar hastalığının monolayer kültürlere göre daha uygun bir model izin verir.

Düzgün gerçekleştirildiğinde bu protokolü hPSCs (Şekil 1A-1C), oluşturulan astrocytes28,33,34 ve neurons35 işlevsel cocultures tanımlanmış nüfus olarak üretecek daha önce26 detaylı ve burada açıklanan adımları 2.1-2.2. Microwell levha, kullanımı ile kademeli bu yordamı tutarlı boyutu ve şekli (adım 3.3;...

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Bu yöntem, birden fazla insan sinir hücresi tipi arasındaki hücreler arası iletişimin sinaptik devre oluşumuna ve işlevine nasıl katkıda bulunduğuna ilişkin sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, hızlı ve sistematik bir şekilde, insan pluripotent kök hücrelerinden işlevsel olarak olgunlaşmış astrositlerin ve nöronların üç boyutlu kokültür kürelerini üretir. Bunlar titiz deneysel araştırmalar için kullanılabilir.Bu protokolün tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği, ortaya çıkan organoid teknolojilerine tanımlanmış bir alternatiftir. Bunlar, yaralanma veya hastalıktan sonra nörorejenerasyonu teşvik etmek için yeni ilaç geliştirme ve hücresel aşılama tedavisi için umut vaat etmektedir. Rho-kinaz inhibitörü Y-27632 içeren iki mililitre HPSC ortamındaki HPSC kümelerini ECM kaplı altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna oturtarak başlayın.Kök hücreleri yaklaşık% 50 birleşene kadar koruyun, daha sonra nöral indüksiyonu teşvik etmek için ortamı SB431542 ve DMH1 içeren nöral ortama değiştirin. Hücreler yaklaşık% 95 birleştiğinde, her bir kuyucuğu birden altıya kadar yeni ECM kaplı oyuklara bölün. 14. günde, hücreleri ayırma çözeltisi ile ayırın ve agrega

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, hipokampal nöronlara sahip düzlemsel bir mikroelektrot dizisine bağlı bir 3D nöronal kültürün gelişimini göstermektedir. İzole edilmiş nöronlar, mikroelektrot dizisinin aktif alanı üzerinde 2 boyutlu bir ağ oluşturur ve bir zar eki olan çok kuyulu bir plakada cam mikro boncuklara yapışır. Bu nöron kaplı mikro boncukları elektroda aktardıktan sonra, birbirine bağlı bir 3D sinir ağı halinde düzenlenirler.

Mikro elektrot dizilerine bağlı üç boyutlu nöronal ağlar oluşturma

Video, insan pluripotent kök hücrelerinden progenitörlerden astrosferler üretmenin bir yöntemini göstermektedir. Büyüme faktörleri ve kinaz inhibitörleri içeren besleyici ortamlarla kök hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını içerir. Bu hücreler daha sonra toplanır ve astrositlere farklılaşarak astrosferler oluşturur.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerini Kullanarak Astrosferlerin Üretilmesi ve Bakımı

Bu video, 3B küreler oluşturmak için astrositleri ve nöronları birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. Bu 3B küreler, sinaps oluşumunu ve sinir ağı entegrasyonunu incelemek için ayrı bir platform sağlar, böylece gelişimsel sinirbilim, nörodejeneratif hastalıklar ve nörofarmakolojik müdahalelerde araştırma için potansiyel bir model görevi görür.

Sinaps Oluşumunu İndüklemek için Astrositlerin ve Nöronların 3D Ko-Kültür Kürelerinin Oluşturulması

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Bu video, nöronal ağ aktivitesini kaydetmek için bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmayı göstermektedir. Motor nöronların ve astrositlerin ko-kültürü bir çoklu elektrot dizisi (MEA) plakası üzerinde kurulduktan sonra, nöronal ağın senkron ritmik elektriksel aktivitesi MEA kullanılarak hücre dışı olarak kaydedildi.

Bir Nöron-Astrosit Ko-Kültüründe Nöronal Ağın Elektrofizyolojik Aktivitesinin Kaydedilmesi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Bu çalışmada, 3 boyutlu nöronal kültürlerin düzlemsel Mikro-Elektrot Dizilerine (MEA'lar) bağlandığı yeni bir deneysel model presented. 3D ağlar, nöronların üzerinde büyüdüğü ve birbirine bağlı 3B yapılar oluşturduğu cam mikro boncuklardan oluşan bir iskelede nöronların tohumlanmasıyla inşa edilir.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Burada, iPSC'den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel olgun astrosit ve nöronların 3D kokültür kürelerini nasıl üreteceğinizi. Bu yöntem, sinaptik devre aktivitesini incelemek ve nörorejenerasyon araştırmaları için ölçeklenebilir bir platform sunar.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Daha fazla video keşfet