Name: Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin sinaptik vezikül geri dönüşümünü optik analizle değerlendirmeyi, presinaptik protein ekspresyonu kullanarak. Bu yöntem, sinir hücrelerinde protein lokalizasyonunu ve sinaptik plastisiteyi incelemek için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Irmgard Weiss uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser DFG kümenin mikroskobu nanometre mesafeden için mükemmel ve moleküler fizyolojisi (CNMPB, B1-7, T.D.) beyin üzerinden tarafından desteklenmiştir.

Hiçbir canlı hayvan çalışmaları yapılmıştır. Hücre kültürleri altında onay yerel hayvan koruma yetkilileri (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) tarafından onaylanmış almak için ötenazi hayvanları içeren deneyler T10/30 numara. Deneyler ile onaylanmış protokoller yapılmıştır.
1. birincil hipokampal hücre kültürü
<ol><li>Embriyonik gün 1916,17fare hipokampus Disosiye hücre kültürünü hazırlayın. 12 mm coverslips 50.000-60.000 hücreler/iyi bir yoğunluğu 24-iyi yemekler polyethyleneimine (PEI) ile kaplı hücrelerdeyse plaka. Bir hücre sayım odası ve faz kontrast optik kullanarak yoğunluğu kontrol edin.</li>
	<li>3 gün (gün vitro (DIV) 3) 24-şey plaka %5 CO237 ° C'de kuluçka nöronlar kültür.</li>
	<li>Coverslips iletilen ışık mikroskobu (Örneğin, faz kontrast optik, 10-20 X büyütme) kullanarak hücre sağlık göstergeleri için değerlendirmek. Kontrol için iyi sağlık göstergeleri aşağıdaki: bir açık faz kontrast hale, neurites boncuklu yapıları, olmadan ve hiçbir soma kümeleme veya neurite donatılacak.</li>
</ol>2. transfection
Not: Aşağıdaki iletişim kuralı 3 kuyuları için bir çift-transfection ifade eder. Ancak, zaman 4 kuyular için yeterli miktarda hazırlanan protokol en iyi çalışır.
<ol><li>Transfection arabellek (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 15 mM glikoz, 42 mM HEPES) 500 mL bir Erlenmeyer şişeye hazırlayın.<ol>
<li>NaCl 8.0 g, KCl 0,37 gr, 0,095 g Na2HPO4, 1.35 g glikoz ve HEPES 5.0 g 400 ml distile su içinde bir Erlenmeyer flask geçiyoruz.</li>
		<li>PH 6,95 için 1 M NaOH pH metre kullanarak ayarlayın.</li>
		<li>500 ml distile su ile ses seviyesini ve pH metre kullanarak pH kontrol edin.</li>
		<li>20-30 mL aliquots transfection arabelleği aşağıdaki pH değerleri ile pipetting 1 tarafından yapmak transfection arabelleğine M NaOH: 6,96, 6.97, 6.98, 6,99, 7,00, 7,01, 7.04, 7,05, 7,03 7,02 7.06, 7,07, 7,08, 7,09, 7.11. Not: Transfection tampon pH transfection etkinliği için çok önemlidir.</li>
		<li>Transfected hücre en yüksek sayısı transfection arabellek neden test etmek için 6,96 7.11 her pH değeri sınayın. 2.2-2,11 ve doğrulanmış bir plazmid GFP ifade olan transfection yöntemi kullanın. En iyi hangi arabellek çalışır coverslip değerlendirmek her transfection tampon pH değeri başına transfected hücre sayısını belirleyin.</li>
		<li>Aliquot 2 mL microcentrifuge tüpler içine en yüksek transfection verimliliği ile tampon donma ve tüpler-20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>İndirimli serum orta, hücre kültürü orta ve 37 ° c su banyosu içinde distile su önceden ısıtmak.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge tüp transfection karışımı hazırlayın. Steril çalışma koşulları sağlamak için laminar akış başlık altında çalışır.<ol>
<li>Mix 7.5 µL 4 µg her endotoksin içermeyen DNA'ın (Synaptophysin-mOrange ve mGFP/GFP-Rogdi) ile 2 M kalsiyum klorür. Toplam hacmi 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 60 mL ulaşmak için su ekleyin.</li>
		<li>Transfection arabellek 60 mL karışıma ekleyin. En iyi sonuçları elde etmek için transfection tampon dropwise DNA-mix vortex Tarih hafifçe sallayarak süre ekleyin.</li>
		<li>(RT) Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya. Laminar akış hood yanındaki tüp yerleştirerek kuluçka süresi sırasında kuluçka tüp sallayarak kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laminar akış başlık altında hücre kültür orta ("şartına orta") 1000 mL damlalıklı kullanarak kuyulardan çıkarın ve kuluçka ayrı bir kapta saklayın.</li>
	<li>İndirimli serum orta 500 mL her şey için ekleyin. 20 dakika kuluçka dönemi (adım 2.3.3) bitene 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>Transfection mix 30 mL birkaç damla pipetting tarafından her şey için ekleyin. Tüpün dibinde tortu atmak.</li>
	<li>Bütün wells transfection karışımı ile temin edildikten sonra orta transfection karışımının dağıtımını sağlamak için 24-şey plaka yavaşça salla.</li>
	<li>60 dakika 37 ° C ve % 5 CO2kuyu kuluçkaya.</li>
	<li>Kaldırmak ve transfection mix atmak ve hücre kültür orta ile üç kez yıkayın. Her şey için hücre kültür orta 1 mL ekleyin ve onları Orta RT. kaldırmak 750 mL 30 saniye için kuluçkaya ve taze orta aynı miktarda ekleyin. Bunu üç kez tekrarlayın. Not: Çamaşır adım önemlidir. Her şey en azından yok orta vardır zaman tutmak (i.e., çıkarma ve iyi iyi değiştirme) ve çamaşır orta yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Kaldırmak ve hücre kültür orta atın ve şartına orta iyi-tarafından-da 450 mL ekleyin.</li>
	<li>Nöronlar kuluçka DIV 10 37 ° C ve % 5 CO2 olgun izin.</li>
</ol>3. stimülasyon ve Syt1 alımı
Not: Aşağıdaki protokol için 3 kuyu Anlamazdın uygulanır. İçin depolarizasyon kuyu diğer herhangi bir sayıda tutarları uygun şekilde ayarlayın.
<ol><li>10 x depolarizasyon arabellek (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glikoz, 200 mM HEPES, pH 7,4) bir Erlenmeyer şişesi 50 mL hazırlayın. Not: Depolarizasyon arabellek birkaç hafta için 4 ° C'de tutulabilir. Bir sigara depolarize çözüm de kullanılırsa, bir 10 hazırlamak 1290 mM oluşan x Tyrode'nın çözüm NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glikoz, 200 mM HEPES pH 7.4 karşılaştırmak üzere stimülasyon kaynaklı ile kendiliğinden geri dönüşüm geri dönüşüm. 1 x seyreltme sonra Tetradotoksin 1 µM Aksiyon potansiyeli üretimi engellemek için kullanmadan önce ekleyin.<ol>
<li>1.87 gram NaCl, KCl, 0.1 g MgCl2-6 H20, CaCl2-2 H2O 0,15 g ve 3.0 g glikoz-1 H2O ve HEPES 2.38 g 50 ml distile su içinde bir Erlenmeyer flask 2,61 g geçiyoruz. NaOH ve steril-filtre çözümü ile pH ayarlayın. Arabellek 1:10 1 x konsantrasyon ulaşmak için distile suda sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS (pH 7,4) stimülasyon sonra fiksasyon için hazır olun.<ol>
<li>500 mL % 4'lük için 1 x PBS, PFA çözülür paraformaldehyde 450 ml distile H2o 20 g Not: Çözüm Isıtma eriterek kadar hızlandırabilir ancak PFA parçalanır gibi çözüm üzerinde 70 ° C, ısı değil. Uyarı: Toksik, potansiyel olarak kanserojen ve teratojenik PFA. PFA ile çalışırken eldiven, duman başlık altında çalışmak ve sindirim kaçının.</li>
		<li>RT için çözüm soğumaya bırakın ve 50 mL 10 x PBS stok çözeltisi ekleyin. PH 7.4 için NaOH/HCl pH metre kullanarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 depolarizasyon arabellek x 600 mL ve hücre kültür ortamına su banyosu 37 ° C'de 10 mL önceden ısıtmak.</li>
	<li>Fare anti-Syt1 antikor (klon 604.2) 1 mL 1 x depolarizasyon arabellek ve girdap 10 saniyeliğine ekleyin.</li>
	<li>Kaldırmak ve hücreleri hücre kültür ortamından atın. 200 mL her şey ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi'de 5 dakika kuluçkaya depolarizasyon-antikor karışımı ekleyin.</li>
	<li>Kaldırmak ve depolarizasyon-antikor mix atmak ve hücre kültür orta ile üç kez yıkayın. Her şey için hücre kültür orta 1 mL ekleyin ve orta RT. kaldırmak 750 mL 30 saniye için kuluçkaya ve taze orta aynı miktarda ekleyin. Üç kere tekrar edin.</li>
	<li>Kaldırın ve hücre kültür orta atmak ve % 4'lük 300 mL ekleyin 1 x PBS PFA. 4 ° C'de 20 dakikadır kuluçkaya</li>
	<li>1 x PBS ile 5 dakika her için üç kez yıkayın. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>4. Immunocytochemistry
<ol><li>50 mL engelleme arabelleği hazırlayın. Not: arabellek engelleme-20 ° C'de aylarca tutulabilir.<ol>
<li>2.5 g sükroz ve sığır serum albumin (BSA) 1 g 5 mL 10 x PBS stok çözeltisi geçiyoruz. 1.5 mL % 10 deterjan stok çözeltisi ekleyin. Çözüm kadar tüm bileşenleri düzgün çözünmüş ve distile H2O son hacmi 50 mL erişene dek ekleyin karıştırın. Aliquot çözüm ve depolama için aliquots Don.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Birincil Syt1-antikor türler karşı yönetmen) ikincil, fluorophore birleşince antikor 1: 1000 seyreltme her kuyuda engelleme arabellekte 200 ml seyreltik.</li>
	<li>Kaldırmak ve her şey bir coverslip içeren üzerinden 1 x PBS atın.</li>
	<li>Arabellek-antikor karıştırmak için her şey engelleme 200 mL ekleyin ve RT. az 60 dakika boyunca kuluçkaya Dikkat: ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, tüm adımları ilerlemeye karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Kuluçka sonra hücreleri üç kez için 1 mL 1 x PBS ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Mikroskop slaytlar üzerindeki coverslips ile gömme orta gömün.<ol>
<li>Mikroskop slayt ortamına katıştırma 7 mL damla ekleyin. Coverslip bir şırınga ile kaldırma ve forseps ile kapma 24-şey plaka çıkarın. Dikkat: forseps dikkatli olmalıdır bu yüzden hücreleri coverslip yüzeyi kolayca, zarar görmüş.</li>
		<li>Coverslip PBS kaldırmak ve dikkatli bir şekilde yumuşak bir doku için bir kenar dokunarak kuru için distile su içine daldırma.</li>
		<li>Böylece hücreleri taşıyan yüzey böylece hücreleri gömme orta katıştırma mikroskop slayt yüzleri coverslip gömme orta damlacık üzerine çevirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytlar için 1-2 h başlık altında kurumaya bırakın (ışığa maruz önlemek için kapak) ve 4 ° C'de bir mikroskop slayt kutusunda saklamak Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>5. mikroskobik analizlerin yapıldığı
<ol><li>Coverslips kuru sonra onları objektif ve kamera ile mikroskop altında yerleştirin.</li>
	<li>Kaç piksel gri değerlerden en büyük dağıtım sağlamak için pozlanmış her kanal için çekim hızı ayarlayın. Not: çekim hızı kanallar arasında farklı olabilir iken, coverslips arasında karşılaştırılabilir emin olmak bir kanal için sabit olmalıdır.</li>
	<li>İlgi coverslip (ROIs) 10 bölgeler için çok kanallı görüntüler elde etmek. GFP-floresan, hangi-meli var olmak punctate kontrol ederek yatırım getirisi transfected nöron aksonal işlemlerini içerdiğini denetleyin.</li>
</ol>6. istatistiksel analiz
<ol><li>Görüntüleri .tif dosyaları olarak dışa aktarma. Yanında tıkırtı eğe OpenView18 ilgili resimleri yüklemek | Görüntü dosyasını yükle.</li>
	<li>Synaptophysin-mOrange görüntüsü olarak Kanal 1, Rogdi-GFP/mGFP resmi gibi 2 kanal ve Kanal 3 olarak Alexa647 floresan görüntü seçin.</li>
	<li>Eşik ROIs.<ol>
<li>Çözümleme ' yi tıklatın | Yer alan puncta üzerinde. Görsel incelenmesi üzerine, diffüz floresan, sadece punctate sinyalleri (temsil eden Synaptophysin-mOrange floresan) Kanal 1 görüntü bırakarak söz konusu değildir eşik ve Delta yoğunluk değerleri seçin. Tüm görüntüler için aynı eşik tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bu ROIs (GFP-Rogdi/mGFP floresan) karşılık gelen kanal 2 ve 3 (Syt1-floresan) her coverslip alanının Şimdi Çalıştır' ı tıklatarak aktarın. Not: ROIs hücre çift transfected ise sadece düşünülmelidir. Bu yöntemde, mOrange ve GFP floresans açıkça görünür olmalıdır.</li>
	<li>Verileri günlük verilerinitıklatarak analiz günlük düzenleyicisine kaydetmek.</li>
	<li>Windows sekmesinin altındaki analiz günlük Düzenleyicisi'ni açın ve her kanal için değerleri kopyalayın. Değerleri ayrı kanallar için bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Her iki transfection koşullarında (GFP-Rogdi ve mGFP) ROIs Syt1 kanalda ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek.</li>
	<li>Önemli farkları belirlemek için bir öğrenci t-testi gibi uygun istatistiksel testler uygulanır.</li>
</ol>

<ol><li>Koh, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I%2C+a+Ca2%2B+sensor+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release.</a> Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Does+Synaptotagmin+Trigger+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Perin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Conservation+of+Synaptotagmin+%28p65%29+in+Drosophila+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).</li>
<li>Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytotic+Recycling+of+Synaptic+Vesicles+in+Developing+Processes+of+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).</li>
<li>Ko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-1+performs+neurexin-dependent+and+neurexin-independent+functions+in+synapse+validation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation.</a> The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).</li>
<li>Shinoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+enhances+spontaneous+and+activity-dependent+neurotransmitter+release+at+excitatory+terminals+but+not+at+inhibitory+terminals+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).</li>
<li>Ivanova, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25652077">Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo.</a> The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).</li>
<li>Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+impairment+of+spontaneous+neurotransmission+modulates+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome+associated+gene+Rogdi+encodes+a+novel+presynaptic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rogdi+Defines+GABAergic+Control+of+a+Wake-promoting+Dopaminergic+Pathway+to+Sustain+Sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila.</a> Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).</li>
<li>Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic+encephalopathy+and+amelogenesis+imperfecta%3A+Kohlsch%C3%BCtter-T%C3%B6nz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Euopean+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome.</a> Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).</li>
<li>Kraszewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Dynamics+in+Living+Cultured+Hippocampal+Neurons+Visualized+with+CY3-Conjugated+Antibodies+Directed+against+the+Lumenal+Domain+of+Synaptotagmin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin.</a> Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/02/08/262246">Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> bioRxiv. , 262246(2018).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Dresbach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regions+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+Bassoon%3A+Significance+for+synaptic+targeting+and+cytomatrix+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+Prenatal+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).</li>
<li>Tsuriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sharing+as+a+predominant+determinant+of+synaptic+matrix+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics.</a> PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).</li>
<li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Synaptic+Vesicle+Recycling+Using+FM+Dyes+During+Evoked%2C+Spontaneous%2C+and+Miniature+Synaptic+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).</li>
<li>Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Synaptic+Vesicle+Endocytosis+in+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24369372">Visualizing presynaptic function.</a> Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).</li>
<li>Opazo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+Intermixing+of+Synaptic+Vesicle+Components+upon+Vesicle+Recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling.</a> Traffic. 11, 800-812 (2010).</li>
<li>Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).</li>
<li>Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21145004">Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix.</a> Neuron. 68, 907-920 (2010).</li>
<li>Wittenmayer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Neuroligin1+regulates+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Remodeling+of+the+Presynaptic+Cytomatrix+upon+Homeostatic+Adaptation+to+Network+Activity+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing.</a> Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).</li>
<li>Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+synaptic+vesicles+in+nerve+endings+monitored+by+recovery+from+photobleaching+of+synaptic+vesicle-associated+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence.</a> Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).</li>
<li>Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+origin+of+synaptic+vesicles+undergoing+evoked+and+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion.</a> Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+Is+Essential+for+Vesicular+Targeting+of+Synaptotagmin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1.</a> Neuron. 41, 85-99 (2004).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+is+dispensable+for+sorting+of+synaptotagmin+1+but+is+critical+for+targeting+of+SV2+and+synaptophysin+to+recycling+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).</li>
<li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li>
<li>Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+pool+of+vesicles+recycles+at+rest+and+drives+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 45, 563-573 (2005).</li>
<li>Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+synaptic+vesicles+drive+active+and+spontaneous+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release.</a> Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).</li>
<li>Bacci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+blockade+of+glutamate+receptors+enhances+presynaptic+release+and+downregulates+the+interaction+between+synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated+membrane+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2.</a> Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).</li>
<li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li>
<li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li>
<li>Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/03/172239">Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25.</a> bioRxiv. , 172239(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Orada üç deneyleri rutin olarak sinaptik vezikül (SV) geri dönüşüm çalışırdım. İlk iki kullanımını içerecek bir) Floresan styryl Boyayıcılar FM1-(hangi organelleri endositoz sırasında alınır ve ekzositozu sonra yayımlanan membranlar dahil) 43 gibi; ve b) fluorescently rekombinant SV proteinler (ki, overexpression proteinaceous geri dönüşüm makineleri dahil) öğesini. Ekli fluorophores onların floresans pH bağlı olarak değiştirirseniz, bir SV asidik iç ve ekstraselüler ortamın pH arasındaki değişiklikleri izlemek için kull...

Presynaptic özelliklerini değiştirmek, sinaptik plastisite sırasında veya Yanıt pertürbasyon sinaptik fonksiyon olarak nasıl sinaptik vezikül geri dönüşüm eğitim belirlemede önemlidir. Synaptotagmin-1 (Syt1) eğitim antikor alımını SV geri dönüşüm miktarını ölçmenin bir yöntem sağlar. Syt1 Ca2 + sensörü davranır ve nörotransmitter1,2exocytotic serbest bırakılması için gereklidir, SV ilişkili bir proteindir. Bir C-terminal sitoplazmik etki alanı dışında ZF ve SV3içinde N-terminal luminal etki alanı ile bir transmembran proteindir. Ekzositozu sırasında Syt1 luminal etki dış ortamına maruz olur. Bu dış orta, endositoz sırasında içselleştirilmiş olur sitoplazmik etki karşı antikorlar ekleyin. Bu antikorlar da önceden fluorophores veya immunostained ile ikincil antikorlar4,5,6,7ile Birleşik olabilir. Elde edilen immunosignal floresan yoğunluğu SV geri dönüşüm miktarı orantılıdır. Bu yaklaşım, kurucu ve depolarizasyon kaynaklı ZF6,8geri dönüşüm belirlemek için kullanılabilir.
Syt1 alımını deneyleri seyrek transfection hücreleri küçük bir dizi ya da virüs-aracılı gen transferi tabak içinde hemen hemen tüm hücrelere sonra gerçekleştirilebilir. Bizim Yöntem tahlil kalsiyum fosfat9kullanarak birincil hipokampal nöronlar seyrek Çift Kişilik transfection ile birleştirir. Presynapses biriktirmek için bilinen bir rekombinant marker protein fluorescently etiketli Synaptophysin, presynaptic terminalleri bulun ve bizim protein ilgi, Rogdi overexpress için kullanıyoruz. Bu Rogdi hedefleri fonksiyonel synapses ve geri dönüşüm SV etkiler olup olmadığını test bize sağlar. Rogdi kodlama gen aslında Drosophila mutantlar Engelliler bellek10tarafından karakterize bir ekran tespit edilmiştir. İnsanlarda, Kohlschütter-Tönz sendromu denen nadir ve yıkıcı bir hastalık Rogdi gen mutasyonlar neden. Hastalar diş mine malformasyonlar, pharmacoresistant epilepsi ve psikomotor gecikmeler muzdarip; Ancak, gen ürünü hücre altı lokalizasyonu zor11kaldı. Böylece, Syt1 alımını tahlil GFP öğesini Rogdi fonksiyonel sinapslarda9lokalizasyonu için anahtar kanıt sağladı.
Bu alımı teknik birçok faydası vardır. İlk olarak, SV geri dönüşüm hem gerçek zamanlı canlı görüntüleme7,12yaparak ve sonra fiksasyon6,9 Syt1 floresan etiket floresan yoğunluğu ölçme tarafından görülebilir. Ayrıca, çeşitli Syt1 antikor türevleri geliştirilmiştir. Standart immunostaining protokol fiksasyon sonra sonrası ikincil bir antikor ile etiketli etiketsiz türevleri ve önceden eklenmiş bir floresan etiketi önceden konjuge türevleri vardır. Son olarak, floresan antikor tabanlı kullanılan piyasada bulunan ikincil veya konjuge boyalar geniş yelpazesi nedeniyle avantajlıdır.
Ne zaman tamir ve immunostaining nöronlar, ayrıca ek proteinler için leke ve colocalization analiz gerçekleştirmek mümkündür. Bu geri dönüşüm SVs ile ilgili olarak bulundukları belirlemenize yardımcı olabilir. Floresans etiket yoğunluğunu geri dönüşüm SV miktarını doğrudan ölçüsüdür. Buna ek olarak, antikorlar seçmeli olarak yüksek özgüllük ve küçük arka plan floresans4ile sonuçlanan yapıları, Syt1 içeren etiket. Farklı stimulasyon protokolleri de, depolarizasyon arabellekleri veya elektrik stimulasyon protokolleri9,12,13,14gibi kullanılabilir. Ancak, bazal SV geri dönüşüm nöronal kültürler15uyarıcı olmadan ölçülebilir.
Bizim yöntem özellikle fiksasyon sonra Syt1 antikor Anlamazdın çift transfected nöronlar ile ikincil antikor immunolabeling giderir. Ancak, tüm rutin olarak kullanılan türevleri tahlil için izleyiciler Protokolü ihtiyaçlarınıza uyum için size şans vermek amacıyla tartışma bizim bakın.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>eşek anti fare Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 kuyulu</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>tüp (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz Merck</td><td></td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Mürekkepçi)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Deney Analizi Uygulama</td><td>Özgür yazılım,</td> Noam E. Ziv, Technion &ndash tarafından yazılan yorumlara <td></td> bakın<td>; İsrail Teknoloji Enstitüsü, Hayfa, İsrail</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>güvenlik başlığı</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Seri No. 40649111</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>105311</td><td>fare monoklonal; klon 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sinaptik vezikül presynaptic protein overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Active presynaptic sinir terminallerine sinaptik veziküller exo - ve endositoz döngüleri tabi. Geri dönüşüm sırasında luminal etki alanları SV transmembran proteinler, hücre yüzeyi maruz olur. Bu proteinler biridir Synaptotagmin-1 (Syt1). Syt1, bir kez kültür ortamına eklenen luminal etki karşı bir antikor exo-endocytotic döngüsü sırasında alınır. Bu alımı SV geri dönüşüm miktarı ile doğru orantılıdır ve ayirt sayılabilir. Burada, Syt1 antikor alımını kültürlü hipokampal nöronlar Çift Kişilik transfection ile birleştirmek. Bu bize (1) yerelleştirmek rekombinant presynaptic işaretçisi Synaptophysin ifade üzerinde temel alan presynaptic siteleri (2) Syt1 alımını kullanarak onların işlevlerini belirleyin ve karakterize (3) hedefleme ve etkileri ilgi, GFP-Rogdi bir protein sağlar.

Beklenen sonuç bu yaklaşımın coverslip başına yaklaşık 50 nöronlar çift transfected bir yoğunluk iyi başına 50.000 nöronların, yerini. Her nöron axon birikimi kümeleri ofSVs gösteren fluorescently öğesini Synaptophysin, birden çok etkin noktaları göstermek için bekleniyor. Fonksiyonel presynaptic siteler, rekombinant Synaptophysin sinyal punctate Syt1 floresan ile colocalizes. Çift Kişilik transfection, GFP-Rogdi ilgi (Şekil 1) protein olarak ya da mGFP denet...

Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Bu tekniğin temel avantajı, çok basit olması, sadece standart ekipman gerektirmesi ve antikorların özgüllüğü olan birincil avantajından yararlanmasıdır. Protokol ilk olarak Michela Matteoli ve meslektaşları tarafından tanıtıldı ve oldukça etkili olduğu kanıtlandı. Belirli bir protein kordoktisinin aktif sinapslara lokalize olup olmadığını test etmek için kullandım.Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, üç gün boyunca 24 oyuklu bir plakada lameller üzerinde birincil hipokampal hücreleri kültürleyerek başlayın. İndirgenmiş serum ortamını, hücre kültürü ortamını ve damıtılmış suyu su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Steril çalışma koşullarını sağlamak için laminer akış başlığı altında çalışarak, transfeksiyon karışımını 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.İlk olarak, 7.5 mikrolitre iki molar kalsiyum klorürü her bir endotoksin içermeyen DNA'nın dört mikrogramı ile karıştırın. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplam 60 mikrolitre hacme ulaşmak için su ekleyin. Şimdi, karışıma 60 mikrolitre transfeksiyon tamponu ekleyin.En iyi sonuçları elde etmek için, DNA karışımını girdap üzerinde hafifçe çalkalarken transfeksiyon tamponunu damla damla ekleyin. Elde edilen transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca tüpü sallamaktan kaçının.Laminer akış başlığının altında, 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak hücre kültürü ortamını kuyulardan çıkarın, ayrı bir kapta saklayın ve hemen her oyuğa 500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Şartlandırılmış ortamı inkübatörde saklayın. Transfeksiyon karışımı için 20 dakikalık inkübasyon süresi bitene kadar hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.Ardından, birkaç damla pipetleyerek her bir oyuğa 30 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin. Tüpün altındaki kalıntıyı atın. Tüm kuyucuklara transfeksiyon karışımı verildikten sonra, transfeksiyon karışımının ortamda dağılmasını sağlamak için 24 oyuklu plakayı hafifçe sallayın.Şimdi kuyuları 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, transfeksiyon karışımını çıkarın ve atın ve hücreleri hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın. Yıkama aşaması kritiktir.Kuyuyu çıkarıp değiştirerek her bir kuyunun ortamı olmadığı süreyi en aza indirin. Ayrıca, ortamı nazikçe eklediğinizden emin olun. Hücreleri yıkamak için, her bir oyuğa bir mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.Ardından, 750 mikrolitre ortamı çıkarın ve aynı miktarda taze ortam ekleyin. Bu işlemi üç kez tekrarladıktan sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve atın ve şartlandırılmış ortamdan 450 mikrolitre iyice ekleyin. Şimdi nöronların inkübatörde 37 santigrat derece ve %5 CO2'de DIV 10'a kadar olgunlaşmasına izin verin.600 mikrolitre 1X depolarizasyon tamponu ve 10 mililitre hücre kültürü ortamını su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. 1X depolarizasyon tamponuna bir mikrolitre fare Anti-Syt1 antikoru ekleyin ve 10 saniye boyunca girdaplayın. Hücre kültürü ortamını hücrelerden çıkardıktan ve attıktan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre depolarizasyon antikor karışımı ekleyin.Plakayı inkübatörde 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de beş dakika inkübe edin. Depolarizasyon antikoru karışımını çıkarın ve atın ve hücreleri hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın. Her oyuğa bir mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.Ardından, 750 mikrolitre ortamı çıkarın ve aynı miktarda taze ortam ekleyin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. Ardından, hücre kültürü ortamını çıkarın ve atın ve 1X PBS'ye 300 mikrolitre %4 PFA ekleyin.Son olarak, her biri 1X PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkamadan önce dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İkincil floroforla bağlanmış antikoru, her bir kuyucuk için 200 mikrolitre bloke edici tampon içinde bir ila 1.000 seyreltmede seyreltin. Kültürlenmiş nöronlarla birlikte lameller içeren her bir kuyucuktan 1X PBS'yi çıkarın ve atın.Her oyuğa 200 mikrolitre bloke edici tampon antikor karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre 1X PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından, mikroskop lamına yedi mikrolitrelik bir damla gömme ortamı ekleyin.Lameli 24 oyuklu plakadan bir kanül ile kaldırarak ve forseps ile tutarak çıkarın. PBS'yi çıkarmak için lameli damıtılmış suya batırın ve bir kenarını yumuşak bir dokuya dokundurarak dikkatlice kurulayın. Lameli gömme ortamı damlacığının üzerine çevirin, böylece hücreleri taşıyan yüzey mikroskop lamına bakar, böylece hücreleri gömme ortamına gömer.Slaytları kaputun altında bir ila iki saat kurumaya bırakın ve ışığa maruz kalmamak için üzerlerini örtün. Kurutulmuş slaytları dört santigrat derecede bir mikroskop slayt kutusunda saklayın. Syt1 antikorunun floresan olarak işaretlenmiş bir ikincil antikor ile immüno-etiketlemesinden sonra, Syt1 alımının kapsamı son olarak immünosinyal kullanılarak ölçülür.Punktat immünofloresan, görüş alanındaki Syt1 alım bölgelerini gösterir. Bu nedenle bu bölgeler, deney sırasında geri dönüştürülen sinaptik veziküller içerir. Sinaptofizin-mTuruncu floresan, transfekte edilmiş bir nöronun aksonunda sinaptik vezikül birikimlerini gösterir.GFP-Rogdi floresansı, transfekte edilmiş nöronun aksonunda Rogdi birikimlerini gösterir. Deneyin bu kısmı, GFP-Rogdi ve Synaptophysin-mOrange'ın kapsamlı bir şekilde kolokalizasyonunu ortaya koymaktadır, bu da GFP-Rogdi'nin akson içindeki presinaptik bölgelerde biriktiğini düşündürmektedir. Kaplama, GFP-Rogdi ve Synaptophysin-mOrange kobirikimlerinden hangilerinin Syt1 antikor alım bölgeleri ile kolokalize olduğunu ortaya koymaktadır.Oklarla işaretlenen bölgeler, fonksiyonel sinapslarda rekombinant Rogdi ve rekombinant sinaptofizin birikimlerini temsil eder. Protokol, sinaptik kalıntı geri dönüşümünün kapsamını belirlemek için teknik olarak basit bir yol göstermektedir. Bu yöntem, moleküler ve hücresel bilimde, presinaptik sinir terminallerinin belirli bir nöronun bir aksonunda nerede tahsis edildiği ve bu terminallerde rekombinant veya endojen bir ilgilenilen proteinin birikip birikmediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, presinaptik terminallerde sinaptik vezikül geri dönüşümünü izlemek için birçok şekilde kullanılmıştır. Örneğin, adaptif proteinler üzerinde aşırı ekspresyondan sonra nöronlarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü belirlemek için ve ayrıca hayvanlardan veya kök hücre türevli nöronlardan elde edilen nöronlarda kullanılabilir.

an-optical-assay-for-synaptic-vesicle-recycling-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Bu rapor gösteriyor bağlı presinaptik BOUTONS istinat bireysel canlı nöronların mekanik izolasyon için kullanılan bir tekniktir. Vibrodissociated nöronlar, hızlı üretim, mükemmel farmakolojik kontrolü ve komşu hücrelerden etkisi olmadan gelişmiş uzay-klemp avantajlara sahip. Bu yöntem, sinaptik elemanları ve yama klemp kayıt görüntüleme için kullanılabilir.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

Bu video, geri dönüştürülmüş sinaptik veziküllerin optik analizi için kültürlenmiş nöronların hazırlanması prosedürünü göstermektedir. İşlem, sinaptik vezikül proteinlerinin floresan etiketlemesini ve nöronlar içindeki geri dönüştürülmüş vezikülleri etiketlemek ve görselleştirmek için immün boyamayı içerir.

Geri Dönüştürülmüş Sinaptik Veziküllerin Optik Analizi için Kültürlenmiş Nöronların Hazırlanması

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Presynapse oluşumu doğru sırayla sinaptik proteinlerin birikimi de dahil olmak üzere dinamik bir süreçtir. Bu yöntemle, presynapse oluşumu "nöron topu" kültürünün aktik levhalar üzerinde bir presynapse Organizatör protein ile konjuti boncuklar tarafından tetiklenir, böylece Sinapik proteinlerin birikimi presynapse oluşumu sırasında analiz edilmesi kolaydır.

Presynapse oluşum assay kullanarak Presynapse Organizatör boncuk ve "neuron Ball" kültür

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Öğrenin sinaptik vezikül geri dönüşümünü optik analizle değerlendirmeyi, presinaptik protein ekspresyonu kullanarak. Bu yöntem, sinir hücrelerinde protein lokalizasyonunu ve sinaptik plastisiteyi incelemek için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

Daha fazla video keşfet