Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Bu yöntem, yaprak biti kültürü için genel adımları ve yaprak bitlerinin genetik analizi için adımları açıklar. Bu yöntemler, yaprak bitlerinin evrimi ve ekolojisi ile yaprak biti biyolojisinin altında yatan moleküler mekanizmalardaki temel soruları yanıtlamak için uygulanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genellikle çoğu yaprak biti türüne uygulanabilmesi ve nispeten düşük bir maliyetle gerçekleştirilebilmesidir.

Standart bir fide tepsisini çimlenme karışımı toprağı ile doldurarak başlayın ve toprağın kuyuların tepesine ulaşmasına dikkat edin. Tüm kuyular dolduğunda, her kuyunun toprağında üç santimetre derinliğinde bir çukur açın ve her deliğe bir tohum yerleştirin. Tohumları kaplayan toprak dolana kadar hücreleri sulayın ve ılımlı bir toprak nem seviyesini korumak için tepsiyi her gün veya iki günde bir sulama yapılan bir seraya yerleştirin.

Fideler büyüdüğünde, ilk tam yaprak seti, dört inçlik yuvarlak saksıları, kenarlarının yaklaşık beş santimetre altına kadar saksı toprağı ile doldurun. Saksının dibine ulaşacak kadar derin bir toprakta bir bütün oluşturun ve olgun fideleri yeni saksılardaki deliklerin derinliklerine yerleştirmek için elinizle nazikçe toplayın. Daha sonra fideleri toprakla örtün ve ılımlı bir toprak nem seviyesini korumak için fideleri her gün iki günde bir sulayın.

Bitkiler en az üç ila dört set tam yaprak ürettiğinde ve en az on santimetre boyunda olduğunda, bitkileri istenmeyen zararlılara karşı manuel olarak inceleyin ve tek bir üreme tarlasında toplanan yetişkin yaprak bitini ilk bitkinin yaprağına dikkatlice aktarmak için bir ağız pipeti kullanın. Tüm yaprak bitleri transfer edildiğinde, bitkileri özel yapım bir kap kafesle güvenli bir şekilde örtün ve yaprak biti istilasına uğramış bitkileri kontrollü bir ortam odasına yerleştirin. Stok popülasyonlarını korumak için, bir ila üç ikinci veya üçüncü instar nimfleri ve bir yetişkin yaşlı yaprak bitini haftalık olarak yeni bir bitkiye güvenli bir şekilde aktarmak için bir ağız pipeti kullanın.

Ve her bitkiyi gösterildiği gibi kültür için yeni bir fincan kafesi ile örtün. Tek bir yetişkin yaprak bitinden DNA ekstraksiyonu için, yaprak bitini sıvı nitrojen içeren steril 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün dibine yakın bir yere yerleştirin ve yaprak bitini bir havaneli ile öğütün. Daha sonra, mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve ezilmiş yaprak bitini numune gözle görülür şekilde parçalanana kadar öğütmeye devam edin.

Havaneli ilave 100 mikrolitre lizis tamponu ile yıkayın ve öğütülmüş yaprak bitini 65 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, tüpe 14 mikrolitre aemulor potasyum asetat ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Buz üzerinde 30 dakika sonra, hücresel kalıntıları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı, peleti bozmadan yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Süpernatana 200 mikrolitre soğuk yüzde 100 moleküler dereceli etanol ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, çökeltilmiş DNA'yı santrifüjleme ile toplayın ve etanolü pipetle çıkarın. Peletleri 200 mikrolitre soğuk yüzde 70 moleküler dereceli etanol içinde ikinci bir santrifüj yıkaması için hafifçe vurarak yeniden süspanse edin.

Ve peleti 200 mikrolitre taze, soğuk yüzde 100 moleküler dereceli etanol içinde yeniden süspanse edin. Üçüncü santrifüjlemeden sonra, tüpü beş ila on dakika havayla kurutmak için bir kağıt mendil üzerine yatay olarak yerleştirin. Ve DNA peletini 80 mikrolitre düşük tris edta içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, yeniden askıya alınan DNA'yı bir spektrofotometrede ölçün ve kalan örneği dört santigrat derecede saklayın. Gösterildiği gibi sıvı nitrojen içinde beş adede kadar yetişkin yaprak bitini ezdikten sonra, numuneyi bir çeker ocak içine aktarın ve numune tüpüne 800 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Numuneyi bir havaneli ile homojenize edin ve homojenatı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, numuneye 160 mikrolitre kloroform ekleyin, ardından elle 15 saniye kuvvetlice çalkalayın. Ardından, numuneyi oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin ve ekstrakte edilen RNA'yı toplamak için santrifüjleyin. RNA'yı çökeltmek için, sulu fazı ara fazı bozmadan yeni RNS serbest mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RNA'ya 400 mikrolitre izopropanol ekleyin.

Negatif 20 santigrat derecede on dakikalık bir inkübasyondan sonra, çökelmiş RNA'yı santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra, numuneyi dietil pirokarbonat ile muamele edilmiş suda bir mililitre yüzde 75 etanol ile iki kez yıkayın, herhangi bir fenol kirleticisini gidermek için yavaş girdaplama ve santrifüjleme ile numuneye yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, peleti steril bir tezgahta çoğunlukla beş ila on dakika havayla kurutun ve RNA peletini 55 ila 60 santigrat derecede on ila 15 dakikalık bir inkübasyondan önce hafif pipetleme ile 30 mikrolitre ultra saf suda çözün.

Tohumların saksı değişimi yapılacak kadar büyümesi mevsime bağlı olarak yaklaşık iki ila dört hafta sürecektir. Saksı saksı fidelerinin yaprak biti kültürü için en uygun boyuta ulaşması iki ila dört hafta daha sürecektir. Yetişkin aye-near-ee-eye, kararmış bir kauda ile ayırt edilir ve kanatsız veya kanatlı olabilir.

Gelişmekte olan kanat yastıkları, nimfler üçüncü instar'a ulaştığında görünür hale gelir. Tek yetişkin aye-near-ee-eye, mikrolitre DNA başına yaklaşık 100 ila 200 nanogram ve mikrolitre RNA başına 150 ila 300 nanogram verecektir. Farklı tedavi koşulları altında bir aday genin nispi ekspresyonu daha sonra hesaplanabilir.

Bu prosedürü denerken, izo-klonal stoklarınızı kirletmemek önemlidir. Ayrıca, yaprak bitlerinizin kalitesinin büyük ölçüde bitkilerinizin kalitesine bağlı olduğunu unutmayın. Bu prosedürü takiben, yaprak biti biyolojisinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkındaki soruları yanıtlamak için diğer ekstraksiyonlar ve dizileme teknikleri gerçekleştirilebilir.