Name: Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Öğrenin, memeli hücre hatlarını anaerobik koşullarda 17 güne kadar uzun süreli yetiştirme yöntemini. Bu teknik, sitotoksik ajan testleri ve düşük oksijen ortamında hücre fizyolojisi çalışmaları için önemlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Midwestern Üniversitesi araştırma Office ve sponsorlu programlar onların destek için teşekkür ederiz.

1. çeşitli memeli hücre satırlarını anaerobik kültür için ortam hazırlamak
<ol><li>
Anoksik hücre kültür25tam PS-74656 orta yapmak.
	<ol>
<li>17.25 g nitrit 50 ml distile deiyonize su ile çözülerek steril nitrit hisse senedi çözüm (5 M; 100 x) yaptıktan sonra bu sterilize etmek için filtre.</li>
		<li>Nitrit hisse senedi çözüm düşük glikoz DMEM (glikoz 1 g/L) 50 mL başına 0.5 mL 110 mg/L L-glutamine, 584 mg/L sodyum pyruvate ve % 10 fetal Sığır serum ile ekleyin (FBS; ısı-inaktive olur). Not: FBS konsantrasyonu % 10 toksik büyük kullanımı. Not, bir kanser hücre satır test nitrit (MDA-MB-231, meme kanseri hücre satır) ile media için düşük tolerans vardı ve böylece, nitrit, yokluğunda büyüdü. Buna ek olarak, PS-74656 orta test edildi tüm hücre satırlarını büyüme desteklenen rağmen (n = 9), belirli hücre hatları (Örneğin, Vero hücreleri) sergilenen daha yüksek hücre konsantrasyonları ve yüksek glikoz (4,5 g/L) DMEM ile daha yüksek bir canlılık içinde PS-74656 25.</li>
		<li>Orta 20 mL steril 50 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin. Kap sıkın değil; gevşek olmalıdır.</li>
		<li>Orta de-gaz tüp bir vakum çan kavanoza koyarak bir yaklaşık 45 ° açılı orta yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için.</li>
		<li>Bir vakum pompası veya eşdeğeri, oda sıcaklığında kullanarak bir vakum uygulanır. Kabarcıklar artık (24-48 h) gözlenir kadar vakum korumak.</li>
		<li>Kavanozdan tüpü çıkarması ve mühürleme hava giriş Orta içine en aza indirmek için tüp kap, hemen kapatın.</li>
		<li>Tüp ticari anaerobik odasına koyun.</li>
		<li>Tüp kapağı gevşetin ve atmosfer bu en az 24 saat için odasında anaerobik gaz karışımı ile equilibrate için tüp izin vermek. Not: Bu kullanılana kadar orta odasında kalır. Tüp işleminizi, floş hızlandırmak için steril transfer pipet kullanarak anoksik gaz karışımı ile en az 3 x H2, CO2ve N oluşan anoksik gazı ile doldurulmuş2.
</li>
		<li>Tüm borular (10-15 dk) tüp mühürleme ve odasında yerleştirmeden önce yukarıda açıklandığı gibi anaerobik odasında yerleştirilen degas. Kullanmadan, 1.5-2 mL transfer pipetler kullanarak anaerobik gaz karışımı ile temizleme veya en az 3 x ile anoksik temizlenen pipet İpuçları gaz.</li>
		<li>Odasında anaerobik iken, steril degassed mikro-santrifüj tüpü için orta 100 µL kaldırmak ve bir oksijen sondası odası içinde kullanarak çözünmüş oksijen için test edin. Not: Oksijen elektrot kullanmadan üreticinin Protokolü önce kalibre edilmiş. Düzgün bir şekilde degassed ve denge anaerobik gaz karışımı medya okumaları 0. Dikkat: 0.3 ppm oksijen okumaları, orta equilibrate için daha fazla zaman gerekli olduğundan anaerobik odası medyada kuluçkaya devam.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anoksik çeşitli memeli hücre satırlarını tarımı
<ol><li>
Belirlenen gün -1
	<ol>
<li>Hücreler (37 ° C, % 5 CO2) % 90 izdiham hücreleri yeterli sayıda üç 24-şey tabak (% 80 izdiham) sağlamak anoksik ve normoxic kültür kontrolü için bir T150 şişeye büyümeye. Not: Bu çalışma için HeLa 229 ve Vero hücreleri kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı ayrıca test ve büyüme ve yedi diğer hücre hatları25bakımı için başarılı oldu.</li>
		<li>Orta balonun aspirasyon tarafından kaldırmak ve HBSS 10 mL ile yıkayın.</li>
		<li>Orta tripsin 5 mL ile değiştirin. Hücreleri görsel olarak plastik ayırmak kadar şişeye kışkırtmak. Tripsin çoğunu Aspire edin sonra şişeye yapışık hücreleri çıkarmak için dokunun. Yüksek glikoz DMEM 10-15 mL ekleyin (4,5 g/M glikoz, 110 mg/L L-glutamine, % 10 FBS, gentamisin 50 µg/mL) tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için.</li>
		<li>Tüm hücre kümeleri bozulduğu kadar 25 mL pipet kullanarak hücreleri triturate.</li>
		<li>Hücreleri saymak ve standart hemasitometre ve trypan mavi boya hariç tutma yöntemini veya otomatik eşdeğer kullanarak canlılığı belirlemek.</li>
		<li>Yüksek glikoz DMEM hücrelerde askıya alma 105 hücre/mL x 2,24 hücre yoğunluğu için yukarıda belirtildiği gibi.</li>
		<li>24-iyi doku kültürü plaka wells için hücre süspansiyon 1 mL ekleyin (2,24 x 105 hücreleri/iyi; % 80 izdiham). Anoksik kültür ve başka bir denetim normoxic kültür için tohum 1 plaka.</li>
		<li>Normoxic koşulları (%5 CO2) için 24 saat içinde 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Not: Hücreleri çeşitli iyi ölçekli levha kaplama. Bakım tamamen atmosferik gaz temizlemek için icra sürece ancak hücreleri şişeler anoksik büyüme için tohum oksijen getirilmesi riskini sisteme çalışır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Belirlenen gün 0
	<ol>
<li>Normoxic kuluçka 24 saat sonra plakaları anoksik büyüme için anaerobik odasına (ticari anaerobik odası; yerleştirin. Şekil 1).</li>
		<li>Hemen hangi anaerobik odasına 24 h için iklime alıştırılacağı antibiyotik ücretsiz de-gazla PS-74656 orta orta değiştirin. Nemli bir havlu ile bir kapta plaka yerleştirin ve gevşek nem korumak için kapatın. Not: Tabakları normoxic büyüme için aynı şekilde tüm tedaviler atmosferik koşullar altında yapılır özel durum ele alınır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Belirlenen gün 1
	<ol>
<li>Gün 1, anaerobik Kuluçka kuluçka %10 H2, % 10 CO2ve % 80'i N2standart anaerobik gaz karışımı içeren ticari anaerobik odasında 24 saat sonra başlar.</li>
		<li>Hücreleri çeşitli süreler için kuluçkaya.</li>
		<li>Zaman içindeki renk değişimi için anaerobik orta izlemek. Not: Kırmızı-turuncu pembe bir renk kayması zaman orta değiştirmek için sinyal gönderir. Bu gerçekleşmesi için 2 hafta sürebilir. Bir renk vardiya orta kırmızı-turuncu sarı bir bakteriyel kontaminasyon varlığını gösterir.</li>
		<li>Orta için pembe kırmızıdan değiştiğinde, runagate hücreleri tarafından aspirasyon kaldırın.</li>
		<li>Yer degassed ve anaerobik gaz runagate hücrelerde emişli harcanan ortamıyla microfuge tüpler equilibrated, tüpler mühür güvenli ve sonra onları (326 gx; 10 dakika oda sıcaklığında) santrifüj kapasitesi emin yaparken yakın. Hemen iyi emişli ortamı yeni degassed PS-74656 orta 1 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Microfuge tüp pelleted hücrelerle açmadan önce anaerobik odası yerleştirin. Harcanan orta Aspire edin ve taze degassed PS-74656 orta ve 1 ml microfuge tüp toplam hacmi ile değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri tüm tüpünden 24-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda dönün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fenotipik hücre farklılaşması anaerobik kültürlü hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>
Anaerobik odası ise, plaka anaerobik gaz karışımı ile boşaltılan resealable kutusuna yerleştirin ve kutusunu kapatın. Not: Nem ve plaka kurumasını önlemek için nemli kağıt havlu kutusu içermelidir. Onlar ince olduğundan Mikroskopi için sandviç paketi en iyi iş.<ol>
<li>Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek için tamamen çanta mühür ve odasından kaldırın.</li>
		<li>Dikkatle plastik torba plaka üzerinde streç, bir ters faz kontrast mikroskobu ile fotoğraf makinesi eki kullanarak hücreleri incelemek ve photomicrographs farklı büyütme oranlarında al.</li>
		<li>Plaka mühürlü çantada odasına dönün ve kuluçka 2.3.3. adımda anlatıldığı gibi devam etmemiz gerekiyor.</li>
		<li>Süspansiyon içinde olan runagate hücreler ayrı ayrı analiz için 2.3.5. adımda anlatılan adımları izleyin. Not: Bu hücreler daha sonra aerobik test etmek için kullanılabilir veya bu belirli nüfusu testleri için anaerobik odasına döndü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+tumours%3A+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Agents+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11(2013).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li>
<li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+microbiota%3A+its+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li>
<li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI%3A+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423(1977).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1762709/">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li>
<li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+HIF-1%CE%B1+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li>
<li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29alpha%3A+its+protein+stability+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etaypoxia-inducible+factor-1alpha%2C+von+Hippel-Lindau+protein%2C+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li>
<li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307(2017).</li>
<li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/104/1/73">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73(1983).</li>
<li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li>
<li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/281718793_Effect_of_hypoxia_on_toxicity_induced_by_anticancer_agents_in_cardiomyocyte_culture">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li>
<li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li>
<li>Müller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li>
<li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite%3A+NO+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li>
<li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li>
<li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li>
<li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Report%22%5BJournal%5D)">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li>
<li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li>
<li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen%3A+Characterization+of+cell+replication%2C+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li>
<li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li>
<li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li>
<li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen%3A+Characterization+of+cell+replication%2C+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem için uzun bir süre oksijen yokluğu kültürlü ilk memeli hücreleri temsil eder. Geçerli gözlem dayalı, anoksik büyüme özelliği üzerinden fermantatif olmayan bir yol nereye fenotip sapma anaerobik büyüme sonuçlandı memeli hücre hatları28arasında evrensel gibi görünüyor. Bu test tüm hücre hatlarında gözlendi. Anaerobik ekimi ile artan oranlarda hücreleri yuvarlak oldu, süspansiyon gibi nüfus geliştirilen ve çoğaltmak başardık. Orta hücre tipi için belgili tanımlık substrate ekli kal...

Solid tümör, kök hücre nişler ve bu mukozal yüzeylerde astar hücrelerden düşük oksijen düzeylerinde, kanda oksijen azlığı1,2,3,4de dahil olmak üzere ortamlarda adlı biri yok. Normal fizyolojik Birleşik Devletleri, hipoksi, kanda oksijen azlığı (oksijen olmaması)5,6ötesinde oksijenasyonu değişir. Atmosferik oksijen olumsuz memeli hücre çoğaltma etkiler ve o vitro hücre büyümesini tükenmiş oksijen koşullar altında optimize edilebilir gerçekleşme 1970'lerde bildirildi. Richter vd. 7 1-%3 oksijen düzeyleri (hipoksi) kaplama verimliliği ile karşılaştırıldığında atmosferik oksijen (% 20) gelişmiş gösterdi. İnsan diploit hücre ömrü hipoksik kültür koşulları8' de genişletilir.
Vivo, hipoksik koşullar ortaya oksijen depoları tükenmiş (Örneğin, yoğun egzersiz sırasında), olduğunda neyin ATP üretimi fermantasyon (anaerobik solunum) için gelen aerobik solunum kas iskelet ile açık olduğundan laktik asit9son ürünü. Patolojik olarak, kanserli tümörleri, iç içinde kitle için zavallı vaskülarizasyon nedeniyle anoksik hipoksik10tümördür. Tümör iç sınırlı perfüzyon etkisi bağımsız olarak zorunlu anaerobik1tarafından kolonize tümör iç tarafından doğrulanır. Mechanistically, tümör hücre hayatta hipoksi hipoksi-indüklenebilir faktörü 1-alfa Gen ifadesinin yalnızca bağımlı olduğu düşünülmektedir (HIF1-alfa), ilk spontan yanıt hipoksi4,11 olduğu , 12. HIF1-Alfa HIF1bağlamak Isı şok proteinleri tarafından hipoksik koşullarda indüklenen-Alfa organizatörü ve upregulate Gen transkripsiyonu12. Bu ısı şok proteinleri tümör hipoksik microenvironment görülen çeşitli fenotipleri indüksiyon yardım inanılıyor. Bu fenotipleri hücre zarı Glikoz taşıyıcı artan bir ifadesidir ve glikoliz (Warburg etkisi)13oranı sergi. Mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon fermantasyon laktat anahtarından sonucudur.
Anoksik hayatta kalma glikoz hayatta kalma fenomen14,15desteklemek için alternatifler de kullanabilir. En iyi okudu memeli yaklaşık 20 dakika oksijen ile fruktoz tahrik glycolytic fermantasyon yolu14olmadan yaşayabilir kör fare örnektir. Alternatif bir uyum içinde belirli balık oluşur (Örneğin,'önemli ölçüde daha uzun hayatta kalabileceği sazan [Carassius sp.], zaman glikoliz etanol ile terminal yan ürün kullanarak dönemleri)15. Her iki durumda da, fermantasyon oksijen yokluğunda yaşama etkinleştirme metabolizma kullanıyor. Geçerli anoksik hayatta kalmak için bu kadar uzun HIF1hipotezdir-Alfa hipoksi, mitokondrial solunum sırasında aktif oksijen ihtiyacını ortaya çıkar olmadan anaerobik16altında. Ayrıca, hücreleri hücre hayatta kalma17' ye zararlı olarak kanıtlamak olabilir oksidatif stres önlemek bu yana fermantatif bir yol kullanımı hipoksik/anoksik hayatta kalmak için tümör hayatta kalma artırır öne ise. Bu postülatı cardiomyocytes, hipoksi tümör hücre17tarihinde yerleştirilen oksidatif stresi azaltır gösteren bir çalışmada tarafından desteklenmektedir.
Bugüne kadar bir fermantatif yol anoksik memeli hücre hayatta kalmak için temel doğası literatürde, kusura bakma ama, bir yetersizlik kültür memeli hücreleri oksijen 3 günden uzun olmaması için büyük ölçüde kökleşmiş. Ancak, bakteriler glikoliz anaerobik hayatta kalmak için bir alternatif oluşur. Bazı bakteriler, azot veya sülfat (arasında diğer bileşikleri) yokluğunda sitokrom oksidaz sistemi oksijen18elektron alıcısı olarak hizmet verebilir. Her ne kadar son evrensel ortak atadan uzaklaşan beri paralel olarak bakteriyel ve ökaryotik evrim oluştu, bu mitokondri 1.542 milyon yıl önce okyanuslarda19 oxygenation hücrelere enerji sunuyorlardı tahmin edilmektedir . Hücreler zaman oksijen yokluğu 3 gün daha uzun süreler için işlev olabilir varsaymak makul çünkü araştırmacılar izole mitokondri elektron alıcısı olarak nitrit ile oksijen yokluğu ATP üretebilir göstermiştir 20 , 21 , 22 , 23. Bu çalışmada açıklanan metodoloji anaerobik memeli hücre büyüme çok sayıda hücre hatları için bir yardımcı program vardır.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobik odası</td><td>Don Whitley Scientific&nbsp;</td><td>Microbiology International (Mikrobiyoloji Uluslararası</td><td>) Haznenin ön tarafını çıkarabilme özelliği, aletleri portallardan geçirme endişesi olmadan içeriye koymayı kolaylaştırır.</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Davlumbaz</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet yardımcısı</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>steril transfer pipetleri</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc steril konik santrifüj tüpleri</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vakumlu kavanoz</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz (4.5 g / L)</td> <td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM düşük glikoz (1 g / L)</td> <td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>tripsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamisin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>steril pipetler</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi (T75 veya T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu doku kültürü ile muamele edilmiş tabak</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>memnun kilitli sandviç poşetleri</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>ters faz mikroskobu (kamera montajı ile 10, 20 40x objektif)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>tripan mavisi</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemositometre</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin mikrotitre pipetleri</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Klasik Pipet PR-100</td><td></td></tr><tr><td>mikrotitre uçları</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-213233 & sc-201717&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tüpü rafı (50cc tüpler)</td><td>Sodyum</td><td></td> nitrit Sigma HS29050A <td></td>Laboratuvar Deposu</tr><tr><td></td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US</td><td></td></tr><tr><td>kapaklı şeffaf kutular</td><td>Rosti Mepal</td><td>Kauçuk hizmetçi</td><td></td></tr><tr><td>kağıt havlu</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hücre kazıyıcı</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Evde hazırlanan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 70 Etanol Fisher</td><td>Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpleri steril</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>tutuculu biyolojik tehlike torbaları (masaüstü)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitril Eldiven</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oksijen elektrodu</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH ölçüm cihazı</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH kağıdı/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

En mukozal yüzeyler tümörler ve kök hücre nişler degradelerin yanı sıra, anoksik vücudun coğrafi alanlardır. Önceki çalışmalar gösteriyor ki kuluçka normoxic (%5 CO2 havada) içinde veya hipoksik (düşük oksijen düzeyleri) koşulları takip bir anoksik kuluçka (ücretsiz oksijen yokluğu) sonuçlarına göre sınırlı canlılık (2-3 gün). Roman bir metodoloji sağlayan bir anoksik hücre ekimi (en az 17 gün; en uzun süre test için) geliştirilmiştir. En önemli bir özelliği Bu metodoloji, oksijensiz sisteme giriliyor sağlamaktır. Bu medya ve reçeteye göre sarf tüpler, yemekler, şişeler ve pipetler bir anaerobik gaz karışımı (H2, CO2, N2) ile malzeme anoksik (oksijen olmayan) ortamına equilibrate izin vererek takip gaz giderme tarafından elde edilir kullanım öncesinde. Ne zaman elde photomicrographs elde edilen filmler eserler içermediğinden emin olmak için ek bakım uygulanmalıdır. Oksijen yokluğunda, hücre morfolojisi önemli ölçüde değişmiş. İki farklı morphotypes tüm hücreler için anaerobik yetiştirilen belirtilmiştir. Yeteneği büyümeye ve oksijen yokluğu memeli hücreleri korumak için Hücre fizyolojisi, polymicrobial etkileşimleri ve Roman kanser ilaç geliştirme biyosentetik yollar karakterizasyonu analizlerine uygulanabilir.

Bu iletişim kuralı gücünü verdiği destek, uzun ömürlü ve birden çok hücre satırı büyüme ve bir derin değiştirme ve ıraksak evrim süreçleri sonucu hücre morfolojisi25vardır tanıma yatıyor. Bu çalışmanın en önemli unsuru transfer ve sıkı anaerobiosis altında hücrelerin bakımı sağlamaktır. Bu bir anaerobik odası (Şekil 1) iletişim kuralının en üst düzeye çıkarmak için düzenlenen ve hücreleri mikroskopi veya diğer sınama için kaldırıldı gü...

Burada, kurulan hücre hatları anaerobik uzun vadeli ekimi sağlar yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Test edildi en fazla yaşam süresi 17 gün var. Bu yöntem sitotoksik ajanlar test ve anoxically hücreleri çoğaltma Fizyoloji keşfetmek için uygundur.

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Bu yöntem, anoksik hücrelerin fizyolojisini karakterize etmek ve konak patojen etkileşimleri, kök hücre farklılaşması ve kanser hücresi metastazı ve terapötik duyarlılık ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu, memeli hücrelerinin uzun süreli anoksik kültivasyonunu sağlayan ilk tarif edilen protokoldür. Bu tekniğin etkileri, hedefe yönelik, kişiselleştirilmiş kanser tedavisine ve gençleştirici tedaviye kadar uzanır, çünkü oksijen toksisitesi nedeniyle, çoklu hücre tipleri büyüme için düşük oksijenli ortamları tercih eder.Bu yöntem, hücre anaerobik solunumu ve metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, kök hücre ekimi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü oksijen kontaminasyonunu önlemek için çok dikkatli olunmalıdır. Oksijen kontaminasyonunu dışlamak için gereken özen sezgisel olmadığı için bu yöntemin fiziksel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Başlamak için, L-glutamin, sodyum piruvat ve fetal sığır serumu içeren düşük glikozlu DMEM'e 0.5 mililitre nitrit stok çözeltisi ekleyin. Daha sonra 20 mililitre besiyerini steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne yerleş

anaerobic-growth-and-maintenance-of-mammalian-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In vitro sistemi değiştirilmiş 3-D sulandırılmış bazal membran birçok tümör hücre hatlarının büyüme özellikleri tümör hücrelerinin metastatik ikincil site uykuda veya proliferatif davranışı ile ilişkili...

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

Pnömatik bir biyoreaktör kullanarak, memeli hücrelerinin büyümesi için bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin montajını, çalışmasını ve performansını gösteriyoruz.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Sürekli büyümeye göre ayarlanmış besleme kullanan besin düzenlemesi, karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörlerindeki kültürler için aralıklı toplu beslemeye kıyasla memeli hücre sferoidlerinin büyüme oranlarını iyileştirir.  Bu çalışma, basit düzeltilmiş oranlı beslenen kültürlerin oluşturulması için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Kültürlü primer veya kurulan hücre hatları yaygın hayvan modelleri kullanmadan önce bir ilk yaklaşım olarak temel biyolojik ve mekanik soruları ele almak için kullanılır. Bu protokol, çinko (Zn) ve Atom emici spektroskopisi ile diğer iz elemanlarının çalışmaları için tüm hücre özler ve hücre altı fraksiyonları hazırlamak açıklamaktadır.

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Bu protokol, çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek ve hızlı oksijen salınımları altında mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için bir yöntem sunar. Cihazın performansı, sıvı kanallarında oksijen algılama ve mikrobiyal yetiştirme yoluyla doğrulandı.

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Bakteri popülasyonlarının sürekli düşük besinli koşullarda (yüzlerce nanomolar konsantrasyona kadar) veya geçici besin dalgalanmaları altında küçük bir zaman ölçeğinde yetiştirilmesini sağlayan milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD) için bir protokol sunuyoruz.

Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

Öğrenin, memeli hücre hatlarını anaerobik koşullarda 17 güne kadar uzun süreli yetiştirme yöntemini. Bu teknik, sitotoksik ajan testleri ve düşük oksijen ortamında hücre fizyolojisi çalışmaları için önemlidir.

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Daha fazla video keşfet