Name: Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Keşfedin, drop-off ddPCR yöntemiyle kanser tanısında dolaşım tümör DNA'sını analiz etmeyi. Bu teknik, tek reaksiyonda çoklu mutasyon tespiti yaparak değerli hasta örneklerini korur ve tümör yükü hakkında bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Institut Curie SiRIC (grant Inca-DGOS-4654) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Caroline Hego video onun katkılardan ötürü teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Birden çok yazar ctDNA algılama ile ilgili iki patent başvuruları (EP17305920.5, EP18305277.8) mucitler adlandırılır.

Bir verimli teslimat ddPCR tahlil tasarlamak için optimizasyon çok önemli ve protokol dikkatle izlenmesi gerekir. Astar ve sondalar her birleşimi bir benzersiz PCR reaksiyon verimlilik vardır. Böylece, bir tek tek tahlil dikkatli bir şekilde kontrol örnekleri üzerinde değerli test örnekleri üzerinde kullanılmadan önce doğrulanması gerekiyor. En iyi duruma getirme ve doğrulama en yüksek sinyal algılama tasdik ve özgüllük ve duyarlılık değerlendirmek önemlidir. İletişim kuralında açıklandığı gibi "yoklama 2" ile kaplı bir ...

Somatik mutasyon kanser geliştirilmesi için ilgili binlerce bildirilen1olmuştur. Bunlar arasında birkaç akıllı işaretleri etkinliğinin hedefe yönelik tedavi 2,3 ve şimdi rutin klinik pratikte bu mutasyonlar eleme genetik. Damlacık dijital PCR (ddPCR) teknoloji olup mutasyonların yüksek algılama hassasiyeti ile izlemek için kullanılan ve non-invaziv sıvı biyopsi4,5ile son derece uyumludur. Ancak, geçerli ddPCR deneyleri öncelikle bir prioribilinen mutasyonlar algılamak için tasarlanmıştır. Mutasyon bilinmeyen olduğunda bu ciddi bir şekilde ddPCR bir keşif aracı olarak kısıtlar. Nitekim, geleneksel ddPCR tasarımında, vahşi tipi gen (WT sonda) tanıma bir hidroliz sonda mutant gen (MUT sonda) (Şekil 1A) tanıma belirli bir sonda ile buz dansında yarışmaktadır. Sonda daha yüksek benzeşimli şablona hybridizes ve karşılık gelen alleli niteliği gösteren onun fluorophore serbest bırakır. Her damla için elde edilen floresan veriler farklı boyutta WT ve MUT probları tarafından yayılan floresans temsil eden bir dağılım çizim olarak görüntülenmeyecektir. Geleneksel ddPCR tahlil için tipik bir sonuç şematik gösterimi Şekil 1Aile sunulur. Örneğin, mavi bulut ise kırmızı bulut içinde MUT alleli edilmiş amplifikatör ve MUT sondası tarafından tanımlanan damlacıkları karşılık gelen WT sondası tarafından tanımlanan WT gen içeren damlacıklar karşılık gelir. Tepki olarak yüklenen DNA miktarı bağlı olarak, Çift Kişilik olumlu damlacıkları WT ve MUT amplicons içeren (yeşil bulut) görünebilir. Işık gri bulut için boş damlacıkları karşılık gelir.
Fluorophores (genellikle 2, 5'e kadar ama) sınırlı sayıda tespiti için en platformlar izin beri geleneksel ddPCR-den geçerek sınırlıdır. Bu nedenle, birden çok bitişik mutasyonlar bölgeleriyle hedefleme Teknik olarak çok katmanlı ddPCR deneyleri veya birden çok tepkiler her mutasyon paralel hedefleme kullanımı zor tasarım gerektirir. Teslimat ddPCR strateji gibi potansiyel olarak WT hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak bir hedef bölge içinde herhangi bir genetik değişiklik tespit edebilen bu sınırlamanın üstesinden gelir. Hedef bölge ve ikinci sonda (sonda 2) bitişik olmayan değişken sıra mutasyonlar nerede hedef bölge WT dizisi tamamlayıcı ilk sonda (sonda 1) kapsar (Şekil 1B) bekleniyor. İlk sonda tepki amplifiable molekülleri toplam miktarı quantifies iken, ikinci sonda WT ve MUT allelleri mutant sıralarını alt-optimal hibridizasyon tarafından ayrımcılık. Sonda 2 hedef bölge (tek veya birden fazla nükleotit oyuncu değişikliği, silme vb.)6' mutasyonların birden çok türü tanımlayabilirsiniz. Geleneksel ddPCR olduğu gibi hafif gri bulut yok DNA molekülleri içeren damlacıklar karşılık gelir. Bu tür tahlil, en uygun WT ve MUT bulutlar ayrılması WT ve MUT hedef gen içeren damlacıklar sadece WT içeren damlacıklar ayırt edemez beri tepki olarak yüklenen DNA miktarına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir formu. Bu nedenle, bu tahlil çoğu damlacıkları hedeflenen gen birden fazla kopyasını içermesini gerektirir.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA tüpü (renk kodu: lavanta)</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA tüpleri, tam kan veya EDTA plazma örneği elde etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit Kiti (manuel protokol)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>İnsan plazmasından serbest dolaşımdaki DNA'nın izolasyonu için</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Dolaşımdaki DNA Kiti (otomatik protokol)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>İnsan plazmasından serbest dolaşan DNA'nın izolasyonu için</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP sistemi</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>cfDNA, DNA veya RNA saflaştırması için tam entegre ve otomatik sistem</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Aynı anda 24 cfDNA'ya kadar saflaştırma için</td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td> Qubit florometre, DNA QX100 veya QX200 okuyucu Bio-Rad'ın <td>nicelleştirilmesi için bir tezgah üstü florometredir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Sırasıyla 186-3003 veya 186-4003 Okuyucu,</td><td>her damlacığın floresan yoğunluğunu ölçer ve damlacıklar dedektörü geçerken boyutu ve şekli algılar</td></tr><tr><td>QX100 veya QX200 damlacık jeneratörü</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 veya 186-4002, sırasıyla</td><td>Damlacık üretimi için kullanılan cihaz</td></tr><tr><td>C1000 termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Modüler termal döngüleyici platformu, C1000 Touch termal döngüleyici şasisi, 96 kuyulu hızlı reaksiyon modülü</td></tr><tr><td>Plaka kapatıcı</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1 ve ticaret; PCR plaka kapatıcı</td></tr><tr><td>DG8 kartuş tutucu</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Damlacık üretimi için DG8 kartuşunu cihaza yerleştirir ve tutar</td></tr><tr><td>Damlacık üreteci kartuşları ve contaları</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Damlacıklar oluşturmak için numune ve yağı karıştırmak için kullanılan mikroakışkan DG8 kartuşu; DG8 contaları, buharlaşmayı önlemek ve damlacık oluşumu için gereken basıncı uygulamak için kartuşu kapatır</td></tr><tr><td>PCR süper karışımı</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR problar için süper karışım (dUTP yok)</td></tr><tr><td>96 kuyucuklu PCR plakaları</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96 kuyucuklu yarı etekli plakalar</td></tr><tr><td>Folyo conta</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Delinebilir folyo ısı yalıtımı</td></tr><tr><td>ddPCR Damlacık Okuyucu Yağı</td><td>Bio-Rad</td><td>Okumada kullanılan</td> <td>186-3004</td> yağ</tr><tr><td>Problar için Damlacık Oluşturma Yağı</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>damlacık üretimi için yağ</td></tr><tr><td>DNA loBind Tüpü 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Tüpleri, numuneden yüzeye bağlanmayı önemli ölçüde azaltarak numune geri kazanımını en üst düzeye çıkarır</td></tr><tr><td>Multipleks I cfDNA Referans Standart Seti</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Multipleks I cfDNA Referans Standartları, somatik mutasyonları tespit eden cfDNA testlerinin performansını değerlendirmek için kullanılan, yüksek karakterli, biyolojik olarak ilgili referans materyalleridir</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS TEST KITI, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>HS testi, RNA'ya göre çift sarmallı DNA (dsDNA) için oldukça seçicidir ve 10 pg/&mikrodan itibaren ilk numune konsantrasyonları için doğru olacak şekilde tasarlanmıştır; L ila 100 ng/&mikro; L</td></tr><tr><td>Qubit Test Tüpleri</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit tahlil tüpleri 500 & L Qubit Florometre ile kullanım için ince duvarlı polipropilen tüpler</td></tr></tbody></table>

tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) örnek ayırma yağı su bireysel tepkiler nano ölçekli binlerce içine temel bir son derece hassas nicel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemidir. Son zamanlarda, ddPCR tümör DNA (ctDNA) algılama dolaşan için en doğru ve hassas araçlarından biri haline gelmiştir. Her olası allelic sürüm tanıma belirli hidroliz probları gerektiğinden bir standart ddPCR tekniği önemli sınırlamaları tepki ekranlı mutasyonlar kısıtlı sayısıdır. Probları algılamak ve potansiyel olarak tüm genetik değişiklikler hedeflenen bölgede ölçmek için yalnızca tek bir çift gerektirdiğinden alternatif bir metodoloji, teslim ddPCR, üretilen iş, artırır. Teslimat ddPCR geleneksel ddPCR deneyleri mutasyonlar daha fazla sayıda tek bir reaksiyonu tespit avantajı ile karşılaştırılabilir duyarlılık görüntüler. Düşük maliyetli, değerli örnek malzeme tasarrufu ve mutasyonlar bir prioribilinen değil aynı zamanda bir keşif aracı olarak kullanılabilir.

Bir kanıtı-of-concept çalışmada, KRAS exon 2 mutasyonlar (kodon 12 ve 13) ve EGFR exon 19 silme FFPE doku ve teslimat ddPCR strateji6kullanarak kanserli hastalarda plazma örnekleri incelenmiş.
KRAS teslimat sonda hangi insan kanser11bilinen KRAS mutasyonların % 95'den fazla liman birden çok mutasyonların exon 2 KRAS gen kapsayan 16 bir b...

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Bu yöntem, kanser için dolaşan tümör DNA analiz etmek için bir tanı aracı olarak kullanılabilir. Bu teknik, küme mutasyonlarının olduğu bölgelerdeki çoklu genetik değişimi tek bir reaksiyonda sorgular. Bu değerli hasta örnekleri kaydetmek için yardımcı olur.Bu yöntem, mutasyonprofilindeki tümör yüküne ışık verebilir. Artık nükleik asit hedef dizilerinin mutlak bir nicelikselleştirilmesini elde etmek için qPCR'ye alternatif olarak moleküler analize de uygulanabilir. Yedi mililitreLIK EDTA tüplerinde kan örneği toplayın.Plazma yaklaşık dört mililitre toplamak için iki tüp tavsiye edilir. Kan örneklerini kırmızı kan hücrelerini, beyaz kan hücrelerini ve plazmayı ayırmak için kan çekildiklerinden sonraki üç saat içinde 820 kat yer çekiminde 10 dakika santrifüj edin. Örnekleme ve santrifüj arasındaki zaman beyaz kan hücrelerinden salınan DNA ile kontamine olmayan yüksek dereceli, T-hücre içermeyen DNA elde etmek için önemlidir.Santrifüjden sonra, beyaz kan hücresi tabakasına dokunmadan supernatant toplamak için bir serolojik pipet kullanın. Plazma yaklaşık iki mililitre genellikle EDTA tüp başına kurtarılır. Plasms iki mililitre tüpler aktardıktan sonra, hücre enkaz kaldırmak için 10 dakika boyunca 16, 000 kez yerçekimi 10 dakika aliquots santrifüj.Dikkatle pelet rahatsız etmeden plazma toplamak ve iki mililitre kriyojenik tüplere transfer. İhtiyaç duyulana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. 50 mililitrelik bir tüpe 400 mikrolitre proteinaz K ekleyerek başlayın.Daha sonra, ekstraksiyon kitinden bir mikrogram taşıyıcı RNA içeren dört mililitre plazma ve 3,2 mililitre ACL lysis tampon ekleyin. Homojen bir çözüm elde etmek için tüpü kapatın ve 30 saniye girdap yaparak karıştırın. Sonra, 60 derecede 30 dakika kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra, silika zarına dolaşan nükleik asitlerin bağlanmasını optimize etmek için lysate'ye 7,2 mililitre tampon ACB ekleyin. 15-30 saniye girdap tarafından karıştırın. Sonra, beş dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka.Vakum pompası üzerine sütun ve 20 mililitre genişletici takın. Vakum aspirasyonuna izin vermek için kullanılmayan kısımları kapatın. Tüpü kısa bir süre santrifüj ettikten sonra, karışımı dikkatlice tüp genişleticiye tanıtılın.Daha sonra vakum pompasını açın ve lysate'nin kolonlar üzerinden tamamen çekilmesini bekleyin. Tüp genişleticisini çıkarın ve atın. Ardından, sütuna 600 mikrolitre arabellek ACW1 uygulayın.Tampon ACW1 sütun aracılığıyla çizilmiş olduğunda, ACW2 tampon 750 mikrolitre ekleyin, ve son olarak, 96 ila% 100 etanol 750 mikrolitre. Daha sonra, etanol ortadan kaldırmak için üç dakika boyunca tam hızda temiz bir iki mililitrelik toplama tüpü ve santrifüj sütun yerleştirin. Yeni bir iki mililitrelik toplama tüpü içine sütun yerleştirdikten sonra, kapağı açın ve sonra 56 derece santigrat kadar 10 dakika boyunca membran tamamen kuru.Kuluçkadan sonra, kolontemiz bir 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüp içine yerleştirin. %0,04 sodyum azit ile 36 mikrolitre RNase içermeyen suyu dikkatlice uygulayın. Daha sonra kapağı kapatın ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatın.Nükleik asitleri ejelemek için bir dakika boyunca tekrar tam hızda santrifüj. Sonra, negatif 20 santigrat derecede gerekli kadar saklayın. Reaksiyon bileşenlerini temiz bir PCR kaputunda oda sıcaklığına kadar eriterek ve dengeleyerek başlayın.Daha sonra 18 mikromolar konsantrasyonda her astar ve beş mikromolar konsantrasyonda her prob ile RNase ve Dnase içermeyen distile su astar ve prob 20 kez karışımı hazırlayın. Tüm bireysel PCR reaksiyonları için, iki kez ddPCR Supermix 10 mikrolitre birleştirerek bir örnek karışımı hazırlamak, 20 kez astar ve prob karışımı bir mikrolitre, ve distile su 20 mikrolitre DNA örneği 10 nanogram kadar. Homojenliği sağlamak için reaksiyon karışımını iyice girdap.Ve kısaca dağıtımdan önce tüpün altındaki içeriği toplamak için santrifüj. DdPCR kartuşunu tutucuya takın ve damlacık üretimi için kartuşun orta kuyularına 20 mikrolitre numune reaksiyon karışımı yükleyin. Alt kuyulara 70 mikrolitre damlacık jeneratör yağı ekleyin.Damlacık jeneratörüne bir conta ile kartuş yerleştirin. Damlacıklar kartuşun üst kuyularında üretilecektir. Kartuşlardan damlacıkların 40 mikrolitresini yavaşça ve yavaşça aspire edin ve 96 kuyulu bir PCR plakaya yerleştirin.Buharlaşmayı önlemek için damlacıkları aktardıktan hemen sonra bir plaka mühürleyici kullanarak alüminyum folyo ile son PCR plaka mühürleyin. Kısaca kuyuların altındaki içeriği toplamak için plaka santrifüj. Bir termal döngüc üzerinde geleneksel bir PCR amplifikasyonu çalıştırın.Çalışma tamamlandığında, kuyuların altındaki içeriği toplamak için plakayı kısaca santrifüj edin. PCR amplifikasyonundan sonra, üreticinin talimatları doğrultusunda PCR pozitif ve PCR negatif damlacıkları saymak için damlacık okuyucuyu kullanın. Aşağıda, ddPCR testinin en iyi duruma getirilmesi sırasında elde edilen temsili sonuçlar vesonuçlar vermiştir.Bu görüntü, mutant DNA ve yabani dna'nın %100 mutant DNA, %5 mutant DNA ve %100 vahşi dna içeren bir reaksiyonda tespitini gösteriyor. Bu resim, KRAS ve EGFR drop-off ddPCR tahlilleri ile analiz edilen plazma örneklerinin örneklerini gösterir ve bu örnekler, kras'ın iki sinde tek nükleotit ve çoklu ikamelerin saptandığını ve EGFR ekson 19'da bir silme işlemini gösterir. Bu yordamı denerken, bu yöntemin kritik bir adımdır damlacık nesil, özel bir dikkat ile her adımda dikkatli bir şekilde devam etmek önemlidir.Bu teknik, geliştirildikten sonra, sıvı biyopsi kullanarak tümör mutasyon analizini optimize etmek için kanser araştırmaları alanında araştırmacı ve klinisyen için yol açmıştır.

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu video, bir DNA örneğindeki indel mutasyonunu tanımlamada dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun rolünü göstermektedir. ddPCR'nin yüksek hassasiyeti ve hassasiyeti, düşük seviyelerde bile bir numunede bulunan nadir mutasyonların doğru ve tutarlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Genomun farklı bölgelerindeki indel mutasyonlarını tanımlayabilir ve ölçebilir, mutasyon mekanizmaları ve bu mutasyonların işlevsel sonuçları hakkında değerli bilgiler sağlar.

Hedef Genlerde Indel Mutasyonu Tespiti için Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Bu video, klinik tanı ve prognoz için erken bir biyobelirteç olarak farklı beyaz kan hücresi popülasyonlarında metillenmiş DNA bölgelerinin eş zamanlı olarak ölçülmesi için multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu tekniğini göstermektedir.

Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Dijital polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid türevleri ve DNA kopyalama numara türevleri yüksek-duyarlı tespiti için yararlı bir araçtır. Burada, biz insan genomu digital PCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak nadir versiyonlarında ölçmek için kritik noktalar göstermek.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Keşfedin, drop-off ddPCR yöntemiyle kanser tanısında dolaşım tümör DNA'sını analiz etmeyi. Bu teknik, tek reaksiyonda çoklu mutasyon tespiti yaparak değerli hasta örneklerini korur ve tümör yükü hakkında bilgi sağlar.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Daha fazla video keşfet