Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Bu yöntem, kanser için dolaşan tümör DNA analiz etmek için bir tanı aracı olarak kullanılabilir. Bu teknik, küme mutasyonlarının olduğu bölgelerdeki çoklu genetik değişimi tek bir reaksiyonda sorgular. Bu değerli hasta örnekleri kaydetmek için yardımcı olur.

Bu yöntem, mutasyonprofilindeki tümör yüküne ışık verebilir. Artık nükleik asit hedef dizilerinin mutlak bir nicelikselleştirilmesini elde etmek için qPCR'ye alternatif olarak moleküler analize de uygulanabilir. Yedi mililitreLIK EDTA tüplerinde kan örneği toplayın.

Plazma yaklaşık dört mililitre toplamak için iki tüp tavsiye edilir. Kan örneklerini kırmızı kan hücrelerini, beyaz kan hücrelerini ve plazmayı ayırmak için kan çekildiklerinden sonraki üç saat içinde 820 kat yer çekiminde 10 dakika santrifüj edin. Örnekleme ve santrifüj arasındaki zaman beyaz kan hücrelerinden salınan DNA ile kontamine olmayan yüksek dereceli, T-hücre içermeyen DNA elde etmek için önemlidir.

Santrifüjden sonra, beyaz kan hücresi tabakasına dokunmadan supernatant toplamak için bir serolojik pipet kullanın. Plazma yaklaşık iki mililitre genellikle EDTA tüp başına kurtarılır. Plasms iki mililitre tüpler aktardıktan sonra, hücre enkaz kaldırmak için 10 dakika boyunca 16, 000 kez yerçekimi 10 dakika aliquots santrifüj.

Dikkatle pelet rahatsız etmeden plazma toplamak ve iki mililitre kriyojenik tüplere transfer. İhtiyaç duyulana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. 50 mililitrelik bir tüpe 400 mikrolitre proteinaz K ekleyerek başlayın.

Daha sonra, ekstraksiyon kitinden bir mikrogram taşıyıcı RNA içeren dört mililitre plazma ve 3,2 mililitre ACL lysis tampon ekleyin. Homojen bir çözüm elde etmek için tüpü kapatın ve 30 saniye girdap yaparak karıştırın. Sonra, 60 derecede 30 dakika kuluçkaya yat.

Kuluçkadan sonra, silika zarına dolaşan nükleik asitlerin bağlanmasını optimize etmek için lysate'ye 7,2 mililitre tampon ACB ekleyin. 15-30 saniye girdap tarafından karıştırın. Sonra, beş dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka.

Vakum pompası üzerine sütun ve 20 mililitre genişletici takın. Vakum aspirasyonuna izin vermek için kullanılmayan kısımları kapatın. Tüpü kısa bir süre santrifüj ettikten sonra, karışımı dikkatlice tüp genişleticiye tanıtılın.

Daha sonra vakum pompasını açın ve lysate'nin kolonlar üzerinden tamamen çekilmesini bekleyin. Tüp genişleticisini çıkarın ve atın. Ardından, sütuna 600 mikrolitre arabellek ACW1 uygulayın.

Tampon ACW1 sütun aracılığıyla çizilmiş olduğunda, ACW2 tampon 750 mikrolitre ekleyin, ve son olarak, 96 ila% 100 etanol 750 mikrolitre. Daha sonra, etanol ortadan kaldırmak için üç dakika boyunca tam hızda temiz bir iki mililitrelik toplama tüpü ve santrifüj sütun yerleştirin. Yeni bir iki mililitrelik toplama tüpü içine sütun yerleştirdikten sonra, kapağı açın ve sonra 56 derece santigrat kadar 10 dakika boyunca membran tamamen kuru.

Kuluçkadan sonra, kolontemiz bir 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüp içine yerleştirin. %0,04 sodyum azit ile 36 mikrolitre RNase içermeyen suyu dikkatlice uygulayın. Daha sonra kapağı kapatın ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatın.

Nükleik asitleri ejelemek için bir dakika boyunca tekrar tam hızda santrifüj. Sonra, negatif 20 santigrat derecede gerekli kadar saklayın. Reaksiyon bileşenlerini temiz bir PCR kaputunda oda sıcaklığına kadar eriterek ve dengeleyerek başlayın.

Daha sonra 18 mikromolar konsantrasyonda her astar ve beş mikromolar konsantrasyonda her prob ile RNase ve Dnase içermeyen distile su astar ve prob 20 kez karışımı hazırlayın. Tüm bireysel PCR reaksiyonları için, iki kez ddPCR Supermix 10 mikrolitre birleştirerek bir örnek karışımı hazırlamak, 20 kez astar ve prob karışımı bir mikrolitre, ve distile su 20 mikrolitre DNA örneği 10 nanogram kadar. Homojenliği sağlamak için reaksiyon karışımını iyice girdap.

Ve kısaca dağıtımdan önce tüpün altındaki içeriği toplamak için santrifüj. DdPCR kartuşunu tutucuya takın ve damlacık üretimi için kartuşun orta kuyularına 20 mikrolitre numune reaksiyon karışımı yükleyin. Alt kuyulara 70 mikrolitre damlacık jeneratör yağı ekleyin.

Damlacık jeneratörüne bir conta ile kartuş yerleştirin. Damlacıklar kartuşun üst kuyularında üretilecektir. Kartuşlardan damlacıkların 40 mikrolitresini yavaşça ve yavaşça aspire edin ve 96 kuyulu bir PCR plakaya yerleştirin.

Buharlaşmayı önlemek için damlacıkları aktardıktan hemen sonra bir plaka mühürleyici kullanarak alüminyum folyo ile son PCR plaka mühürleyin. Kısaca kuyuların altındaki içeriği toplamak için plaka santrifüj. Bir termal döngüc üzerinde geleneksel bir PCR amplifikasyonu çalıştırın.

Çalışma tamamlandığında, kuyuların altındaki içeriği toplamak için plakayı kısaca santrifüj edin. PCR amplifikasyonundan sonra, üreticinin talimatları doğrultusunda PCR pozitif ve PCR negatif damlacıkları saymak için damlacık okuyucuyu kullanın. Aşağıda, ddPCR testinin en iyi duruma getirilmesi sırasında elde edilen temsili sonuçlar vesonuçlar vermiştir.

Bu görüntü, mutant DNA ve yabani dna'nın %100 mutant DNA, %5 mutant DNA ve %100 vahşi dna içeren bir reaksiyonda tespitini gösteriyor. Bu resim, KRAS ve EGFR drop-off ddPCR tahlilleri ile analiz edilen plazma örneklerinin örneklerini gösterir ve bu örnekler, kras'ın iki sinde tek nükleotit ve çoklu ikamelerin saptandığını ve EGFR ekson 19'da bir silme işlemini gösterir. Bu yordamı denerken, bu yöntemin kritik bir adımdır damlacık nesil, özel bir dikkat ile her adımda dikkatli bir şekilde devam etmek önemlidir.

Bu teknik, geliştirildikten sonra, sıvı biyopsi kullanarak tümör mutasyon analizini optimize etmek için kanser araştırmaları alanında araştırmacı ve klinisyen için yol açmıştır.