Name: En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Öğrenin tavşan modelinde laparoskopik embriyo transferi ve vitrifikasyon protokolü kullanarak üreme biyolojisi araştırmaları için etkili yöntemler. Bu teknikler insan üremesi çalışmalarına değerli katkılar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ekonomi Bakanlığı ve Ispanya 'nın rekabet gücü (AGL2017-85162-C2-1-R) ve Generalitat Valenciana araştırma programı (PrometeoII 2014/036) fonları tarafından destekleniyordu. N. Macowan Ingilizce dil hizmeti tarafından revize İngilizce metin sürümü

Bu çalışmada kullanılan tüm deneysel prosedürler, hayvan deneyleri için 2010/63/EU EEC Direktifi uyarınca yapılmıştır ve Universitat Politècnica de València hayvanlarıyla deneyler için Etik Komite tarafından incelenip onaylanmıştır. İspanya (araştırma kodu: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC ve JSV hayvanlar üzerinde deney için Valencian devlet idaresi tarafından verilen bir yetkilendirme belgesi tutar. XGD, deney sırasında hayvanların refahı ve bakımını denetlemek için yetkilidir.
1. embriyo transferi
<ol><li>Alıcı kadınların hazırlanması
	<ol>
<li>Sadece cinsel Olgun kadın kullanın (&gt; 4,5 ay).</li>
		<li>ET 'den bir hafta önce, kadınların foliküler büyüme ve geliştirilmiş kadın reseptifinin başlatılması için 16 h ışık/8 h karanlık rejime adapte edilmesi.</li>
		<li>Vulva 'nın türinliği ve rengini gözlemlemek için alıcı kadınları seçin. Vulva abartılı ve kırmızımsı ise, dişi çok anlayışlı.</li>
		<li>1 μg buserelin asetat (gonadotropin-serbest hormon sentetik analog) ne olursa olsun vücut ağırlığı tek bir intramusküler enjeksiyon tarafından pseudohamilelik (yumurtlama) neden. Not: normal olarak, 0,8 μg orta boy tavşanlar (4-5 kg) yumurtlama indüksiyonu için uygun bir dozdur, bu nedenle 1 μg genellikle yumurtlama garantisi verir.</li>
		<li>Embriyolar yaşı olarak önceden (örneğin, taze Morula ET önce 70-72 h) transfer edilecek birçok gün olarak yumurtlama neden.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestezi ve analjezi
	<ol>
<li>Tavşan tartmak ve aşağıdaki anestezik ve analjezikler yükleyin.<ol>
<li>30G iğne ile 1 mL şırınga: yük xylazine (5mg/kg) ve buprenorfik hidroklorür (0,03 mg/kg). Bir başka 1 mL şırınga ile 23G Perikranial iğne, yük ketamin hidroklorür (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tavşan tutun ve xylazine-buprenorfik karışımı intramuscularly enjekte.</li>
		<li>Marjinal kulak damarında ketamin ile Perikranial iğne takın, yavaş yavaşça tüm şırınga içeriği intravenöz olarak tanıtmak.</li>
		<li>İğne düzeltmek ve gerekirse daha fazla anestezi yönetmek için kalan adımlar boyunca takılı bırakın.</li>
		<li>Sıcak bir aşamada (temiz ve başka hayvanlar olmadan) kafeste tavşan bırakın.</li>
		<li>Bir kez bilinçsiz, göz kuruluğu önlemek ve palpebral Freflex yokluğunda kontrol etmek için göz merhem uygulayın. Not: Bu protokol en az 30 dakika boyunca cerrahi anestezi uçağı sağlar. Daha uzun bir süre gerekiyorsa, 30 dakika sonra 1.2.1 'de açıklanan ketamin hidroklorür miktarının yarısında ek dozajlar enjekte.</li>
		<li>Pedallı refleks ve solunum hareketini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin. Solunum düzeninde düzensiz ve daha hızlı bir hızda yapılan değişiklikler, uygun anestezi düzleminin kaybını gösterir.</li>
		<li>Mukoza zarlarının rengini (gözler, dudaklar, vb.), solunum hızı (dakika başına 30-60 nefes), kalp hızı (dakika başına 120-325 Beats) ve rektal sıcaklığa (38-39,6 °c) izleyin.</li>
		<li>Transferden sekiz saat önce, ET süreci bitene kadar daha fazla bağırsak boyutunu ve etkinliğini önlemek için hayvanlardan yiyecek tutma. Suya ücretsiz erişim bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyo hazırlama
	<ol>
<li>Embriyo manipülasyon medyasını 25 °C ' ye ısıtın: Dulbecco 'nun fosfat-tamponlu tuzlu (DPBS) ' den oluşan temel Orta (BM), Sığır serum albumin% 0,2 (w/v) ile desteklenmektedir.</li>
		<li>Stereomikoskop altında çalışmak, taze veya çözülmüş (adım 2) embriyoları BM ile durulayın.</li>
		<li>Steril eldiven kullanarak, 1 mL şırıngaya uygun şekilde yapılandırılmış 17G epidural kateter takın.</li>
		<li>Kateter içine 1 cm BM aspirate, küçük bir hava balonu izledi.</li>
		<li>10 μL BM hacmi içinde 5-7embriyo aspirate, başka bir küçük hava balonu izledi.</li>
		<li>1 cm BM aspirasyon ile kateteri yüklemeyi tamamlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyo transferi
	<ol>
<li>Aseptik bir ortam sağlamak için steril eldiven, elbise ve maske kullanımını düşünün.</li>
		<li>Cerrahi aletleri sterilize edin, ameliyatın gerçekleştirileceği yüzeyleri temizleyin ve% 70 etanol ile silin.</li>
		<li>Daha önce ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin (adım 1,2), refleksleri kaybı kontrol.</li>
		<li>Bir elektrikli jilet ile ventral karın kürk tıraş.</li>
		<li>Ventral karın aseptically hazırlayın.<ol>
<li>Cerrahi alanı temizleyin ve kalan saçları çıkarın. Cerrahi bölgeyi bir klorhekidin glukonat sabunuyla yıkayın. Klorheksisin çözeltisi ve etanol 96 º (3 kez) ile alanı sanitize.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mide ve bağırsak kranikal bulunduğundan emin olmak için Trendelenburg pozisyonu (45 ° aşağı baş), sıcak bir cerrahi masaya hayvan yerleştirin. Eğer turgid ise mesane tahliyesini düşünün. Eğer bu süreçte herhangi bir iç organlar zarar görürse, hayvan ölebilir. Bu nedenle, düzgün bir şekilde bulunabilmesi önemlidir (Şekil 1).</li>
		<li>Steril bir havlu kullanarak alanı koruyun, bir delik ile (fenestrasyon) tıraş alanı açığa, herhangi bir potansiyel kontamine alanlardan cerrahi site ayırmak için.</li>
		<li>Karın boşluğuna bir endoskopik trokar 5 cm, ksifoid sürecine 2 cm kaudal ve basınç düzenleyen mekanik bir yetersiz periton boşluğu ile üflemek yerleştirin. Not: abdominal basınç, CO2 (Şekil 1a) ile 8-12 mmHg olmalıdır.</li>
		<li>Endoskopik trokar (Şekil 1B) ile endoskop Kamerayı takın. Not: bir sonraki adımları kolaylaştırmak için ET önce infundibulum ve ampulla durumunu ve konumunu belirlemek, üreme yolu belirleyin.</li>
		<li>17-G Epidural İğne infundibulum 2-3 cm arasında inguinal bölgeye yerleştirin (Şekil 1B).</li>
		<li>İnfundibulumun girişini belirleyin (Şekil 2a, 2B).</li>
		<li>Yüklü kateter (adım 1,3), epidural iğne ile karın içine yerleştirin (Şekil 1C).</li>
		<li>Ovası bulun ve ampulla infundibulum aracılığıyla epidural kateter 1-2 cm yerleştirin (Şekil 2a-2C). Hasar ve hemoraj önlemek için ovidukt çok uzağa ilerleme yok.</li>
		<li>Embriyoları, kateter (Şekil 2D-2F) ile birleştirilerek şırınga pistonu hafifçe basarak ovidukt 'a bırakın. Her iki hava kabarcığı kateter çıkmak gerekir.</li>
		<li>Embriyoların serbest bırakıldıktan hemen sonra kateteri çıkarın.</li>
		<li>Embriyoların yokluğunda kontrol etmek ve başarılı transferini onaylamak için kateter, aspirasyon ve serbest bırakma ortamını durulayın.</li>
		<li>Eğer istenirse uterusun diğer tarafında 1.4.16 için 1.4.11 adımları yineleyin.</li>
		<li>Epidural İğne ve endoskop kamerayı çıkarın.</li>
		<li>CO2 ' ye endoskopik Trocar ile yayın yapın. Hayvan karın içinde aşırı gaz kalırsa, ağrı ve rahatsızlık olacaktır.</li>
		<li>Endoskopik trokar Karın boşluğundan çıkarın. Cerrahi havluyu çıkarın.</li>
		<li>Anestezi durdurma.</li>
		<li>Klorhekidin çözeltisi ile trokar tarafından yapılan kesi temizleyin. Mikronize alüminyum ve plastik soyunma ile trokar tarafından yapılan kesi kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Postoperatif bakım
	<ol>
<li>Hayvanların antibiyotikler ile tedavi: 10 mg/kg enroflokacin, subkutan, her 24-h için 5 gün.</li>
		<li>Analjezikler yönetin: buprenorfik hidroklorür (0,03 mg/kg), İntramüsküler, her 12 saat 3 gün; Meloxicam (0,2 mg/kg), subkutan, her 24-h 3 gün.</li>
		<li>Ameliyat sonrası en az 30 dakika boyunca hayvanları izleyin (hayvan ve kullanılan anestezi dozuna bağlı olarak) fizyolojik koşullarını kurtarırlar.</li>
		<li>Alıcıyı (ör. kulak dövmesi) ve ev hayvanlarını uygun çevresel şartla temiz bir kafeste tanımlayın.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> Şekil 1: Laparoskopi (dış görünüm) yardımıyla laparoskopik embriyo transferi. A) endoskopik troaraba (bir liman) eklenmesi. B) endoskopik kamera ve Epidural İğne (siyah ok) ekleme. C) embriyo transfer kateteri (beyaz ok) Epidural İğne yoluyla ekleme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> Şekil 2: Laparoskopi (iç görünüm) yardımıyla laparoskopik embriyo transferi. A: Kateterin Epidural İğne yoluyla karın bölgesine yerleştirilmesi. Asterisk infundibulum gösterir. B, C, D: Embriyolar ile yüklenen kateter infundibulum genelinde ampulla bölgesine eklenir. E, F: Embriyolar serbest, şişmiş bir oviduct görselleştirme tarafından teyit. Bu rakam Marco-Jiménez et al 'dan uyarlanmıştır. 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için</a> .
2. embriyo vitrifikasyon ve ısınma
<ol><li>Sıcak sıcaklıklarda vitrifikasyon çözeltisi toksisitesi azaltmak için oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) tüm manipülasyon gerçekleştirin. Not: embriyolar Bu protokolde 0.1-2 μL otomatik pipet kullanılarak taşınabilir, ancak embriyoları en düşük hacmi sürükleyerek taşımak için diğer benzer aygıtlar uygun olabilir.</li>
	<li>Embriyoları iki adımlı ek prosedürde vitrify:<ol>
<li>Embriyoları, BM 'de çözünen% 10 (v/v) Etilen glikol ve% 10 (v/v) dimetil sülfoxid olan dengeleyici solüsyonda 2 dakika boyunca yerleştirin.</li>
		<li>Embriyoları (adım 2.2.1) 1 dakika boyunca, BM 'de çözünen% 20 (v/v) Etilen glikol ve% 20 (v/v) dimetil sülfoxid içeren vitrifikasyon çözüme taşıyın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoları bir 125 μL plastik ministraw içine yükleyin (bir pamuklu fiş ile bir kapalı uç ve bir açık aşırı içerir). İşlem Şekil 3' te şemalandırılır.<ol>
<li>0,125 ' in kapalı ucunu, uygun mikrodispenseri (örn®.</li>
		<li>Küçük bir hava balonu tarafından aşağıdaki 1/3 kadar saman uzunluğu, aspirate BM.</li>
		<li>40 μL vitrifikasyon solüsyonunun bir hacminde embriyo aspirate, başka bir küçük hava balonu izledi.</li>
		<li>İlk sıvı fraksiyonu (adım 2.3.2) pamuk ulaşır kadar BM aspirate.</li>
		<li>Açık ucunu bir saman fişi ile kapatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 2.2.2, embriyolar için toksik olacak bir dakikadan fazla sona ermeden emin olmak için 2,3 sırasında yapılır.</li>
	<li>Vitrifikasyon elde etmek için doğrudan sıvı azot içine ministraw Dalma.</li>
	<li>İstediğiniz zaman için azot için bir Dewar ministraw saklayın.</li>
	<li>Embriyoları tek bir adımda çözün.<ol>
<li>20-30 s için sıvı azot buharı 10 cm yatay olarak ministraw yerleştirin.</li>
		<li>Kristalizasyon süreci ministraw içinde başladığında, 10-15 s için 25 °C ' de bir su banyosuna ministraw batırın.</li>
		<li>Ministraw fişini çıkarın ve pamuk fişini kesiniz.</li>
		<li>Birleştirilmiş bir mikrodispenseri ile tüm ministraw içeriğini 5 dakika boyunca BM 'de 25 °C ' de 0,33 M sakaroz çözeltisi içeren bir plakaya atın. Not: Bu adım, vitrifikasyon çözeltisi embriyo pozlama azaltmak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
		<li>Embriyoları başka bir 5 dakika için BM çözümünü içeren yeni bir plakaya taşıyın.</li>
		<li>ET ile devam etmek için sadece hasarlı embriyo (bozulmamış mukin ceket ve zona pellucida ile) düşünün. Not: çözülür embriyolar, asenkron transferler (örn., morula transferleri 60-62 h) embriyo ve maternal endometrium arasında bir yeniden senkronizasyon sağlayarak sonuçları artırabilir dikkate alın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> Şekil 3: doğru yüklenmiş saman şeması. A) BM, vitrifikasyon sırasında kullanılan embriyo manipülasyon medyasını ifade eder. Embriyo vitrifikasyon çözüm yüklü olmalıdır. B) yüklenmemiş saman, embriyo konumunun büyütülmüş detay ile makroskopik görünümü. Bu büyük hacimli cihaz, minimum hacim cihazlarından farklı olarak, çok sayıda embriyoya vitriks yapmanızı sağlar. Ayrıca, bu cihazın işlenmesi en az hacim cihazları ile karşılaştırıldığında daha kolaydır, sonuçlar tavşan41benzer iken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Transfer edilen embriyolar9' dan ilk belgelenmiş canlı Doğum vakası beri, bu teknik ve tavşan türleri üreme çalışmalarında çok önemli hale gelmiştir. Ayrıca, manipülasyon, üretim, ağoprezervasyon vb. içeren embriyo araştırma çalışmaları, son bir adım olarak embriyo kapasitesinin değerlendirilmesi için sağlıklı tam vadeli yavru üretmek gerektirir. Bu nedenle embriyo transfer tekniği13,28. Yıllarca embriyoları maternal uterusa aktar...

İnsan infertilitesini atlayarak veya yüksek genetik değer ve hayvan genetik kaynaklarını koruyan Hayvancılık yaygınlaştırılması amaçlarıyla, teknik bir dizi topluca yardımcı üreme teknolojileri olarak adlandırılan, süperovülasyon gibi, içinde vitro fertilizasyon, embriyo kültürü veya ağoprezervasyon,1,2geliştirilmiştir. Şu anda, yumurtalıkları uyarmak ve çok sayıda antral ovaryalı folikülleri üretmek için hormonal tedaviler verilir1. Bu foliküllerden toplanan oositler olgunlaşabilir, döllenmiş ve in vitro olarak geliştirilmiştir ya kriokonservirovannogo ya da vekil annelere transfer edilinceye kadar3. Ancak, bu tedaviler sırasında, gamet ve zigotları bu koşullarda hayatta kalmak için embriyo adaptasyon gerektirebilir fizyolojik olmayan süreçler bir dizi maruz4,5. Bu adaptasyon erken embriyo plastisite nedeniyle mümkündür, hangi gen ifade ve gelişimsel programlama embriyo değişiklikleri sağlar6. Ancak, bu değişiklikler yetişkinliğe kadar embriyo gelişiminin sonraki aşamalarını etkileyebilir, ve şimdi yaygın olarak kabul edilir ki Yöntemler, zamanlama, ağkısızlık prosedürü veya kültür koşulları embriyo kaderi farklı sonuçlar göstermek7 , 8. bu nedenle, sanat spesifik indüklenen etkileri aydınlatmak, iyi karakterize hayvan modellerinin kullanımı kaçınılmazdır.
Meme embriyoları transferinden kaynaklanan ilk belgelenmiş canlı Doğum 1890 yılında gerçekleşti9. Bugün, bir vekil dişi embriyo transferi (ET) sonraki embriyo gelişimi aşamalarında Preimplantasyon sırasında sanat kaynaklı etkileri okuyan önemli bir adımdır10. ET teknikleri her hayvanın büyüklüğü ve anatomik yapısına bağlıdır. Büyük ölçekli hayvan modelleri durumunda, transservikal cerrahi dışı ET teknikleri ile ET gerçekleştirmek mümkün olmuştur, ancak daha küçük boyutlu türler serviks kateterizasyon daha karmaşık ve cerrahi teknikler sık kullanılan11. Ancak, cerrahi ET, implantasyon ve embriyo gelişimini zarar verebilecek kanama neden olabilir, kan uterus lümen istila edebilir gibi, embriyo ölümü10neden. Transservikal cerrahi dışı et teknikleri hala insanlarda, babunların, sığır, domuz ve fareler12,13,14,15,16,17, ancak cerrahi uygulanır Etler hala keçiler, koyun veya diğer hayvanlar gibi tür,10,18,19,20,21, tavşan gibi ek zorluklar mevcut kullanılmaktadır (iki bağımsız sertifikalar) veya fareler (küçük boyut). Yine de, cerrahi transfer yöntemleri giderek daha az invaziv yöntemler ile değiştirildi eğilimindedir. Embriyoları transfer etmek için endoskopi kullanıldı, örneğin, tavşan, domuz ve küçük ruminantlarda18,19,20. Bu minimal invaziv endoskopi yöntemleri embriyoları ampulla içine infundibulum üzerinden aktarmak için kullanılabilir, hangi tavşan önemlidir ve bazı türler yararlı etkileri göstermiştir20. Bu oviduct erken embriyo aşamalarında embriyo ve anne arasındaki doğru diyalog önemini dayanır. Yukarıda belirtildiği gibi, ovduct aracılığıyla embriyo göçü sırasında tavşanlar içinde yer alan embriyo remodeling,22,23implant edilebilir embriyolar elde etmek için esastır.
Büyük boyutlu hayvan modelleri, sığır gibi, biyokimyasal ve Preimplantasyon özellikleri insan türlerinin24benzer çünkü ilginç. Ancak, büyük hayvanlar ön denemeler kullanmak için çok pahalıdır, ve kemirgenler ideal bir model olarak kabul edilir (76% model organizmalar kemirgenler) laboratuar araştırması için25. Yine de, tavşan modeli üreme çalışmalarında kemirgenler üzerinde bazı avantajlar sağlar, insanlar tarafından sergilenen bazı üreme Biyolojik süreçler fareler bu daha tavşan benzer. İnsan ve tavşanlar benzer bir kronolojik embriyonik genom aktivasyonu, gastrülasyon ve hemochorial plasenta yapısını sunar. Buna ek olarak, tavşan kullanarak döllenme ve gebelik aşamalarında tam zamanlamasını bilmek mümkündür nedeniyle onların indüklenen yumurtlama25. Tavşan yaşam döngüleri kısa, 31 gün içinde gebelik tamamlama ve yaklaşık 4-5 ay içinde ergenliğe ulaşan; hayvan onun uysal ve agresif olmayan davranışları nedeniyle işlemek kolaydır, ve onun bakım büyük hayvanların pahasına kıyasla çok ekonomiktir. Ayrıca, tavşanların iki bağımsız serviks11,25ile Dubleks rahim var söz önemlidir. Bu, farklı deneysel grupların embriyoları aynı hayvana aktarılabilir, ancak farklı bir uterus boynuz içine, tercihli bir pozisyonda tavşan yerleştirir. Bu, hem deneysel etkileri karşılaştırmak için, sonuçları maternal faktörü azaltarak bize izin verir.
Günümüzde cerrahi olmayan ET yöntemleri tavşan içinde kullanımda değildir. 90 ' ların sonlarında bir transservikal et tekniği kullanılarak yürütülen bazı çalışmalar, cerrahi yöntemlerle% 5,5-20,0%11,26 VERSUS 50-65% arasında değişen düşük teslimat oranlarında sonuçlanan, bunların arasında laparoskopik prosedür Besenfelder ve Brem18. Tavşanların bu ameliyatsız ET yöntemlerinin düşük başarı oranları, transservikal ET 'te önlenmiş olan oviduct 'de gerekli embriyo remodeling eksikliği ile örtüşür. Burada, bir model organizma olarak tavşan kullanarak etkili bir minimal invaziv laparoskopik ET prosedürü tarif. Bu teknik, büyük hayvanların ve insanlarda daha fazla üreme araştırması için bir model sağlar.
Tavşanların embriyo implantasyonu için özellikle dar bir zaman penceresi olduğu için, bu türdeki ET, ET 'de embriyonun gelişimsel aşaması ile alıcı27' nin fizyolojik durumu arasında yüksek düzeyde senkron gerektirir. Bazı durumlarda, embriyo gelişimini yavaşlatan bir üreme tedavisinden sonra ( In vitro Culture gibi) veya endometrial reseptüsü (superovülasyon tedavileri gibi) değiştirir, embriyo ve maternal uterusun arasında senkron yoktur. Bu durumlar sonucu olumsuz etkileyebilir. Bu bağlamlarda yanıt vermek için, bizi duraklatmak, düzenlemek ve deneyler devam sağlayan etkili bir tavşan Morula vitrifikasyon Protokolü açıklanmaktadır. Bu süreç üreme çalışmaları için Lojistik olarak arzu edilir ve bize embriyoların uzun süreli depolanması için kapasite verir, onların taşıma izin. Laparoskopik prosedür ve ağoprezervasyon stratejileri daha az hayvan ile çalışmaların daha iyi planlamasına olanak sağlar. Böylece, metodolojimiz hijyen ve ekonomik avantajlar sunar ve deneysel hayvanların insan tedavisinin iyileştirilmesi amacı ile hayvan araştırmalarının 3Rs (yedek, azaltma ve arıtma) konseptine uygundur. Böylece, bu yöntemlerle, tavşan in vivo üreme amaçlı ideal bir model organizma oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin hidroklorür</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>Lisanslı bir veteriner tarafından sipariş edilmeli.</td></tr><tr><td>Buserelin Asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Kloreksidin diglukonat sabunu</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Kloreksidin diglukonat çözeltisi</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>Fisher bilimsel</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Kalsiyum klorür içermez.</td></tr><tr><td>Elektrikli tıraş makinesi</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Endoskop kamera</td><td>Optomic Spain SA</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Silikon broşür valfli endoskop trokar</td><td>Karl Storz Endoskopi Ib&eacute; Rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Hafif trokar modeli.</td></tr><tr><td>Enrofloksasin</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>Lisanslı bir veteriner tarafından sipariş edilmek.</td></tr><tr><td>Epicraneal iğne 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>Daha küçük iğneler de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Epidural kateter</td><td>Vygon kurumsal</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Epidural iğne</td><td>Vygon kurumsal</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Etilen Glikol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Göz merhemi</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>Lisanslı bir veteriner hekim tarafından sipariş edilmek.</td></tr><tr><td>Laparoskopi ekipmanı</td><td>Karl Storz Endoskopi Ib&eacute; Rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg; Laparoskop, 0&ordm;-mm düz görüşlü laparoskop, 30 cm uzunluk, 5 mm çalışma kanalı.</td></tr><tr><td>Işık kaynağı</td><td>: Optomic Spain SA</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td>Hava Sıvı</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Mekanik CO2 insüflatörü</td><td>Karl Storz Endoskopi Ib&eacute; Rica S.A.</td><td>Endoflatör&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloksikam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>Lisanslı bir veteriner tarafından sipariş edilmek.</td></tr><tr><td>Petri kapları, 35 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pansuman (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Pipet 0.25 mL</td><td>IMV - teknolojiler</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iyodür çözeltisi</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Herhangi bir normal cerrahi sınıf çelik küçük düz makas işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>İnsüflatör Karl</td><td>Storz Endoskopi Ib&eacute için silikon tüp; Rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Birkaç isim vermek gerekirse, Leica MZ8 veya Nikon SMZ-10 veya SMZ-2B gibi daha ucuz seçenekler var.</td></tr><tr><td>Steril Eldivenler</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Steril önlük</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>Steril maske</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Saman Tapası</td><td>IMV - teknolojiler</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 1 mL</td><td>Fisher bilimsel</td><td>11750425</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 5 mL</td><td>Fisher bilimsel</td><td>11773313</td><td></td></tr><tr><td>Üriner kateter</td><td>IMV - teknolojiler</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>Lisanslı bir veteriner tarafından sipariş edilmek.</td></tr><tr><td>Tavşanlar,</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val & egrave; ncia</td><td>Line A</td><td>Line V veya Line HP gibi diğer maternal hatlar kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

en düşük invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

İn vitro embriyo kültürü veya embriyo ağaloprezervasyon gibi destekli üreme teknikleri (ARTs), perinatal ve postnatal sonuçları ile doğal gelişim desenlerini etkiler. Sanat uygulamalarının zararsız olmasını sağlamak için hayvan modellerinde çalışmalar gereklidir. Buna ek olarak, son bir adım olarak, embriyo geliştirme çalışmaları tam vadeli sağlıklı yavru geliştirmek için kapasitelerinin değerlendirilmesi gerekir. Burada, rahim için embriyo transferi herhangi bir sanat ile ilgili deney gerçekleştirmek için vazgeçilmez.
Tavşan bir yüzyıl boyunca meme üreme çalışması için bir model organizma olarak kullanılmıştır. İnsan türü ve küçük boyutu ve düşük bakım maliyeti onun fitogenetik yakınlığı ek olarak, bu indüklenen yumurtlama gibi önemli üreme özelliklerine sahip, erken embriyonik gelişim bir kronolojisi insanlara benzer ve kısa bir gebelik bize kolayca ART uygulamasının sonuçlarını incelemek için izin. Dahası, sanat (örneğin intrakitoplazmik sperm enjeksiyonu, embriyo kültürü veya ağoprezervasyon) bu türe uygun verimlilik ile uygulanır.
Bu yazıda sunulan laparoskopik embriyo transfer tekniğinin ve ağoprezervasyon protokolünün kullanılması, 1) embriyoları kolay, minimal invazif bir teknik ve 2) tavşan uzun süreli depolanması için etkili bir protokol aracılığıyla nasıl aktarmayı tarif ediyoruz. embriyo zaman esnek lojistik kapasiteleri ve örnek taşıma yeteneği sağlamak için. Tavşan embriyoları farklı gelişimsel aşamalarında aktardıktan sonra elde edilen sonuçlar, Morula 'nın tavşan embriyo kurtarma ve transfer için ideal bir aşama olduğunu göstermektedir. Böylece, cerrahi prosedürü haklı olarak, bir oviduktal embriyo transferi gereklidir. Ayrıca, tavşan morulları başarıyla vitrifiye ve laparoskopik olarak aktarılan, açıklanan teknikleri etkinliğini kanıtlamak.

Minimal invaziv laparoskopi taze veya vitrifiye embriyolar taşıma üreme çalışmaları için en iyi model hayvanlar arasında tavşan yerleştirir. Tablo 1 farklı gelişim AŞAMALARıNDA taze et sonuçlarını gösterir (Şekil 4) aktarılan embriyo. Doğumda hayatta kalma oranı (bir yavru ile sonuçlanan embriyo yüzdesi) Bu yazıda açıklanan laparoskopik tekniğin etkinliğini kanıtladı. Daha yüksek değerler, ET, Morula aşamasında embriyolar ile erken veya kompa...

Destekli üreme teknikleri (ARTs) sonuçları geliştirmek ve ilişkili riskleri azaltmak için sürekli değerlendirme içindedir. Bu yazıda, tavşanların insan üreme açısından ideal bir hayvan modeli olarak kullanımına izin veren, verimli bir ağoprezervasyon protokolüyle minimal invaziv bir embriyo transfer prosedürü açıklanmaktadır.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Bu deneyin temel amacı bir model olarak tavşan bir laparoskopik embriyo transferi prosedürü tanımlamaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu kolay, minimal invaziv bir teknik kullanarak embriyo transferi için çalışıyor olmasıdır. Ayrıca, burada açıklanan etkili embriyo kriyoprezervasyon protokolü de uzun vadeli depolama tavşan embriyoları için çalışır, zaman esnek lojistik kapasiteleri ve örnek taşıma yeteneği sağlayan.Bildiğimiz gibi, yardımcı üreme teknolojileri sonuçları iyileştirmek ve ilişkili riskleri azaltmak için sürekli değerlendirme de bulunmaktadır. Bu nedenle, her iki teknik kullanarak, tavşan bu alanda anahtar soruları cevaplamak için insan üreme ideal bir hayvan modeli olarak kullanılabilir, yavrular üzerinde in vitro embriyo manipülasyon etkileri gibi. Embriyo transfer adımlarını öğrenmek zor olduğu için bu konuların görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü tekniğin başarısını sağlamak için büyük bir hassasiyetle yapılması gerekir.Embriyonik vitrifikasyon için, iki dakika boyunca denge çözeltisi embriyolar batırın, vitrifikasyon çözeltisi bir dakika kuluçka takip. Kuluçka sonunda, 125 mikrolitrelik plastik mini-saman içine embriyolar yükleyin ve uygun bir mili

minimally-invasive-embryo-transfer-embryo-vitrification-at-optimal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Bu videoda, kriyoprotektan olarak etilen glikol ve dimetil sülfoksit ve taşıyıcı sistem olarak kriyojenik saman kullanılarak istenen gelişim aşamasında hasat edilen tavşan embriyolarının vitrifikasyon prosedürünü anlatıyoruz. Vitrifiye embriyolar yüksek hayatta kalma oranına sahiptir ve kullanıma kadar uzun süre saklanabilir.

Kriyojenik Saman Kullanarak Tavşan Embriyosu Vitrifikasyonu: Tavşan Embriyolarını Uzun Süreli Depolama için Korumak İçin Ultra Hızlı Bir Soğutma Tekniği

Bu video, vitrifiye tavşan embriyolarının çözülme prosedürünü ve optimal embriyo geri kazanımı için önlem ölçüm adımlarını göstermektedir.

Tavşan Embriyosu Çözdürme: Embriyo Transferi için Dondurularak Saklanmış Tavşan Embriyolarını Geri Kazanmak İçin Bir Isınma Prosedürü

Bu videoda, Laparoskopi yoluyla embriyoların alıcı dişi tavşanın yumurta kanalına aktarılması tekniği açıklanmaktadır. Yumurta kanalından geçişi sırasında tavşanlarda embriyonun yeniden şekillenmesine izin verir ve sonunda başarılı implantasyona yardımcı olur. Bu teknik, iyi bir verimlilikle saklanan embriyolar için de kullanılabilir.

Tavşana Embriyo Transferi: Yumurtlayan Alıcı Dişi Tavşan Modelinin Yumurta Kanalına Laparoskopi Eşliğinde Embriyo Transferi İçin Bir Prosedür

Gen hedefleme araçları son gelişme nakavtla üretimi (KO) tavşan mümkün kılar. Bu çalışmada, biz Çinko Parmak nükleazlardır (ZFN) kullanarak beş Apolipoprotein (Apo) C-III KO tavşan oluşturulur. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Çinko Finger nükleazlar kullanılması Apolipoprotein C-III Knockout Tavşanlar Üretimi

Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.

Fare Modelinde utero-tubal Embriyo Transferi ve Vazektomi

MicroSecure Vitrifikasyon, FDA iyi üretim ve doku işleme uygulamalarıyla uyumlu, ticari olmayan, aseptik kapalı bir vitrifikasyon cihazı sistemi olarak geliştirilmiştir. Hidrofobik tıkalı embriyo pipetlerinin endüstriden çekilmesi nedeniyle, vitrifikasyon prosedürü, standart iç pamuk tapadan önce bir iç conta içerecek şekilde değiştirildi.

Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.

İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Bu protokol, embriyo implantasyon sürecini etkileyen ilgili molekülleri değerlendirmek için in vitro model olarak basit ve verimli embriyo implantasyonu oluşturmak için metodolojileri açıklar.

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

Bu protokol, embriyo transferli ve genetiği değiştirilmiş tavşanlar için yenidoğan tavşan ölümlerini azaltmayı ve gen düzenlemeli tavşanların hazırlama verimliliğini artırmayı amaçlayan bir hamilelik ve besleme yönetimi tekniğini tanımlar.

Embriyo Transferi Yapılan ve Genetiği Değiştirilmiş Tavşanlarda Gebelik ve Hemşirelik Yönetimi

Burada, ev yapımı bir spatuladan oluşan ve ev yapımı solüsyonlar kullanan fare ve koyun implantasyon öncesi embriyoları vitrifikasyon için Spatula Montevideo protokolünü sunuyoruz. Embriyolar, artan konsantrasyonda iki kriyoprotektan çözelti içinde hızla dengelenir, spatula üzerine yüklenir, sıvı nitrojene daldırılır ve son olarak 0.5 mL'lik bir samanla kapatılır.

Memeli embriyolarının vitrifikasyonu için spatula Montevideo cihazı

Öğrenin tavşan modelinde laparoskopik embriyo transferi ve vitrifikasyon protokolü kullanarak üreme biyolojisi araştırmaları için etkili yöntemler. Bu teknikler insan üremesi çalışmalarına değerli katkılar sağlar.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Daha fazla video keşfet