Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bu yöntem, feromonların tanımlanması gibi kimyasal ekoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yeni bileşikleri feromon işlevine bağlamasıdır. Bu işleme başlamak için, 15-30 cinsel olgun erkek deniz lambasını, 16-18 santigrat derecede tutulan 250 litre gazlı Huron Gölü suyu ile sağlanan bir tanka yerleştirin.

Şartlandırılmış suyu katı faz ekstraksiyonu ile çıkarmak için, tanktan pompalama sistemi aracılığıyla kolonun tepesine geçirin. Su, dört adet bir litre kapasiteli cam kolon serisinde bulunan iki kilogram orta derecede polar, polimerik iyon değiştirici reçineden oluşan bir yataktan geçer. Daha sonra, organik çözücüyü çıkarın ve özü, 40 santigrat derecede düşük basınç altında beş saat boyunca döner buharlaştırma ile hasat edin.

Fraksiyon havuzlarını izole etmek için silika jeli ilk mobil fazda 30 dakika bekletin. Çözücü ile jeli bir cam kolona aktarın ve mobil fazın geçmesine izin vermek için valfini açın. Daha sonra, ekstraktları silika jel ile iyice karıştırın ve silika jel yatağı üzerindeki sıvı kromatografi kolonuna yükleyin.

Bunları% 95 kloroformdan metanole% 100 metanole kadar bir gradyanla elute, toplam 2,5 litre elde edin, ardından eluenti ayrı ayrı 10 mililitrelik şişelerde toplayın. Daha sonra, numuneyi başlangıç çizgisine uygulayarak ve plakanın başlangıç çizgisini sızdırmaz bir cam tankta gelişmekte olan çözücüye daldırarak önceden kaplanmış silika jel plakalar üzerinde TLC deneyini gerçekleştirin. Gelişen solvent bitiş çizgisine ulaştıktan sonra plakayı tanktan çıkarın ve solventin buharlaşması için 10 dakika bekleyin.

Lekeleri önce 254 nanometrede UV ışığı altında görselleştirin, ardından bir kromatografi püskürtücü kullanarak %5 anisaldehit içeren asidik bir metanol çözeltisi püskürterek ve üç dakika boyunca 85 santigrat derecede ısıtarak plakayı boyayın. Daha sonra, fraksiyonu yaklaşık 30 dakika boyunca 40 santigrat derecede düşük basınç altında döner buharlaştırma yoluyla bir kalıntıya konsantre edin. EOG kaydı yapmak için, gümüş-gümüş klorür peletleri ile önceden imal edilmiş kutuplu kılcal elektrotları ve katı hal elektrot tutucularını bir mikropipet kullanarak üç molar potasyum klorür ile doldurun.

Ardından, kutuplu elektrotları elektrot tutucularına yerleştirin. Daha sonra, hacimsel bir şişede deiyonize su içinde 10 ila eksi iki molar L-arginin stok çözeltisinden odun kömürü filtreli suda 10 mililitre eksi beş molar L-arginin hazırlayın. Konsantrasyon tepki eğrisi için, fraksiyon havuzlarının 10 mililitrelik 10 kat seyreltmesini hazırlayın.

Şimdi, anestezi uygulanmış bir lambayı V şeklinde bir standa yönlendirin ve kurumasını önlemek için ıslak bir kağıt havluyla sarın. Bukkal boşluğa litre başına 50 miligram MS222 içeren bir sirkülasyonlu, havalandırılmış su tüpü yerleştirin. Solungaçları sürekli sulamak için akış hızını ayarlayın ve suyun solungaç açıklıklarından çıktığından emin olun.

Koku verici dağıtım borusunu filtrelenmiş suyla yıkayın ve bir mikromanipülatöre monte edilmiş valfe bağlayın. Daha sonra, koku maddeleri uygulanmadığında kurumayı önlemek için koku alma epiteline filtrelenmiş su vermek için koku verici dağıtım kılcal tüpünü koku alma epitel boşluğuna yerleştirin. Ardından, kayıt ve referans elektrotlarını mikromanipülatörlere monte edin.

Referans elektrodu, burun kısımlarının yakınındaki dış deriye indirin. Stereoskopik mikroskobu kullanarak, koku alma epitelinin yüzeyine zar zor dokunacak şekilde kayıt elektrodunu indirin. Daha sonra, koku verici dağıtım tüpünün alımını arka planda filtrelenmiş sudan 10 ila eksi beş molar L-arginin çözeltisine aktarın.

Bilgisayarı, amplifikatörü, filtreyi ve sayısallaştırıcıyı açın. Valf sürücü yazılımını kullanarak, T1 kutusunu işaretleyerek, T'yi dört saniyeye ayarlayarak ve veri toplama yazılımı T2.In kutusunu işaretleyerek dört saniyelik tek bir koku darbesi uygulamak için prosedürü programlayın, edinme modunu yüksek hızlı bir osiloskopa ayarlayın. Oynat simgesine tıklayın ve ardından koku verici nabzını tetiklemek için valf sürücüsünde Başlat'a tıklayın.

Boş kontrolü, L-arginini ve ardından koku vericileri düşükten yüksek konsantrasyonlara kadar uygulamalar arasında iki dakikalık bir filtrelenmiş su yıkamasıyla kaydetmeye başlayın. Davranışsal olarak aktif fraksiyonları tanımlamak için, cinsel olarak olgunlaşmış dişi deniz lambasını labirentteki serbest bırakma kafesinde beş dakika boyunca alıştırın. Deniz lambasını serbest bırakın ve lambanın her biri nehir suyu içeren deney ve kontrol kanalında geçirdiği kümülatif süreyi 10 dakika boyunca kaydedin.

Daha sonra, test uyaranını araçta rastgele atanan deney kanalına, beş dakika boyunca dakikada 200 mililitre sabit hızlarda peristaltik pompalar kullanarak kontrol kanalına uygulayın, ardından test uyaranını araçta 10 dakika daha uygulayın ve lamprey'in deney ve kontrol kanallarında geçirdiği kümülatif süreyi kaydedin. Bu prosedürde, aktif fraksiyonları bir sephadex LH-20 kolonu kullanarak boyut dışlama kromatografisi ile bileşiklere daha da saflaştırın. Numuneyi ilk mobil fazın 0,5 mililitresinde hazırlayın, kloroformdan metanole kolonuna ve ardından metanol kolonuna yükleyin ve bileşiği elde etmek için aktif fraksiyonları elüte edin.

Saflaştırılmış bileşiği, mililitre başına yaklaşık bir mikrogramlık 10 mikrolitrelik bir çözelti oluşturmak için HPLC'nin ilk mobil fazında çözün ve seyreltin. Daha sonra, numune çözeltisini HPLC şişelerine aktarın ve bunları HPLC'nin otomatik örnekleyicisine yerleştirin. Numuneyi elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisine enjekte edin ve bir kromatografi kütle spektrometresi kullanarak yüksek çözünürlüklü elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi spektrumlarını kaydedin.

Mililitre başına yaklaşık 0.1 ila 10 miligram arasında değişen bir konsantrasyona sahip bir çözelti oluşturmak için numuneyi seçilen döteryumlu çözücüler içinde tamamen çözün. 1D ve 2D NMR spektrumlarını 900 megahertz NMR spektrometresinde kaydetmek için numune çözeltisini bir NMR tüpüne aktarın. Burada 600 megahertz'lik bir NMR spektrometresi gösterilmektedir.

Beş yeni varsayılan deniz lambası feromonu tanımlanmış ve yapıları spektrometrik ve spektroskopik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Bu varsayılan feromonlar, yetişkin deniz lambası koku alma epiteli için uyarıcıydı ve elektro-olfaktogram kayıtlarında düşük tespit eşiklerine sahipti. İki seçenekli labirent davranış tahlillerinde, yumurtlanmış dişi deniz lambaları Petromyzone A, Petromyzene A ve Petromyzene B'ye çekildi ve Petromyzone C'den itildi.

Bu prosedürü takiben, bileşiklerin stereokimyası gibi ek soruları yanıtlamak için X-ışını kristalografisi ve türevlendirme reaksiyonları gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, doğal ürünler ve nöroetoloji alanındaki araştırmacıların, deniz lambası gibi suda yaşayan organizmalardaki feromonların makul biyosentezini ve biyolojik işlevini keşfetmelerinin yolunu açtı. Kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu reaktifi kullanırken kimyasal başlıkta çalışmak, eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.