Name: Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Keşfedin antikor-ilaç konjugatları üretimi için sitenin özgü modifikasyon yöntemini. Siklopropen türevi kullanarak yüksek verimli ve stabil ADC'ler elde edin. Bu teknik kanser tedavisinde hedefe yönelik terapötik uygulamalar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser tıbbi araştırma Konseyi, UK tarafından desteklenmiştir. BO-S. EMBO Bursu (ATLF 158-2016) tutar ve H. Pelham ve destek için JW çene ve G. Kym, C. W. Morgan ve O. Perisic yardım ve tavsiye için minnettar olduğunu.

1. üretmek ve antikor karakterize
<ol><li>Antikor hızlı<ol>
<li>Bir şişe HEK süspansiyon 250 mL şişe 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 250 ng/mL Amfoterisin B. % 8 CO2 ' ile 37 ° C'de hücreler donanımlı İnkübatörler nemlendirilmelidir tutmak ile desteklenmiş ifade orta 50 mL içeren hücrelerde tezcan bir shaker 125 rpm. Hücreleri 0.3-0.5 x 106 hücre/ml (her 2-3 gün) en az 2 kez transfecting önce bölün.</li>
		<li>2. 5 x 106 hücre/mL yoğunluğu olduğunu ulaştı (2-3 bölme sonra gün), hazırlık 100 mm CypK taze bir çözüm. Bu amaçla, CypK 64 mg tartmak, 2.5 mL 0.1 Sodyum hidroksit, girdap, spin aşağı tüm undissolved parçacıkları yeniden elde etmek ve solüsyon içeren temizleyicide ekleyin.</li>
		<li>Antibiyotik ile desteklenmiş ifade orta 42,5 ml 2.5 mL CypK (100 mM olarak 0.1 M NaOH) ekleyin. İyice karıştırın, 0.1 M HCL 250 µL eklemek ve 0,22 µm filtre sterilize.</li>
		<li>İndirimli serum orta ile 2.5 ml HC ve LC pKym1 plazmid21 50 µg sulandırmak. Ayrı bir tüp içinde düşük serum orta ile 2.5 ml transfection reaktif 135 µL sulandırmak.</li>
		<li>Beş dakika sonra çözümleri, hazırlama plazmid ve transfection reaktif çözüm mix ve kompleksleri arasında DNA ve transfection reaktif oluşumunu sağlamak 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Bu arada, 125 milyon hücre 500 x g de 5 min için hedef yoğunluğu, santrifüj kapasitesi, CypK içeren ifade orta ile resuspend ve DNA-transfection reaktif karışımı ekleyin. CypK satın alınan ya da daha önce18bildirildiği şekilde sentezledim.</li>
		<li>Hücreler 20 h için kuluçka sonra transfection reaktif arttırıcılar kit ile birlikte 250 µL ekleyin.</li>
		<li>Antikorlar süpernatant 6-7 gün sonra CypK (orta değişiklik sırasında ifade gereklidir) eklenmesi hasat. * Alternatif olarak, daha yüksek ve daha tutarlı verimleri elde etmek için istikrarlı bir hücre kültürünü Oller ada çayı ve ark. içinde açıklandığı gibi oluşturulabilir 201821. Bu durumda, trastuzumab(CypK)2 CypK 5 mM ifade orta eklenmesi tarafından sadece ifade edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikor arındırmak<ol>
<li>Hücreler için 3000 x g de 15 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant bir 0.45 veya 0,22 µm filtre ile filtre. Filtre tıkandı olur, eski yerine koymak o için yeni bir ve filtreleme geçin. Bu sadece bir kaç mililitre sonra olursa, süpernatant 7000 x g de ek bir 15 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Bir boş Polipropilen Kromatografi sütununda protein A reçine (2 mL/100 mL süpernatant) ekleyin ve reçine boncuk yıkama arabelleği (0.1 M sodyum fosfat, 150 mM NaCl) en az 5 cilt ile equilibrate.</li>
		<li>Süpernatant iki 50 mL konik tüpler içine split ve önceden dengelenmiş protein A reçine ile takip boncuk yıkama arabellek (0,5 M sodyum fosfat, 150 mM NaCl) x 5 ekleyin. Konik tüp içinde süpernatant antikor aşağı çekmek için oda sıcaklığında 3 h için bir silindir üzerine yerleştirin. Alternatif olarak: süpernatant en az iki katı önerilen birim reçine ile sütun ekleyin ve akışı için. Antikor sol süpernatant SDS-sayfa tarafından önemli miktarda olmadığından emin olun. Varsa, süpernatant reçine ile bir kez daha elute.</li>
		<li>Protein A reçine süpernatant ile bir sütuna aktarmak ve sıvı akışı sağlar.</li>
		<li>Yıkama arabellek (veya en az 10 reçine birimleri) 25 mL ekleyin ve akışı için izin vermek.</li>
		<li>4 mL 0.1 M sodyum sitrat, pH 3, üzerine 1 mL 1 M fosfat tampon, 150 mM NaCl ile antikor elute.</li>
		<li>PBS 10 mL ile antikor sulandırmak, konsantre 0.5-1 mL santrifüj filtrasyon ve üç kez PBS ile Satım tampon.</li>
		<li>0.5 mL/dk ve bir 0-100 bir akışı ile butil hıc sütun kullanarak FPLC tarafından örnekleri arındırmak % gradyan düşük tuz arabelleği (50 mM sodyum fosfat pH 7,0, % 20 isopropanol) yüksek tuz arabelleği 30 dk içerisinde (1.5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodyum fosfat pH 7,0 % 5 isopropanol). Tüm kesirleri toplamak ve 280, elüsyon izlemek nm. Küçük miktarlarda (< 1 mg) HPLC-hıc ile 2.4 verim ve saflık en üst düzeye çıkarmak için açıklanan koşullar altında saf.</li>
		<li>Antikor içeren, onları PBS ile en az 4 ml seyreltik, onları üç kez PBS ile santrifüj filtrasyon ve Satım arabellek konsantre kesirler havuz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikor ölçmek<ol>
<li>Yaklaşık bir konsantrasyonu 280 absorbans ölçerek elde bir mikro-cilt spektrofotometre kullanarak nm.</li>
		<li>Doğru bir ölçüm gerekliyse bir ELISA kiti insan IgGs ölçmek için kullanın. Kaba bir tahmin için SDS-sayfa Coomassie tabanlı bir leke ile aşağıdaki gibi kullanın:<ol>
<li>Standartları altı kez iki kat sulandrarak ELISA tarafından 1 mg/mL sayısal bir trastuzumab standart hazırlayın.</li>
			<li>Standartlar ve örnekleri yaklaşık 0,25 mg/yükleme arabellek azaltılmasında mL, kaynatın.</li>
			<li>Onları kullanarak bir 4-%12 Bis-Tris SDS-sayfa çalıştırmak MES-SDS tampon ve leke Coomassie-esaslı boya. Son olarak ışık veya ImageJ kullanarak ağır zincir karşılık gelen grup renk yoğunluğunu ölçmek ve standart eğri örneklerinde sinyalini tanımlar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikor 4 ° C'de depolayın</li>
</ol>2. eşlenik antikor ve ADC karakterize
<ol><li>Tetrazine taşıyıcı molekül ile antikor eşlenik<ol>
<li>Tetrazine-vcMMAE (4 µL, dimetil sülfoksit (DMSO), 3, 4 mM) 10 molar karşılıkları Asetonitril 20 µL ve PBS 76 µL küçük konik tüp (Örneğin,PCR tüp) oranında seyreltin.</li>
		<li>Trastuzumab(CypK)2 (100 µL, PBS 2 mg/mL) 1 molar denk ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında trastuzumab(MMAE)2oluşturmak için (25 ° C) 3 h için tepki sağlar. Not: Tetrazine-5-TAMRA başka moleküllerin antikor tetrazine-vcMMAE bu iletişim kuralını kullanan yerine bağlantılı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ADC arındırmak<ol>
<li>Bir boyut dışlama spin sütun üreticinin yönergeleri izleyerek PBS ile önceden equilibrate.</li>
		<li>Reaksiyon bütün hacmi 1 dk. için 1500 x g, santrifüj ve spin sütun ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ADC ölçmek ve eşlenik SDS-sayfa tarafından analiz<ol>
<li>ADC 1.3.2 içinde açıklandığı gibi ölçmek. renk yoğunluğu SDS-sayfa hafif zincirinin ölçerek-modified antikor için standart eğri kullanarak.</li>
		<li>Ağır zincir biraz molekül ağırlığı konjugasyon üzerine bir artış gösteren yer değiştirmemiş. Not: trastuzumab(TAMRA)2' deki gibi bir fluorophore ile antikor değişikliklerde boyama önce jel floresans sadece ağır zincir karşılık gelen bantını göstermelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eşlenik HPLC hıc tarafından analiz<ol>
<li>HPLC hıc sütun % 100 arabelleği A ile equilibrate (1.5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodyum fosfat pH 7,0, % 5 isopropanol) 5 min için.</li>
		<li>Mix 15 µL (67 pmol) 1 mg/mL çözüm trastuzumab (CypK) 2 2 x 15 µL ile bir şişe A tampon. O zaman 10 µL enjeksiyon içinde HPLC programı.</li>
		<li>Bir isocratic 1 mL/dk akışı 1dk arabelleği A b (50 mM sodyum fosfat pH 7,0, % 20 isopropanol) % 0 ' 100 15dk degrade tarafından takip için % 100 tampon A ile elute. 280, elüsyon izlemek nm.</li>
		<li>DAR her tür için en yüksek karşılık gelen ve elde edilen alanlar aşağıdaki denklemi kullanarak entegre ederek Hesapla: DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2) /(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2) Trastuzumab (CypK, MMAE) 9.1 9.6 dk ve trastuzumab(MMAE) için2 10,5-11,0 min trastuzumab(CypK)2 için beklenen saklama süresi 7,5-8,0 min, belirtilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eşlenik LC-MS tarafından analiz<ol>
<li>Deglycosylate 30 µL 1 mg/mL ADC ve değiştirilmemiş antikor olmayan azaltılmasında en az 6 h 37 ° C'de için 250 PNGase F birimlerini kullanma koşulları</li>
		<li>Antikor bir C4 kütle spektrometre içine % 2 ila % 80 Asetonitril suda bir 20 dk degrade kullanarak 1-5 µm 1.0 x 100 mm sütun elute. 350-4000 pozitif iyon modu olarak bir m/z aralığında 150v bir koni voltajı ile veri almak.</li>
		<li>Uygun yazılımı kullanarak ham veri deconvolute. Kitle değiştirilmiş ve değiştirilmemiş antikor arasındaki farkı hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dihydropyridazine bağlantı Trastuzumab(TAMRA)2 serumda tahlil istikrar
<ol><li>Serum steril koşullarda 0,22 mikron filtre kullanarak filtre. 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ekleyebilirsiniz.</li>
	<li>96-şey plaka dış kuyu su ile doldurun. Merkez wells, filtre uygulanmış serum onaylatılacak 90 µL 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 ' de PBS 0.1 mg/mL nihai bir konsantrasyon, 10 µL ile karıştırmak. Plaka nem 37 ° C ve 4-%5 CO2ile doymuş bir kuluçka yerleştirin.</li>
	<li>Her 24 saat boyunca 5 gün, damlalıklı her iyice karıştırın, 5 µL aliquot, almak için iyi flaş-donma sıvı azot ile ve mağaza-80 ° C'de</li>
	<li>Tüm örneklerini topladıktan sonra aliquots çözülme ve bazı değişikliklerle daha önce bildirilen12 olarak dolaylı bir ELISA kullanarak analiz:<ol>
<li>96-şey 0,25 µg/mL HER2 4 ° C'de gecede plakalı kat Tüm diğer adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.</li>
		<li>Ertesi gün 5 kez PBS % 0.05 arası (PBS-T) yıkama ve 1 h için % 1 sığır serum albümin engellemek.</li>
		<li>Yıkama ve örnekleri 2 h için PBS içinde 1:10000 seyreltme, kuluçkaya.</li>
		<li>Yıkama ve Mouse 1:2000 seyreltme PBS-t ile % 0.5 BSA 1 h için yükseltilmiş bir anti-TAMRA antikor kuluçkaya.</li>
		<li>Yıkama ve PBS-t % 0.5 BSA için 1 h ile bir anti-fare HRP eşlenik 1: 1000 kuluçkaya.</li>
		<li>TMB ekleyin ve 5-10dk tepki.</li>
		<li>Reaksiyon 50 µL H2o yüzden bırak4 1 M ve ölçü absorbans 450 nm. 570 ölçülen arka plan çıkarmak nm.</li>
		<li>4-parametre logistic regresyon eğrisi standart dilutions için uygun ve ölçümler örneklerinden tanımlar. Not: trastuzumab(MMAE)2 kararlılığını ADC konsantrasyonunu ölçmek için 3,3 ticari bir ELISA kiti için açıklanan tahlil değiştirerek aynı iletişim kuralını kullanarak değerlendirildi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ADC sitotoksisite değerlendirmek
Not: Daha önce raporlanmış deneyleri23,26 bazı değişikliklerle bu protokolü dayanmaktadır.
<ol><li>SK-BR-3 ve MCF-7 hücreleri çözülme ve tam orta, yani içeren p25 şişeler içinde fetal Sığır serum, 100 adet/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin % 10 ısı ile desteklenmiş DMEM inaktive yerleşmek izin.</li>
	<li>% 80-90 izdiham (her 3-4 gün) en az 2 kez önce tahlil, hücreleri bölün.</li>
	<li>İki gün önce tahlil, 96-şey plaka dış kuyu su ile doldurun. Sonra Asansör hücreleri 0,5 mM EDTA, santrifüj 250 x g, 3 min % 0.05 tripsin ile yeni orta resuspend ve 96-şey tabak (boş) bir kuyu başına 100 µL 3000 hücrelerde tohum.</li>
	<li>İki gün sonra hücreleri, tohum nüsha tüm örneklerinde % 0,1 DMSO tam orta ile 10 seri dilutions hazırlayın. Aşağıdaki örnekler ve denetimleri düşünün: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab vahşi türü, tetrazine-vcMMAE ve MMAE.</li>
	<li>Her örneğinin 100 µL her kuyuya ekleyin ve 37 ° C ve 4-%5 CO25 gün kuluçkaya.</li>
	<li>5 günde, hücre canlılığı ölçmek. Bu amaçla, ticari bir kit hücreleri parçalayıcı ve serbest ATP ölçmek için kullanın. Sinyal kontrol hücreleri % 0,1 DMSO ile tedavi ile ilgili yüzdesi arsa. Not: ADCs serumda 5 gün boyunca inkübe ve sitotoksisite fonksiyonel istikrar kanıtlamak denetlesinler. Dikkat: MMAE çok zehirli. Bu nedenle eldiven ve gözlük MMAE türevleri işlerken kullanın. DMSO hisse senedi çözümde hazırladığınızda değiştirilmemiş MMAE bir denetim olarak denemenize, eğer sen kullanma, katı ürünün bir duman başlık içine işlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).</li>
<li>Wakankar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+Stability+of+the+Antibody%E2%88%92Drug+Conjugate+Trastuzumab-DM1%3A+Changes+due+to+Modification+and+Conjugation+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).</li>
<li>Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antineoplastic+Efficacy+of+Doxorubicin+Enzymatically+Assembled+on+Galactose+Residues+of+a+Monoclonal+Antibody+Specific+for+the+Carcinoembryonic+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen.</a> Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).</li>
<li>Hamblett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Drug+Loading+on+the+Antitumor+Activity+of+a+Monoclonal+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate.</a> Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates%3A+An+Emerging+Concept+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).</li>
<li>Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+and+Reprogramming+the+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanding and Reprogramming the Genetic Code.</a> Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).</li>
<li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li>
<li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Conjugates+with+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Approach+to+Site-Specific+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).</li>
<li>Kern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Pyrophosphate+Diesters+as+Tunable%2C+Soluble%2C+and+Bioorthogonal+Linkers+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).</li>
<li>Zimmerman, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Optimized+Non-Natural+Amino+Acids+in+a+Cell-Free+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).</li>
<li>VanBrunt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Azide+Containing+Amino+Acid+in+Mammalian+Cells+Enables+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Click+Cycloaddition+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Incorporation+of+Multiple+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Strategies+for+Single-Molecule+Protein+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Efficient+Procedures+for+the+Conjugation+of+Biomolecules+through+Huisgen+Azide-Alkyne+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).</li>
<li>Koehler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Code+Expansion+for+Multiprotein+Complex+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering.</a> Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).</li>
<li>Lyon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Hydrophobicity+of+Homogeneous+Antibody-Drug+Conjugates+Improves+Pharmacokinetics+and+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).</li>
<li>Elliott, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+Labeling+and+Protein+Identification+in+Specific+Tissues+and+at+Specific+Developmental+Stages+in+an+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal.</a> Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).</li>
<li>Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/qo/c7qo00054e">Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems.</a> Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).</li>
<li>Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Cyclopropene+Tags+with+Fluorogenic+Tetrazine+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).</li>
<li>Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Generation+of+Stable+Antibody-Drug+Conjugates+via+an+Encoded+Cyclopropene+and+an+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Multisite+Unnatural+Amino+Acid+Incorporation+in+Mammalian+Cells+via+Optimized+Pyrrolysyl+tRNA+Synthetase%2FtRNA+Expression+and+Engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+of+a+Cytotoxic+Drug+to+an+Antibody+Improves+the+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Reactive+Cysteine+Residues+for+Site-Specific+Labeling+of+Antibody-Fabs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Doronina, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+potent+monoclonal+antibody+auristatin+conjugates+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).</li>
<li>Shiraishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Highly+Reactive+Cysteine+Residues+at+Less+Exposed+Positions+in+the+Fab+Constant+Region+for+Site-Specific+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).</li>
<li>Sabourin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Antibody+Yield+and+Modulating+Final+Product+Quality+using+the+Freedom%28TM%29%5BTitle%5D)+AND+%22CHO-S%28TM%29+Production+Platform.+BMC+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM).</a> CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102(2011).</li>
<li>Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lines+as+Candidate+Reference+Materials+for+Quality+Control+of+ERBB2+Amplification+and+Expression+Assays+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer.</a> Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).</li>
<li>Shinmi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Conjugation+Method+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+through+Reactive+Cysteine-Engineered+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).</li>
<li>Badescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Disulfides+for+Stable+and+Defined+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).</li>
<li>Vazquez-Lombardi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+human+antibodies+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transient expression of human antibodies in mammalian cells.</a> Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).</li>
<li>Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaldi%2C+L+%22Protein+Expression+in+Mammalian+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols</a>. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için açıklanan trastuzumab(CypK)2 üretmek için geçici ifade prosedürü basit ve yüksek Birimsellik için sağlar. Bir akademik ayarı27 ' beklenen olanlar elde edilen verim içindedir ve istikrarlı hücre satırlarını üretim verim21daha da artırmak için oluşturulabilir. İfade sırasında CypK konsantrasyonları 5 mM alt ncAA birleşme neden olabilir ve yüksek miktarlarda hücre büyümesini etkiler ve azaltma antikor verimleri daha düşük. CypK ücretsiz bir amino asit düşük su çözünürlük vardır, böylece bu olmalı ilk 100 mm 0.1 M NaOH içinde çözünmüş ve kültür ortamına eklendi. CypK orta ve hücrelere eklemeden önce sulandrarak sonra orta HCl ve filtre sterilize etmek için ile nötralize etmek için önemlidir. Daha sonra bu protokol için belirtilen transfection reaktifler kullanarak ve üretici tarafından önerilen kuluçka kez takip yüksek verimli bir ifade için önemlidir. İnsan antikorların geçici ifade hakkında daha fazla ayrıntı için okuyucu diğer yayımlanmış protokolleri31olarak,32denir.
Antikor saf, protein A reçine yüksek bir fazlalığı tam antikor yıkmak süpernatant üzerinden sağlamak için belirtilen şekilde gereklidir. Trastuzumab yağış sırasında elüsyon önlemek için bir çözüm ile yüksek tamponlama kapasitesi, seyreltik PBS ile hemen kullanın ve aşırı konsantrasyon kaçınarak arabellek Döviz için tavsiye ediyoruz. Her zaman tutmak antikor < 5 mg/mL.
Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE ile konjugasyon çoğu reaksiyonlar ile diğer bioorthogonal kolları ADCs için bildirilen hızlıdır. Ayrıca, bu cycladdition çok hafif koşullarda oluşur: oda sıcaklığında veya alt ve fizyolojik pH. Asetonitril önce PBS ve antikor eklenmesi ile Reaktanları DMSO hisse senedi çözümleri sulandırmak önemlidir; Aksi takdirde tetrazine türevleri çökelti. Asetonitril sadece MMAE ve TAMRA yüksek hydrophobicity nedeniyle gereklidir, ancak daha az hidrofobik moleküller ortak bir çözücü ilavesi gerekmeyebilir. Alternatif olarak, tetrazine-vcMMAE Asetonitril ve molar karşılıkları sadece 2: tetrazine-vcMMAE 20 h içinde olmadan Birleşik. Bu miktar toksin geçerli ncAA tabanlı teknolojileri ile karşılaştırıldığında ADC üretim maliyetini önemli bir düşüş içerebilir. Trastuzumab(CypK)2 4 ° C'de muhafaza ne zaman tam olarak en az 4 ay için reaktif
MMAE son derece hidrofobik ve antikor conjugates 0, 1 ve 2 toksinler ile karşılık gelen doruklarına mükemmel bir çözüm sağlar beri HPLC hıc DAR doğru bir şekilde belirlenmesi sağlar. Unreacted tetrazine-vcMMAE civarında 13,7 min elutes ve 280 algılanır nm. Bu teknik ile yüksek saflıkta bir başlangıç malzemesi gerektirir. Ayrıca, bu saklama süreleri ve doruklarına şekli değiştirebilir beri BCN-OH tetrazine reaktif başka moleküllerin ile reaksiyonu gidermek için tavsiye değildir. Bu özellikle birden fazla 10-20 µL enjekte edilir Eğer örnekleri tuz konsantrasyonu mobil faz birinde degradenin başlangıcında iyi bir ayrılık elde etmek için eşleştiğini esastır.
LC-MS analizi ile ilgili deglycosylation antikor örnekleri tek bir tepe üzerine deconvolution ham spektrum elde etmek için gereklidir. Toplam antikor ve ADC kitleler doğruluğunu aleti kalibrasyon bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, değişiklik için kitle hesaplamak için değiştirilmemiş karşı antikorlar ADC elde bir elde edilen toplu çıkarma. Modern yüksek çözünürlüklü kütle spektrometreleri göreli bir hata 1:10000 aşağıda sağlamalıdır. LC-MS de farklı türler arasındaki oran hesaplamak için kullanılabilir, bu değer genellikle bir tahmindi değişiklik oluşturulan tür iyonlaşma kapasitesini etkileyebilir ve yabancı maddelerin düşük miktarda tespit çünkü olsa da.
Çünkü içinde yüksek toksisite ve alt etkinlik ürün, ilacın erken sonuçlar ADCs bağlayıcı kararlılığını önemlidir; Ücretsiz Sitotoksin sağlıklı dokulara zarar ve çıplak antikor hastalıklı hücreleri üzerindeki hedef bağlama siteleri için silahlı biri ile birlikte buz dansında yarışmaktadır. Bir yayın istikrar tahlil değişkenlik içinde olan %5 aşağıda beklenmelidir.
Son olarak, öyle aynı derecede trastuzumab(MMAE)2 (HER2 yüksek) SK-BR-3 hücrelerdeki sitotoksisite karşılaştırarak tespit edilebilir ve MCF-7 hücreleri (HER2 düşük) beri ikinci 15-fold daha az HER2 reseptörleri eski28 daha hızlı HER2 hedefleme bir ADC selectivity . İmmunoconjugate en az 2 büyüklük SK-BR-3 MCF-7'ye kıyasla daha düşük bir hücre canlılık sonuçlanması bekleniyor. SK-BR-3 EC50 bu ADC29,30yüksek potens yansıtan iki basamaklı nanomolar aralığında olmalıdır. Değiştirilmemiş antikor trastuzumab(MMAE)2 veya trastuzumab, bu tahlil zehirlenmesi göstermek. Bağlayıcı peptidomimetic toksin etkinliğini kaldırır beri Tetrazine-vcMMAE bir etkisi 3 büyüklük ADC düşük olmalıdır. Tersine, MMAE hücre zarı30nüfuz mümkün olduğundan, ADC için benzer bir toksisite var ama hiçbir ayrımcılık HER2 yüksek ve HER2 düşük hücre satırları arasında görüntülemek olmalı. Bu tahlil serumda ADC 5 günlük kuluçka sonra gerçekleştirilirse, Ayrıca, işlevsel bir bağlayıcı kararlılığını kanıtlamak kullanılabilmesi için: Eğer MMAE p ile serbest toksini bir yayın içine ya ADC verimliliği SK-BR-3'te bir düşüş neden olur Sanat bağlayıcı veya bağlayıcı traceless bir biçimde i ciddi Eğer selectivity bir düşüş.
Burada açıklanan ADC teknoloji lizin cyclopropene türevi verimli ve siteye özel ortaklığın IgG1s içine sağlar. Facile arıtma, antikorlar hızla tetrazine içeren moleküller homojen ürünler verimli ile Birleşik. Küçük boyutu ve cyclopropene en az tanıtıcının yüksek reaktivite nedeniyle, bu yöntem sterically engel payloads konjugasyon etkinleştirmeniz gerekir. Elde edilen immunoconjugates serum içinde istikrarlı ve son derece güçlü ve seçici. Genel olarak, CypK antikor ve tedavi veya tanı kullanılmak üzere diğer conjugates protein için hızlı, siteye özgü ve istikrarlı bioorthogonal bağlantı sağlar.

Antikor-uyuşturucu conjugates (ADCs) biotherapeutics seçicilik ve küçük sitotoksik moleküller potens birleştirir. Çoğu ADCs DNA veya Mikrotubul polimerizasyon kanser hücreleri1etkileyen ilaçlar hedefleyerek geleneksel kemoterapinin yan etkileri azaltmak amaçlanmaktadır. Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış ilk nesil ADCs azalmış Farmakokinetik Özellikleri2farklı pozisyonlarda değiştiren molekülleri karışımları oluşturan değişiklik lysines ve katıldı, güveniyor. Buna karşılık, siteye özgü konjugasyon antikorlar için ilaçların bileşikler ile geliştirilmiş tedavi indeces3,4oluşturabilirsiniz. Homojen ADCs üreten sorun adrese isteyen, birkaç seçmeli kimyasal ve enzimatik değişiklikler bildirilen1,5olmuştur. Ancak, geçerli yöntemleri yalnızca belirli pozisyon antikor üzerinde hedef, düşük protein ifadeden acı, halkalı ile düşük istikrar sağlamak veya yavaş ve düşük verimli reaksiyonlar kullanmaz.
Kanonik olmayan amino asitler (ncAA) genetik kod genişletilmesi yoluyla ortaklığın proteinler, potansiyel olarak oluşturmak için kullanılan bir diğer yöntem sınırlamaları aşmak siteye özgü yüklemesine bioorthogonal reaktif grup bir bolluk sağlar ADCs. NcAAs yanıt olarak bir hedef (Durdur) kodon kodlama kurallı amino asitler6dahil endojen çiftleri için ortogonal Aminoasil tRNA sentetaz/tRNA çiftlerini kullanır. Birkaç ncAAs ADCs oluşturmak için antikorlar dahil edilmiştir. Ancak, en tedavi edici ilaç konjugasyon uygulamalarında çeşitli yükümlülükler muzdarip. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 tam olarak bioorthogonal, süre azides p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10gibi düşük pH (4.5) ve uzun tepki süreleri (> 60 h), gerektirir değil, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11ve lizin (AzK)12,13 azid türevi hücre14' te azalabilir ve Huisgen cycloadditions katalizler için kullanılan bakır oksidatif hasara neden olabilir 15.
Her ne kadar alternatif ncAAs trans-cyclooctene (TCO) dayalı, cyclooctyne (SCO) ve bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) son zamanlarda bir antikor biyo-görüntüleme amaçları için kodlanmış, ifade sistem çok düşük verimleri (0,5 mg/L)16' dan uğrar. Ayrıca, cyclooctenes ve cyclooctynes büyük ve toplama -ADC payloads ADC yatkınlık artabilir hidrofobik kolları geleneksel olarak hidrofobik ve bağlayıcı fizikokimyasal özelliklerini büyük ölçüde gösterilmiştir farmakokinetik ve tedavi endeksi17etkisi. Buna karşılık, 1,3-disubstitued cyclopropenes en az değişiklik protein yapısı ve physichochemical özellikleri18' neden olmamalıdır küçük reaktif gruplarıdır. Cyclopropenes tetrazines yolu ile bir ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition19ile seçerek ve hızla tepki. Bu protokol için biz yapmak daha az bir metil cyclopropene steric engel daha büyük gergin doymamış döngüleri tarafından etkilenen ve reaksiyon hızı sabit sırasına göre 1-30 M-1s sahip lizin (CypK, Şekil 1b) taşıyan bir türev kullanımı -1 sulu medya18,20.
Biz son zamanlarda nasıl CypK bu çok az bioorthogonal SAP tetrazine taşıyan moleküller21ile tepki tarafından ADCs oluşturmak için antikorlar içine dahil bildirdi. Burada biz ADC hazırlık en zor adımlar üzerinde durularak daha ayrıntılı olarak açıklayınız. Pyrrolysyl-tRNA sentetaz (PylRS) kullanarak CypK birleşmesiyle yönetmen / tRNACUA(PylT) (HC)22yanıt antikor ağır zincir tanıttı bir kehribar kodon olarak eşleyin. Burada iki plazmid geçici transfection (Şekil 1a), bir antikor ağır zinciri kodlama ve her iki PylRS/PylT kaset içeren hafif zincir (LC), kodlama diğeri için kullanırız. Alternatif olarak, daha yüksek antikor verimi sağlar istikrarlı hücre kültürünü daha zahmetli bir yordam21oluşturulabilir.
Yukarıda belirtilen ifade sistemleri tedavi anti-HER2 immünglobulin 1 (Igg1) üretebilirsiniz trastuzumab ile vahşi tipi antikor için benzer düzeyde CypK. Biz CH1 ncAA (HC-118TAG) kodlamak için ağır zincir etki alanında ilk konumunu seçildi. Bu en sık değiştirilen site ADCs23 yılında ve HC-118 (EU numaralandırma) bilinen ama da için HC-121 (sıra konumu) ve HC-114 (Kabat numaralandırma)24anılır olmuştur. Bu pozisyon bütün IgG1s korunmuş, bu ifade sistemleri en terapötik antikorlar mükellef olmalıdır.
Trastuzumab(CypK)2 kolayca protein tarafından izlenen bir hızlı protein sıvı kromatografi ile hidrofobik etkileşim sütun (FPLC-hıc) tarafından saf göster. Daha sonra antikor kovalent Mikrotubul polimerizasyon inhibitörü monomethyl auristatin E (MMAE), FDA onaylı ADC Adcetris kullanılan 3 h içinde bağlantılıdır. Burada glutarate ayırıcı ve p- aminobenzylalcohol self-immolative birimi tarafından takip valin-citrulline proteaz değişken bileşen oluşan bir bağlayıcı ile MMAE (tetrazine-vcMMAE) Benzil-tetrazine türevi kullanırız; Bu bağlayıcı tarafından Cathepsin B lysosome toksin25traceless sürümde kaynaklanan ADC içselleştirilmesi üzerine içinde i ciddi. Geniş kapsamı tepki gösterebilmek için antikor de fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA) bağlıdır. Biz sıvı kromatografi kütle spektrometresi (LC-MS) birleştiğinde tarafından eşlenik olmasını kimliğini doğrulamak ve uyuşturucu antikor oranı (DAR) yüksek performanslı sıvı kromatografi ile bir hidrofobik etkileşim sütun (HPLC-hıc) kullanarak hesaplamak için nasıl açıklamak .
Antikor performansı karakterizasyonu bir parçası olarak, biz insan serumu dihydropyridazine bağlantı kararlılığını test edileceğini açıklar. Bu parametre daha kolay tarafından basit bir ELISA sayılabilir ve sonuçların yorumlanması trastuzumab(MMAE)2proteaz değişken bileşeni tarafından karmaşık değil çünkü trastuzumab-TAMRA içinde değerlendirilir. Son olarak, seçicilik ve trastuzumab(MMAE)2 potens değerlendirildi HER2 farklı düzeylerde ifade hücre hatları üzerinden ADC cytoxicity karşılaştırarak. Bu tahlil de insan serumu immunoconjugate kuluçka sonra gerçekleştirildiğinde ADC istikrar işlevsel bir kanıtı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Expi293F</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14527</td><td>HEK süspansiyon hücreleri</td></tr><tr><td>Expi293 Ekspresyon Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1435101</td><td>Ekspresyon ortamı</td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Penisilin-streptomisin-amfoterisin B</td></tr><tr><td>125mL Polikarbonat Erlenmeyer Havalandırma Kapaklı Şişesi</td><td>Corning</td><td>431143</td><td>Şişeleri sallayın</td></tr><tr><td>Brunswick S41i inkübatörü</td><td>Eppendorf</td><td>S41I230011</td><td>çalkalayıcılı CO2 inkübatörü</td></tr><tr><td>Sulu çözelti içinde sodyum hidroksit 4 mol/l (4 N)</td><td>VWR</td><td>191373M</td><td></td></tr><tr><td>Siklopropen lizin</td><td>Sichem</td><td>SC-8017</td><td>Bu çalışmada Elliot ve ark. 2014</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22 & mikro; m, polietersülfon, gama ışınlanmış</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>ExpiFectamine 293 Transfeksiyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14525</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>5810 R santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5811000460</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m, polietersülfon, 33 mm, gama sterilize</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Protein A reçinesi</td><td>Sino Biyolojik</td><td>10600-P07E-RN-25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Kromatografi Kolonları, 50 Paket</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>Polipropilen kromatografi kolonu</td></tr><tr><td>Ekono-Sütun Huni</td><td>Bio-Rad</td><td>7310003</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Fluka</td><td>71635</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA kaşifi FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC Seçim Kiti</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4110-07</td>, <td>HiTrap 1 mL Butil HP</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>VWR</td><td>2133.296</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Honywell</td><td>34863-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazin-vcMMAE</td><td>ChemPartner içerir</td><td>-</td><td>Costum sentezlenmiş</td></tr><tr><td>Tetrazin-5-TAMRA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-017-05</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Jel 1.0mm x 10 kuyulu</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini Hücreli</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4,6 x 100 mm, 5 & m</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>088553</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England BioLabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcquity</td><td>Suları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4 BEH 1-5 & mikro; m 1.0 x 100 mm UPLC kolonu&nbsp;</td><td>Sular</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü için 96 oyuklu mikroplakalar</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>İnsan serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-20mL</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HER2 ECD</td><td>Çin Biyolojik</td><td>10004-HCCH</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TAMRA</td><td>Abcam</td><td>an171120</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>BioLengend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Plaka okuyucu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>CellTiterGlo 2.0 Testi</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Hücre lizizinden sonra salınan ATP ölçümüne dayanan hücre canlılığı testi. Çıkış sinyali parlaklıktır.</td></tr><tr><td>Monometil Auristatin E</td><td>Cayman Chemical</td><td>16267</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Mikrohacim spektrofotometresi</td></tr><tr><td>İnsan IgG ELISA Quantificaiton Seti</td><td>Bethyl</td><td>E80-104</td><td></td></tr><tr><td>MaxEnt1 MassLynx</td><td>Waters'da kütle spektrumu</td><td></td><td>dekonvolüsyonu için yazılım uygulaması</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Coomassie bazlı leke</td></tr><tr><td>Sağlam MMAE-ADC ELISA Kiti (Sandviç Testi)</td><td>Epitope Diagnostics, Inc.</td><td>KTR 782</td><td></td></tr><tr><td>Tüp 50 mL, 114x28mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>Konik boru</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri 50.000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td>Santrifüj filtrasyon yoğunlaştırıcısı (protein A'nın aşağı çekilmesinden sonra)</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Üniteleri 50.000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC805024</td><td>Santrifüj filtrasyon konsantratörleri (FPLC veya HPLC saflaştırmasından sonra)</td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuzdan Arındırma Kolonları, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>89882</td><td>Boyut dışlama spin kolonları</td></tr><tr><td>Tüp PCR 0.2ml Düz Kapaklı</td><td>Devedikeni Scientific Ltd</td><td>AX-PCR-02-C-CS</td><td>PCR tüpleri</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp & ordf; ELISA için düz tabanlı</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>44-2404-21</td><td>Plakalar</td></tr></tbody></table>

genetik bir kanonik olmayan amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama conjugates bir hızlı bioorthogonal tepki

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Günümüzde klinik uygulamada kullanılan antikor-uyuşturucu conjugates (ADCs) karışımları toksinler farklı konumlardaki farklı sayıda bağlı antikor moleküllerin çoğu. Preklinik çalışmalar bu geleneksel ADCs tedavi Dizin toksinler siteye özgü bağlantı tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Ancak, homojen ADCs üretmek için geçerli yaklaşımlar düşük protein ifade ve yavaş reaksiyon kinetiği gibi bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol için lisin (CypK) cyclopropene türevi genetik kod genişleme kullanarak antikorlar dahil etmek için bir ifade sistemi kurmayı nasıl açıklar. Bu çok az bioorthogonal SAP tetrazine türevlerinin bir ters isteğe Diels-Alder cycloaddition aracılığıyla hızlı konjugasyon sağlar. Rapor burada ifade sistemi facile üretim ve arınma her ağır zincir CypK taşıyan trastuzumab sağlar. Biz nasıl antikor toksin monomethyl auristatin E bağlantı ve hidrofobik etkileşim Kromatografi ve kütle spektrometresi immunoconjugate karakterize açıklar. Son olarak, biz deneyleri konjugasyon kaynaklanan dihydropyridazine bağlantı insan serumu istikrardır değerlendirmek ve meme kanseri hücreleri ADC seçici sitotoksisite HER2 reseptör yüksek seviyede olan sınamak için tarif.

Bildirilen geçici ifade sistem (Şekil 1a) 22 ± 2 mg trastuzumab(CypK)2 2/3 (resim 1 c) aynı koşullar altında üretilen yaban tipi antikor temsil eden kültür ortamının litre başına verir. İstikrarlı hücre bu verim 31 ± 2 mg/L21kadar artırabilirsiniz.
Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE, yarı homojen trastuzumab(MMAE)2 3 h 25 ° c (Şekil 2) içinde verimleri ile Birleşik. Bu Sitotoksin yüksek hydrophobicity % 10 Asetonitril 5 zaman eklenmesi gerektirir veya toksin CypK başına daha fazla molar karşılıkları kullanılır. Alternatif olarak, cycloaddition da 20 h 2 tetrazine-vcMMAE Asetonitril (Şekil 2 c) olmadan karşılıkları kullanarak içinde tamamlanır. Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-TAMRA içinde 25 ° c 2 h ile reaksiyona girer ve 3-6 h are gerekli ne zaman sıcaklık 4 ° C (Şekil 3 c) azalır.
HPLC-hıc tarafından ölçülen trastuzumab(MMAE)2 için beklenen DAR 1.9 (Şekil 2b) olduğunu. Başlangıçta kromatografik 8.0 dk içinde gözlenen tepe çekimsiz antikor (DAR 0) temsil eder ve reaksiyon tamamlandığında tamamen kayboldu. DAR 1 bu türe 9.1 9.6 min elutes ve bir alanı &lt; 3 h sonra olmalıdır; ve DAR 2 hedef ürün 10,5-11,0 beklenen alan % &gt; 90 ile bir saklama süresi vardır. Hareketlilik shift ve SDS-sayfa jelleri floresans onaylar TAMRA (Şekil 3b) birleşme ve immunoconjugates kimlik LC-MS tarafından (Şekil 2B-e ve şekil 3d) doğrulanır.
5 gün içinde insan serumu ve ELISA tarafından daha sonraki analiz için trastuzumab(TAMRA)2 kuluçka yükü antikor (4b rakam) bağlı kalır onaylar. Trastuzumab(MMAE)2 yüksek kudret SK-BR-3 (HER2 yüksek) meme kanseri hücreleri, bir yarım maksimal etkili konsantrasyon (EC50) gösterir 55 ± sitotoksisite tahlil ile ilgili olarak 10 pM (Şekil 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 sitotoksisite kuluçka 5 gün sonra insan serumu (Şekil 4 c) tutar. ADC MCF-7 (HER2 düşük) denetlesinler zaman tersine, EC50 200-fold (Şekil 4 d) daha düşük. MMAE yüksek non-selektif sitotoksisite her iki hücre satırlarını (Şekil 4e) görüntüler, ancak vahşi tipi antikor, trastuzumab(CypK)2 ve tetrazine-vcMMAE son derece düşük toksisite (rakamlar 4 d ve 4e), göster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig1.jpg"> Şekil 1: geçici ifade sistem. A. ilgili HEK293 hücrelerdeki geçici transfection için kullanılan plazmid bölgelerinde. CMV: sitomegalovirüs organizatörü, WPRE: dağ sıçanı hepatit virüsü Posttranscriptional düzenleyici eleman, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: belirli organizatörü, PylRS: pyrrolysil tRNA sentetaz, &gt; ve &lt;: transkripsiyon yönünü. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. vahşi türü (WT) trastuzumab ifade verir ve bir Batı ölçülen trastuzumab(CypK)2 leke protein sonra bir saflaştırma. Hata çubukları biyolojik triplicates standart sapması temsil eder. Bu rakam Oller ada çayı ve ark. izniyle değiştirildi 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig2.jpg"> Resim 2: Fiil trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE ile. A. tersini elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition antikor CypK kalıntı ve MMAE tetrazine türevi arasında. Tepki grupları kırmızıyla vurgulanır, p- aminobenzylalcohol yeşil ve mavi valin-citrulline dipeptid tasvir edilir. B. antikor konjugasyon ilerlemesini gösteren HPLC hıc chromatograms. C. derecesi farklı reaktif konsantrasyonları kullanarak 1.9 dönüşüm ile ilgili en çok DAR. D-E. Tam uzunlukta antikor kitle spectra öncesi ve sonrası konjugasyon deconvoluted. Trastuzumab(CypK)2 istikrarlı hücre kullanarak elde edildi. Bu rakam Oller ada çayı ve ark. izniyle değiştirildi 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig3.jpg"> Şekil 3: Fiil trastuzumab(CypK)2 tetrazine-TAMRA ile. A. tersini elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition antikor CypK kalıntı ve TAMRA tetrazine türevi arasında. B. SDS-sayfa hareketlilik shift ve TAMRA konjugasyon tarafından kökenli jel floresan gösterilen jelleri. C. konjugasyon kinetik iki farklı sıcaklıklarda. Ö Deconvoluted kütle spektrumu trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 istikrarlı hücre kullanarak elde edildi. Bu rakam Oller ada çayı ve ark. izniyle değiştirildi 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig4.jpg"> Şekil 4: serum ve sitotoksisite trastuzumab conjugates bir istikrardır. A. bir internalizing ADC istenen özellikleri vurgulayarak çizgi film. B. istikrar trastuzumab(TAMRA)2 ELISA ölçülen insan serumu. C. hücre canlılığı tahlil trastuzumab(MMAE)2 insan serumu (+ serum, siyah) 5 gün sonra. Bir denetimi örneğini inkübe PBS içinde serum yerine (-serum, kırmızı) aynı assay olarak eklenmiştir. Ö. hücre canlılığı tahlil taze seyreltilmiş antikor örnekleri ile. E. hücre canlılığı tahlil taze seyreltilmiş MMAE türevleri ile. Hata çubukları 3 bağımsız deneyler ortalaması standart hatasını temsil eder. Bu rakam Oller ada çayı ve ark. izniyle değiştirildi 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Lizin cyclopropene türevi antikorlar birleşmeyle antikor-uyuşturucu conjugates oluşturmak için tetrazine taşıyan moleküller siteye özgü, hızlı ve verimli bağlantı sağlar.

Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Bu yöntem protein modifikasyonu alanında önemli bir araç sağlar, antikor ilaç conjugates kolay ve verimli nesil sağlayan. Bu tekniğin başlıca avantajları kullanım kolaylığı, antikor üretiminin yüksek verimi, psikodizyon reaksiyonunun hızı ve oluşan bağlantının stabilitesidir. Bu yordamı, metin protokolünde açıklandığı gibi büyüyen HEK süspansiyon hücreleriyle başlayın.Mililitre başına 2,5 milyon hücrenin yoğunluğuna ulaşıldığında, 1 molar sodyum hidroksitte lizin veya CpK siklopropen türevinin yeni bir çözeltisini hazırlayın. Antibiyotiklerle takviye edilen ifade ortamına 2,5 mililitre CpK ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve bir azı yağı HCl 250 mikrolitre ekleyin, sonra 22 mikron filtre kullanarak çözeltisterilize.Şimdi 500 x g'de hedef yoğunlukta 125 milyon hücreyi beş dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, CPK içeren ifade ortamına DNA-transfeksiyon reaktif karışımını ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için bu ortamı kullanın. CpK eklenmesinden altı ila yedi gün sonra, 3, 000 x g 15 dakika boyunca hücreleri santrifüj tarafından supernatant cpk antikorları taşıyan trastuzumab hasat.Sonra, supernatant filtre. Şimdi 250 mililitre konik tüpler 5x boncuk yıkama tampon ekleyin ve supernatant ile karıştırın ve önceden ayarlanmış protein A reçine ekleyin. Antikor ve supernatant aşağı çekmek için oda sıcaklığında üç saat boyunca bir rulo üzerinde konik tüp yerleştirin.Kuluçkadan sonra, protein a reçinesini supernatant ile bir kolona aktarın ve sıvının akmasını bekleyin. Sonra yıkama tampon 25 mililitre ekleyin ve üzerinden akmasına izin verin. Toplama tüpüne bir milimetre lik bir azı dişi fosfat tamponu, 150 milimolar sodyum klorür ekleyin ve antikordan dört mililitre 1 molar sodyum sitrat pH 3 ekleyin.Asidik çözelti, toplama tüpünde bulunan temel çözelti ile kolondan çıkarken hemen nötralize edilir. Sonra, pbs 10 mililitre ile antikor seyreltin. Santrifüj filtrasyon ile 5-1 mililitre antikor konsantre ve PBS ile tampon üç kez değişimi.30 dakika boyunca yüksek tuz tampon düşük tuz tampon sıfır ila% 100 degrade ile bir bütil hidrofobik etkileşim sütunu kullanarak FPLC ile örnekleri arındırın. Tüm kesirleri toplamak ve 280 nanometre de elütion izleyin. Santrifüj filtrasyon ile antikor içeren kesirleri yoğunlaştırın ve tamponu PBS ile üç kez değiştirin.Antikor daha sonra dört santigrat derecede saklanabilir. Monometil auristatin E veya MMAE, son derece zehirlidir. Bu nedenle, MMAE türevlerini kullanırken eldiven ve gözlük kullanın.Kontrol olarak değiştirilmemiş MMAE kullanıyorsanız, MSO'da stok çözeltisini hazırlarken katı ürünü bir duman kaputunun içinde kullanın. Antikoru tetrazin yatak molekülü ile birleştirmek için, tetrazin MMAE'nin antikor başına 10 molar eşdeğerliğini, 20 mikrolitre asetonitril ve 76 mikrolitre PBS'yi küçük bir konik tüpte seyreltin. CpK taşıyan trastuzumab bir azı dakikası eşdeğeri ekleyin.Iyice karıştırın ve MMAE bağlı trastuzumab oluşturmak için oda sıcaklığında üç saat boyunca tepki sağlar. MMAE dışındaki moleküller potansiyel olarak daha büyük ve daha sterik olarak engellenmiş olarak bu protokol kullanılarak antikora bağlanabilir. Bir dakika boyunca 1500 x g'de spin sütununa ve santrifüjüzerine reaksiyonun tüm hacmini ekleyin.Eşlebiği analiz etmek için HPLC HIC sütununa %100 yüksek tuz tamponu ile beş dakika denk verin. Daha sonra mmae'ye bağlı trastuzumabın mililitre çözeltisi başına 15 mikrolitreyi bir şişede 15 mikrolitre 2X yüksek tuz tamponu ile karıştırın. Karışımı HPLC sütununa enjekte edin.Bir dakika için% 100 yüksek tuz tampon ile dakikada bir mililitre akışı bir otokratik elute. Bunu, düşük tuz tamponundaki yüksek tuz tamponunun yüzde 100'ünden sıfırına kadar 15 dakikalık bir degradeyle takip edin. Elüsyonu 280 nanometreden izleyin.Kromatogramdaki zirveleri sırasıyla sıfır, bir ve iki konjuge toksiniçeren trastuzumab'a karşılık gelen 7,5, 9,2 ve 11,5 dakika tutma süreleri ile entegre edin. Şimdi, 9,2 dakika, bir ağırlığı olan zirvelerin alanları ekleyerek DAR hesaplayın, ve 10,5 dakika, iki bir ağırlığı vardır, ve üç zirvenin toplam alanına bölün. LC-MS ile konjuge analiz etmek için, ilk, mililitre ADC başına bir miligram 30 mikrolitre deglikozilat ve 37 santigrat derece en az altı saat pngase F 250 birimleri kullanarak azaltıcı olmayan koşullarda değiştirilmemiş antikor.Serumu eritin ve 22 mikronluk bir filtreden geçirin. Daha sonra 96 kuyuluk bir tablanın dış kuyularını suyla doldurun. Merkezi kuyularda, pbs mililitre trastuzumab tetramethylrhodamine başına mililitre başına 10 mikrolitre ile serum triplicate 90 mikrolitre karışımı mililitre başına 1 miligram nihai konsantrasyonda.Plakayı 37 santigrat derece ve %4 CO2'de nem le doymuş bir kuvöze yerleştirin. Beş gün boyunca her 24 saatte bir, pipet her iyi iyice karıştırmak ve beş mikrolitre aliquot almak. Flaş sıvı nitrojen ile aliquot dondurma ve 80 santigrat derece de saklamak.Tüm örnekler toplandıktan sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, aliquots çözülme ve dolaylı bir ELISA kullanarak analiz. Alternatif olarak, ticari bir ELISA kiti ADC konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. Tgörünüşe iki gün önce, 96 kuyuluk tabağının dış kuyularını suyla doldurun.Sonra 5 milimolar EDTA% 05 tripsin ile hücreleri kaldırın. 250 x g'de hücreleri üç dakika santrifüj edin ve yeni ortamda yeniden askıya alın. Sonra 96 kuyu plakasında kuyu başına 100 mikrolitrede 3,000 hücre tohumve kuvöze geri yerleştirin.Hücreleri tohumlamadan iki gün sonra, tüm numunelerin seri seyreltmelerini tam ortamda %1 DMSO ile üç emetri halinde hazırlayın. Şimdi her kuyuya her numuneden 100 mikrolitre ekleyin ve 5 gün boyunca 37 santigrat derece ve %4 CO2'de kuluçkaya yatırın. Beşinci günde, hücrenin canlılığını ölçün.Bu amaçla, hücreleri lyse ve yayımlanan ATP ölçmek için ticari bir kit kullanın. %1 DMSO ile tedavi edilen kontrol hücreleri ile ilgili sinyal yüzdesini çizin. ADC'ler serumda beş gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılabilir ve fonksiyonel stabiliteyi kanıtlamak için sitotoksisite için tahpan edilebilir.Bir siklopropen saplı bir antikor protein A saflaştırma sonra litre başına 20 miligram üzerinde verimleri ile bu prosedür kullanılarak elde edilebilir. Üretilen antikor hızlı ve site özel bir tetrazin taşıyan bir toksin için konjuge olabilir. Bir toksin ile antikor konjugasyonu üzerine, antikor oranları ortalama ilaç 1.9 daha büyüktür, hidrofobik etkileşim kromatografisi ile ölçülen.ADC'nin kimliği kütle spektrometresi ile doğrulanır. Üretilen dihidropyridizene bağı insan serumunda 5 günden fazla 37 santigrat derecede stabildir. Antikor ilaç konjuge güçlü ve seçici HER2 yüksek düzeyde hücreleri öldürür, HER2 düşük seviyelerde hücreler yerine.Ayrıca, toksin ve tetrazin bağlayıcı ile modifiye toksin olmadan antikor çok düşük toksisite var. Toksin tek başına seçicilik elde etmek için hedefleme ihtiyacını vurgulayan bir NON-HER2 bağımlı toksisite gösterir. Bu prosedürü takiben, tümörlerin tedavisi için antikor ilaç konjugatlarını hızlı ve verimli bir şekilde hazırlayabiliriz.Potansiyel olarak, tetrazin ile işlevsel herhangi bir ilaç bir kanser hücresi biyomarker hedefleyen herhangi bir antikor ile bağlantılı olabilir. Bu tekniğin etkileri tedavi veya tanı için tasarlanmış herhangi bir protein konjuge uzanır.

genetic-encoding-non-canonical-amino-acid-for-generation-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu video, antikor-ilaç konjugatlarının hidrofobik etkileşim sıvı kromatografisi tabanlı karakterizasyonunu göstermektedir. Bütil ligand bazlı bir kromatografi kolonu kullanılarak, antikor-ilaç konjugatları, ligand ile hidrofobik etkileşimler yoluyla karakterize edilir.

Bütil Bağımlı Hidrofobik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofobik Etkileşimlere Dayalı Antikor-İlaç Konjugatlarını Karakterize Etmek İçin Bir Teknik

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Burada, L-dihydroxyphenylalanine uzarlar basit başlangıç malzemelerden genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama için bir iletişim kuralı mevcut.

Genetik birleşmesiyle uzarlar L-dihydroxyphenylalanine (basıncın) ve uygulama için Protein konjugasyon

Bu protokol için biz BAKLA, bir phenyoxadiazolyl metil sulfone tabanlı reaktif yükler site seçici bağlantı için biomolecules, özellikle antikorlar thiols sentezi anlatacağız. Buna ek olarak, biz malzemelerin ve BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatör ve onun konjugasyon bir modeli antikor için anlatacağız.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

Keşfedin antikor-ilaç konjugatları üretimi için sitenin özgü modifikasyon yöntemini. Siklopropen türevi kullanarak yüksek verimli ve stabil ADC'ler elde edin. Bu teknik kanser tedavisinde hedefe yönelik terapötik uygulamalar sağlar.

Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki

Daha fazla video keşfet