Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini

Bu protokolün genel amacı, spektrofotometrik bir yöntem kullanarak model siyanobakteri Synechocystis'teki fikobiliprotein içeriğini kantitatif olarak belirlemektir. Fikobiliproteinler, prokaryotik siyanobakterilerde ve birkaç ökaryotik alg grubunda ışık hasat antenlerinin ana bileşenlerini temsil eden suda çözünür pigment-protein kompleksleridir. Ana ışık toplama kompleksleri oldukları için, fikobiliproteinler, alg ve siyanobakteri verimliliğini belirleyen en önemli faktörlerden birini temsil eder.

Synechocystis, dünya çapında yüzlerce laboratuvarda kullanılan model bir siyanobakteridir. Synechocystis, fikosiyanin ve allofikosiyanin olmak üzere iki fikobiliprotein içerir. Bu protokol, bu küf suşundaki her iki fikobiliproteinin kantitatif tayini için basit, verimli ve güvenilir yöntemi açıklar.

Fikobiliproteinlerin ekstraksiyonu ve spektrofotometrik miktar tayini olmak üzere çeşitli yöntemleri karşılaştırdık. Fikobiliproteinlerin absorpsiyon spektrumları farklı suşlar arasında değişebileceğinden, miktar belirleme yönteminin her bir suş için test edilmesi gerekir. Fikobiliprotein ekstraksiyonunun başlangıcında, bir mililitre siyanobakteri kültürünü güvenli bir kilitli tüpe aktarın.

Numunelerin kuru ağırlığını belirlemeye karar verirseniz, kültür numunesinden önce boş tüpleri tartın. Kültürün tortulaşmadığından emin olun. Hücreleri laboratuvar sıcaklığında 15.000 G'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice atın. Peleti rahatsız etmediğinizden emin olun. Numuneleri dondurucuya koyun.

Uzun süreli saklama için numuneleri 80 santigrat derecede tutun. Bu, fikobililiproteinlerin bozulmasını önlemek için gereklidir. Numuneler dondurulduktan sonra dondurarak kurutucuya yerleştirin.

Dondurarak kurutma başladıktan sonra, dondurarak kurutma makinesinin sıcaklığını ve basıncını kontrol edin. Sıcaklığın 60 santigrat derecenin altında olması ve basıncın yaklaşık bir hektar Pascal olması gerekir. Numuneleri gece boyunca dondurarak kurutun.

Dondurarak kurutma döngüsünü bitirdikten sonra, suyun havadan yeniden emilmesini önlemek için tüpleri mümkün olan en kısa sürede kapatın. Her numune tüpüne dört adet iki mililitrelik cam boncuk ekleyin. Numuneleri cam küreciklerle 15 saniye homojenize edin.

Uygun şekilde homojenize edilmiş numune, güvenli kilitli tüplerin tüm iç yüzeyine yayılır. Hücreler homojenizasyondan sonra, fikobililiproteinleri çıkarmak için numunelere bir mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. PBS'nin optimal pH'ı 7.4 civarındadır.

Hücreleri homojenizatörde beş saniye boyunca PBS ile karıştırın. Bu, verimli ficobiliprotein ekstraksiyonu için optimum numune karışımını güvence altına alacaktır. Karıştırdıktan sonra numuneler yeşilimsidir.

En verimli phycobiliprotein ekstraksiyonu için numuneleri 60 dakika buz üzerinde tutun. Ekstraksiyondan sonra, numuneleri beş dakika boyunca 15.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatan camgöbeği mavisi rengine sahiptir.

Spektrofotometrik ölçümden önce, PBS'yi boş olarak kullanarak spektrofotometreyi kalibre edin. Spektrofotometre kalibre edildikten sonra, bir spektrofotometre küvetinden PBS atılır ve süpernatanı, atılan tampon yerine ekstrakte edilmiş fikobilproteinlerle pipetleyin. Fikosiyanin ve allofikosiyanin miktar tayini için, ekstrakte edilmiş fikobiliproteinlere sahip süpernatant 615, 652 ve 720 nanometrelerde ölçülür.

Metinde anlatıldığı gibi, literatürde bilinen fikobilizomların nicelemesi için birkaç denklem vardır. Bu protokolde kullanılan denklem, pigmentler ve noktalar olarak fikosiyanin ve allofikosiyanin konsantrasyonlarını en iyi ilişkilendiren denklem olarak bulundu. Protokolün kritik adımları, hem yüksek verim hem de yüksek özgüllük sağlaması gereken hücrelerin homojenizasyonu ve ekstraksiyonudur.

Sonikasyon ile hücrelerin bozulması, zirkonya boncuklarla homojenizasyon veya hücre bağlantısını dondurma gibi çeşitli ekstraksiyon prosedürlerini test ettik. Bu protokolden elde edilen yöntem, en yüksek fikobilizom verimini sağladı. Protein ekstraktının klorofil ile küçük bir kontaminasyonu bile fikobiliproteinlerin içeriğinin fazla tahmin edilmesine yol açabileceğinden, hücrelerden herhangi bir klorofil ekstraksiyonundan kaçınmak gerekir.

Ham ekstraktta klorofil tespit ettik, daha sonra hücrelerin bozulması için sonikasyon kullandık. Tekrarlanan sonikasyon döngüleri ile klorofil konsantrasyonu arttı. Homojenizasyon süresi 15 saniye olarak optimize edildi.

Hem beş saniye hem de 20 saniye boyunca homojenizasyon, biraz daha düşük verim sağladı. PBS tamponuna veya suya sodyum veya potasyum klorür ilavesi, sodyum asetat tamponundaki ekstraksiyon ile aynı şekilde fikobiliproteinlerin ekstraksiyon verimliliğini artırmadı. Fikobiliproteinlerin ekstraksiyon süresi 60 dakika boyunca optimize edildi, çünkü 120 ve hatta 240 dakika sonra fikobiliprotein konsantrasyonu önemli ölçüde değişmedi.

615, 652 ve 720 nanometredeki absorbansın spektrofotometrenin yakın absorbans aralığına uyduğundan emin olun. Bu protokolde kullanılan spektrofotometre, 0.1 ile üç arasında yakın absorbans aralığını gösterir. Literatürden bilinen çeşitli spektrofotometrik fikobiliprotein miktar tayini denklemlerini karşılaştırdık.

Bennett ve Bogorad denklemi, bilinen protein konsantrasyonları ile pigment standartlarında hem fikosiyanin hem de allofikosiyanin içeriğinin en iyi rekonstrüksiyonunu sağlamıştır. Bireysel denklemler arasındaki farklar, spesifik organizmanın fikobiliproteinlerin yok olma katsayılarındaki varyasyonlarla bağlantılıdır. Streptomisin sülfat kullanımı, sonikasyonun uygulandığı veya kaçınıldığı örneklerde klorofil A'nın azalmasına yol açmadı.

Temsili veri olarak, Synechocystis hücrelerinde fikobiliproteinlerin içeriğini belirledik. Phycobiliprotein içeriği artan ışık altında azaldı. Protokol, herhangi bir standart canlı bilim laboratuvarında gerçekleştirilebilecek yazılı pigment analizi için zaman ve ekipman gereksinimlerini en aza indirmek için oluşturulmuştur.

Ayrıca, protokol, hücre peletinin dondurularak kurutulması ve proteinlerin ekstraksiyonu gibi iki adım daha içerir. Fikobilizomların miktar tayini için toplam çalışma süresi iki saatten fazla değildir.