Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Bu yöntem, dinamik protein sentezi ve sürece dahil olan proteom hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, translasyon için seçilen mRNA'ların, sürece katılabilen ve translasyona müdahale edebilen mikroRNA'ların ve protein translasyonuna katkıda bulunan veya kendileri çevrilmekte olan proteinlerin tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, strese verilen kardiyak tepkiler hakkında fikir verebilir, ancak diğer organlardaki strese karşı akut tepkilerin incelenmesine de uygulanabilir.

Prosedürü göstermek, Jennifer Van Eyk'in laboratuvarından bir proje bilimcisi olan Miroslava Stastna olacak. Deney günü, bir gradyan karıştırıcının sol bölmesini beş mililitre %15 sükroz gradyan çözeltisi ile doldurun ve sağ bölmeyi beş mililitre %50 sükroz gradyan solüsyonu ile doldurun. İki küçük bölmeyi manyetik bir karıştırıcı ile karıştırmak için musluğu açın ve pompayı açın ve karışık sükroz çözeltilerinin buz üzerinde ince duvarlı tek bir ultrasantrifüj tüpüne akmasına izin vermek için ikinci musluğa bağlı bir tüp kullanın.

Daha sonra, taze veya donmuş kalp dokusunu bir POLYTRON ile filtrelenmiş lizis tamponunda buz üzerinde 15 saniye homojenize edin. Kuluçka süresinin sonunda, çözünmeyen materyali çıkarmak için lizatı santrifüjleyin ve süpernatanı hasat edin. Protein tayini, RNA izolasyonu ve RNA bütünlük analizi için 50 mikrolitre süpernatanı bir kenara koyun ve kalan süpernatanı gradyan çözeltisi üzerine 100 ila 500 mikrolitre katmanlayın.

İki gradyan tüp arasındaki hacimleri dengelemek için yeni lizis tamponu kullanın ve numuneleri sallanan bir kova rotorlu bir ultrasantrifüjde ultrasantrifüjleyin. Santrifüjlemeden önce veya sonra sükroz gradyanını bozmamaya çok dikkat edin. Degradeleri toplamak için, fraksiyon toplayıcıyı, toplamanın ilk üç dakikasını atacak ve ağır, hafif ve translasyon yapmayan fraksiyonları, 254 nanometrede absorbansın sürekli izlenmesi ile dört ila 19 dakika arasında 17 fraksiyonda dakikada bir mililitre hızında toplayacak şekilde programlayın.

Her bir fraksiyonu toplanır toplanmaz buzun üzerine yerleştirin. Ardından, hemen işlenmeyeceklerse numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Polizom fraksiyonlarından proteinleri çıkarmak için, toplanan sakaroz fraksiyonlarını üç son fraksiyonda birleştirin ve fraksiyonları ağır, hafif ve translasyon yapmayan olarak işaretleyin.

Her numunenin 0,5 mililitresini 60 mikrolitre %100 trikloroasetik asit veya TCA ile karıştırın. Fraksiyonları gece boyunca karanlıkta eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, proteinleri santrifüjleme ile peletlemeden önce numuneleri buz üzerinde çözdürün.

Süpernatanları atın ve peletleri santrifüjleme başına 0,5 mililitre eksi 20 santigrat derece soğutulmuş aseton ile iki kez yıkayın. TCA çökeltmesinden sonra peletin, gerektiği gibi tam çözünürlüğü sağlamak için darbe sonikasyonu kullanarak tamamen çözüldüğünden emin olun. 360 mikrolitre Tris-HCl tamponunda yeniden süspansiyondan önce son yıkamadan sonra peletleri havayla kurutun.

Daha sonra, çalkalama ile 55 santigrat derecede 45 dakikalık bir inkübasyon için 40 mikrolitre ditiyotreitol ekleyin. İnkübasyonun sonunda, çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için numunelere 50 mikrolitre iyodoasetamid ekleyin, ışıktan korunun, ardından numunelerin bir ila 50 ağırlık-ağırlık tripsin-protein oranı ile sindirilmesi 37 santigrat derecede bir gece boyunca çalkalama inkübasyonu için. Ertesi sabah, soğuduktan sonra, numuneleri kısaca santrifüjleyin ve tripsin aktivitesini söndürmek için pH'ı %10 formik asit ile iki ila üçe ayarlayın.

Numuneleri tuzdan arındırmak için, önce sorbenti 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında 200 mikrolitre metanol ile üç kez şartlandırın, ardından oyuk başına üç kez 200 mikrolitre %0.1 formik asit ile şartlandırın. Daha sonra, numuneleri her bir oyuğa yükleyin ve numuneleri yıkama başına 200 mikrolitre% 0.1 formik asit ile üç kez yıkayın. Yerçekimi ve ardından düşük vakum kullanarak, numuneleri% 50 asetonitril içinde 100 mikrolitre% 0.1 formik asit ile numune başına iki kez düşük protein tutma 0.5 mililitrelik bir tüpe boşaltın.

Daha sonra, numune elüatlarını kuruyana kadar buharlaştırmak için bir yoğunlaştırıcı kullanın ve kütle spektrometresi analizi için her bir triptik peptit peletini 50 ila 100 mikrolitre %0.1 formik asit içinde sulandırın. mRNA analizi, her bir fraksiyondaki ilgilenilen belirli bir mRNA'nın dağılımını değerlendirmek veya birleşik poliribozomal translasyon fraksiyonlarının, her fraksiyondaki mRNA bolluğunun bir oranı olarak translasyon yapmayan fraksiyonla miktar tayini ve karşılaştırılması için yapılabilir. Örneğin, burada, sahte kalp tedavisine kıyasla, fare kalbinin iskemi veya iskemi reperfüzyonuna maruz kalmasından sonra, translasyon yapan ve translasyon yapmayan fraksiyonlar boyunca mRNA dağılımındaki değişiklikler gösterilmektedir.

Bu temsili deneyde, havuzlanmış ağır fraksiyonlardaki bir mikroRNA alt kümesinin analizi, 22 mikroRNA'nın iskemi sırasında polizomlarla ilişkili olduğunu, dokuzunun iskemi ve reperfüzyon sırasında ilişkili olduğunu ve yedisinin her iki durum için de ortak olduğunu ortaya koydu ve mikroRNA'ların ilişkisinin iskemi ve reperfüzyon streslerine yanıt olarak dinamik olduğunu gösterdi. Ayrıca, mitokondriyal ribozomal proteinlerin çoğunluğu hafif fraksiyonda tanımlandı ve sitozolik ribozomal proteinlerin çoğunluğu hem ağır hem de hafif fraksiyonlarda yaygın olarak tanımlandı. Bu prosedürü denerken, sükroz gradyanına çok dikkat etmeyi unutmamak önemlidir.

Polizom fraksiyonlarından proteinlerin ekstraksiyonu için TCA çökeltisi, hem fraksiyonu yüksek konsantrasyonda sakaroz ile işleme kabiliyetine hem de kütle spektrometresi ile tanımlanan protein sayısına dayalı olarak iş akışımızda seçilmiştir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, sükroz gradyanının tekrarlanabilirliği ile ilgili zorluklar nedeniyle mücadele edebilir. TCA çökeltmesi avantajlıdır, çünkü proteinleri çökeltmek için sadece küçük hacimlere ihtiyaç duyulur, pelet tüp dibinde görülebilir ve çökeltme sırasında sükroz birikimi olmaz.