Name: Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin köpek nötrofillerinden NET oluşumunu floresans mikroskobu ile canlı görüntüleme ve citH3 ekspresyonunu nicel analiz yöntemlerini. Bu teknikler immünoloji araştırmalarında patojen savunma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarın Morris hayvan Vakfı (D15CA-907) tarafından finanse edildi. Çalışma fon University of California, Davis, Equine Sağlık Merkezi ve refakatçi hayvan sağlığı merkezi tarafından desteklenmiştir (2016-24-F). Yazarlar Geena Ng onun hakkında yardım almak için rakamlar ve Nghi Nguyen video ile yardımını kabul etmek istiyorum.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaliforniya Üniversitesi Davis tarafından kabul edildi (protokol numarası: 18338).
1. kan toplama
<ol><li>10 mL kan ya 21 G iğne şırınga aspirasyon tarafından kullanarak sefalik veya şah damarı çizin.</li>
	<li>Aşırı kesme stres önlemek için kan sodyum heparin (75 USP) içeren tüpler aktarmadan önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Tüpler birkaç kez yavaşça tersine çevirin yeterli antikoagülan ve kan karıştırma sağlamak için. Pıhtı veya kırmızı hücre toplamları kanıtı için buza örnekleri yerleştirmeden önce kontrol edin.</li>
</ol>2. nötrofil yalıtım
<ol><li>Anticoagulated kan ile buz gibi Dubecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (pH 7.4, divalent katyonlar olmadan) eşit bir güç oranında seyreltin. Seyreltilmiş kan 8 mL 25 mL % 3 dextran (üzerinden % 0,9 sodyum klorür çözümde çözünmüş Leuconostoc spp.) içeren bir 50 mL polipropilen konik tüp içine aktarın. Tüp dik toplama ve eritrositler sedimantasyon izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin.</li>
	<li>Dikkatle lökosit açısından zengin plazma (Şekil 1) 5 mL 5 mL de bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt tüp yoğunluğu degrade medyada üzerine katman. 2 çözümleri11karıştırmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>400 x g hızlanma/yavaşlama (A/D) ayarlamak için 0 (fren yok), oda sıcaklığında 30 dakika ile de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>5 mL kullanarak serolojik damlalıklı plazma ve periferik kan mononükleer hücre (PBMC) katmanları (Şekil 1) atlayarak granülosit hücre katmanı toplamak. Yeni damlalıklı kirlenme en aza indirmek için her zaman kullanın.</li>
	<li>4-6 mL 50 mL polipropilen konik tüp içinde polymorphnuclear (PMN) hücre tabakasının bir yer. Eritrosit toplamları az miktarda PMN katmanla birlikte Aspire beri 1 mL serolojik damlalıklı yavaşça tüp alt kısmında yerleşmiş eritrosit toplamları kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>20 mL soğuk Ultrasaf Su ile kalan eritrositler parçalayıcı. 30-60 için birden çok kez tüpü yavaşça tersine çevirin s yeterli eşit bir buz gibi %1.8 sodyum klorür çözeltisi hacmi eklemeden önce lysing emin olmak için.</li>
	<li>112 x g 4 ° C'de 10 dakika, A/D 0 olarak ayarlanırsa, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bu Pelet kırmızı görüntülenirse eritrosit lizis adımı tekrarlayın. Süpernatant dikkatle ile serolojik damlalıklı atın ve yavaşça Pelet DPBS (5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2 ve %1 sığır serum albümin, pH 7.3) 100 µL içinde resuspend. Tüm resuspended hücreleri birleştirmek ve buza koyun.</li>
	<li>Bir otomatik hücre Çözümleyicisi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek ve bir hemasitometre tarafından Kont doğrulayın. Gerekirse, bir cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) kullanarak bir cam slayt PMNs konsantre ve nötrofil hücrelerinin toplam sayısı dışında sayısını sayarak nötrofil yüzdesini belirlemek.</li>
	<li>Strober ve ark. tarafından belirtildiği gibi bir trypan mavi dışlama test gerçekleştirerek nötrofil canlılığı belirlemek 12 başarılı yalıtım bir canlılık % 100 95 verim ve nötrofil % 95'den büyük olmalıdır.</li>
	<li>Nötrofil konsantrasyonu yüzde canlılığı ve yüzde nötrofil ile toplam hücre sayısı çarpılarak belirler. Başarılı yalıtım bir konsantrasyon nötrofil 6 x 106/mL için 1.5 ile verim.</li>
	<li>1 x 106/mL son bir konsantrasyon için nötrofil 7,3 için ayarlanır pH 5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2ve %1 sığır serum albümin içeren DPBS ile oranında seyreltin.</li>
</ol>3. Floresan Mikroskobu canlı nötrofil
<ol><li>Yer 200'e 400 μL nötrofil (1 x 106/mL) bir poli-L-lizin her kuyuya 12-şey kültür plaka kaplı. Nötrofil kuyu dibine 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin verir.</li>
	<li>Nükleik asitler iki nükleik asit boyalar biri, bir o sağlam Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri ve bir oda sıcaklığında 10 dakika için (bkz. Tablo reçetesi) geçirgen Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri 1 mikron ile etiketleyin.</li>
	<li>Nötrofil 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. ile etkinleştirmek B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olumlu denetim veya DPBS olarak 37 ° C'de 180 dk için negatif kontrol eşdeğer hacmi olarak</li>
	<li>GFP kullanarak görüntüleri (uyarma: 470/22 nm, emisyon: 525/50 nm) ve Texas kırmızı kanalları (uyarma: 585/29 nm, emisyon: 628/32 nm) aşağıdaki zaman noktalarda 40 X büyütme, floresans mikroskobu Tarih: 30, 90, 120 ve 180 dk.</li>
</ol>4. NET miktar ve NET bileşenler ayirt kullanarak tespiti
<ol><li>Dikkatle 18 mm çap Poly-D-lizin kaplı kapak paket fişi 12-şey kültür plaka kuyu yerleştirin. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin.</li>
	<li>Tohum 100-200 μL, nötrofil (1 x 106/mL) doğrudan coverslips izole ve nötrofil kapak irsaliyeleri için 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin.</li>
	<li>Nötrofil 3.3 içinde açıklandığı gibi etkinleştirin. NET oluşumu ile 200 µΜ nötrofil pretreating tarafından inhibe Cl-amidine (15 dk, 37 ° C) daha önce Li vd tarafından açıklandığı gibi harekete geçirmek önce 13 uygun araç kontrol (DMSO) denemeye dahil emin olun.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde kapak paket fişi ile iyi forseps çıkarın. Parafin film sayfası sığ kuyular oluşturmak ve 2-3 damla % 4'lük yerleştirmek için bir test tüpü sandalyesinden katman her iyi10PFA. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin ve yavaşça kapak paket fişi ters İngiltere'de yılın dolu kuyu yatıyordu. Hücreleri 20 dk için oda sıcaklığında düzeltilmesi için izin.</li>
	<li>Hücreleri DPBS 5 dk, 3 kez bir kuyudan diğerine taşıyarak yıkayın.</li>
	<li>İmmunolabelling kısa bir süre sonra nötrofil harekete geçirmek ve fiksasyon gerçekleştirilemez, kapak absorbans kağıda kapak paket fişi yüz-up yerleştirerek kuru hava olmaya makbuzları olanak verir. Kapak paket fişi en fazla 1 hafta yüz-up 4 ° C'de bir etiketli 12-şey kültür plaka için daha fazla çözümleme kadar saklanabilir. Hücreleri 3 kez DPBS için 1dk 4.4 sonraki adıma devam etmeden önce açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri permeabilize için yavaşça kapak notu baş aşağı bir damla %1 4.4 içinde NP-40 için 1dk tekniği kullanarak açıklanan yatıyordu. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 1 dakika yıkayın.</li>
	<li>Rastgele her örnek için bir numara atamak ve bir elmas noktası işaretçisi coverslips buna göre etiketlemek için kullanın.</li>
	<li>Hazırlamak ve etiket bireysel Petri yemekler parafin film ile kaplı ve 100-200 μL %5 keçi serum (arabellek kütük parçası) film üzerine yerleştirin. Coverslips baş aşağı engelleme arabellek üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikor seyreltik (1: 400 tavşan poliklonal anti-citrullinated histon H3 (citH3) % 5 keçi serumda). Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Seyreltik ikincil antikor %5 keçi serumda fluorophore (1: 200) için Birleşik. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Myeloperoxidase (MPO) eşzamanlı tespiti için Li vd tarafından açıklandığı gibi değiştirilmiş Çift Kişilik immunolabeling iletişim kuralı için aşağıdaki adımları izleyin 13
</li>
	<li>Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı (bir gecede, 4 ° C, karanlıkta) hafif sallanan altında serum % 10 tavşan 100-200 μL üzerinde yatıyordu.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Karanlıkta bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 h için anti-tavşan Fab parçaları 50 μg/mL çekimsiz keçi hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikor (1: 200 tavşan poliklonal anti-insan MPO antikor) % 5 keçi serumda sulandırmak. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor %5 keçi serumda fluorophore için Birleşik sulandırmak ve 4,8 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Parazit kontrolleri ile her iki birincil antikorlar bağışıklık etiketleme ikinci adımda kuluçka hariç tutarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>DNA ile 300 leke nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>3 kez karanlık bir rocker üzerinde 1 dk DPBS içinde yıkayın.</li>
	<li>Antifade mountant bir cam slayt üzerine bir damla (~ 50 μl) uygulanır. Yavaşça ters coverslip hücreleri ile montaj önce aşırı arabellek kaldırmak için bir emici kağıt üzerine coverslip kenarına dokunun. Montaj orta coverslip ve cam slayt arasındaki ince bir tabaka oluşturmalıdır. Hava kabarcıkları kaldırmak için çok yavaşça coverslip üzerinde iyi forseps ile tuşuna basın.</li>
	<li>Örnekleri 4 ° C'de karanlık gecede tedavi etmek izin Montaj orta daldırma lensler ile mikroskopik analiz için sertleşmesine. Örnekleri karanlıkta 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>5. nötrofil hücre dışı tuzak miktar
<ol><li>Edinme ve deneysel koşullar mikroskop resimlere analiz operator(s) kör.</li>
	<li>Bir floresan mikroskop 40 X büyütme oranında kullanarak, 10 resim Rastgele her coverslip bir deneyde ilgili kanalları altında farklı bölgelerinden al. Çekim hızı, parlaklık ve kontrast her kanal görüntüleri edinimi tutarlı tutulmasını sağlamak.</li>
	<li>Mevcut yazılım gibi ImageJ (NIH) kullanarak görüntüleri analiz. CfDNA, citH3 ve MPO (Şekil 3A, B) Co yerelleştirilmesini tabanlı ağlar tanımlamak. Ağlar ve deneysel her koşul için 10 rasgele alan nötrofil sayısı ölçmek. Yayımlanan ağlar numaraları bir oranı olarak ifade (ağlar sayısı: nötrofil sayısı) deneysel her koşul için.</li>
	<li>Hücre içi citH3 ifade tedavi etkisini değerlendirmek için nötrofil ile hücre içi citH3 ve nötrofil hücre içi citH3 ilgili kanalları ( altında 40 X büyütme, 10 rasgele alan olmadan sayısını saymak Şekil 3, kırmızı oklar). Hücre içi citH3 ifade ile hücre içi citH3 nötrofil hücre içi citH3 olmadan sayıda nötrofil sayısı oranı olarak ifade edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
<li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti için antikorlar gerektirmez, NETosis türler...

Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)1nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)2süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm3,4' e, neden olabilir gösteriyor 5 , 6.
NETs köpeklerde benzer bir patofizyolojik rol oynayabilir çünkü önlemek veya azaltmak NET oluşumu tedavi müdahaleler roman tedavi stratejileri septik hayvanlarda olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, güvenilir bir teknik NETosis ve köpeklerde NET bileşenler ölçmek ve değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. NET bileşenleri boş hücre DNA (cfDNA) ve oluşturarlar dahil olmak üzere daha önce köpek nötrofil ve plazma klinik köpekler7,8,9değerlendirilir. Floresans deneyleri kullanarak, Goggs ve Letendre septik köpeklerin cfDNA yüksek düzeyde sağlıklı köpekler8' den vardır bulundu. Bu teknikler son derece objektif ve nicel olmakla birlikte, onlar NETosing nötrofil dışında nekrotik hücrelerden elde edilebilir bu yana oluşturarlar ve cfDNA NETosis işaretleri olarak non-spesifik ölçümdür. Burada floresans mikroskobu canlı NETosing nötrofil davranışları incelemek için kullanan bir tekniğini tanımlamak. Biz de subjektif ağlar ve bileşenlerinin MPO ve citH3 köpek nötrofil10gibi ölçmek için çift-immunolabeling kullanan bir değiştirilmiş Protokolü ayrıntı.

<table><tbody><tr><td>Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Molekül ağırlığı 450.000 &ndash; 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>İki değerlikli katyonlarla</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>İki değerlikli katyonlar olmadan</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Turuncu Floresan Nükleik Asit Lekesi</td><td>DMSO'da ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM; geçirgen zarlı hücrelerde lekeler</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Floresan Nükleik Asit Lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>DMSO'da 1 mM; Sağlam zarlı hücrelerde lekeler</td></tr><tr><td>Yüzey Ampları NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin kaplı lameller</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm çap</td></tr><tr><td>Anti-sitrüline histon H3 antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Konjuge olmayan keçi anti-tavşan Fab parçaları</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Özgüllük: IgG (H +L)</td></tr> <tr><td>Anti-Miyeloperoksidaz antikoru</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilin (DAPI)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

vitro köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA'ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.

Canlı hücre görüntüleme bu iletişim kuralını kullanan, müfettişler nükleer morfoloji, plazma membran bütünlüğü ve yaşam nötrofil cfDNA varlığı gözlemleyebilirsiniz. Bir hücre impermeant nükleer boya çekirdek asitleri kırmızı hücrelerin hasarlı hücre zarı ile lekeleri. Başka bir hücre permeant boya, bozulmamış plazma membran ile canlı hücrelerde hücre içi nükleik asitler Etiketler. Kendi tedavileri ne olursa olsun tüm bozulmamış nötrofil yeşil görünür ve karakteristik loblu çekirdeklerin 0...

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Bu yöntem, köpeklerde veya diğer türlerde nötrofil hücre dışı tuzak veya NET oluşumu ile ilgili temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniklerin ana avantajları, NET oluşumunun gerçek canlı tespitini ve hafif peroksidaz ve sitrüline histon H3 gibi NET bileşenlerinin tanımlanmasını içerir. Sağlıklı bir köpek donörünün şah damarından 10 ila 20 mililitre kan alarak başlayın, aşırı paylaşımı önlemek için kanı sodyum heparin tüplerine vermeden önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Kan ve antikoagülanın yeterli şekilde karışmasını sağlamak için tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin ve numuneleri buza yerleştirmeden önce pıhtı ve kırmızı hücre agregatlarını kontrol edin.Antikoagüle edilmiş kanı eşit hacimde buz gibi soğuk Dulbecco'nun PBS'si ile seyreltin ve sekiz mililitre seyreltilmiş kanı, 25 mililitre filtrelenmiş% 3 Dekstran içeren 50 mililitrelik polipropilen konik bir tüpe aktarın. Eritrositlerin toplanmasına ve çökelmesine izin vermek için tüpü oda sıcaklığında 30 dakika dik olarak yerleştirin. Daha sonra, 14 mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpte beş mililitre yoğunluk gradyan ortamının üzerine beş mililitre lökosit bakımından zengin plazmayı dikkatlice katman.Yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra, ara granülosit hücre tabakasını 50 mililitrelik konik içine aktarmak için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın ve polimorfonükleer hücrelerle birlikte aspire edilen herhangi bir eritrositi 20 mililitre soğuk, ultra saf su ile parçalayın. Hücreleri eşit hacimde buz gibi% 1.8 sodyum klorür çözeltisinde yıkamadan önce yeterli parçalanmayı sağlamak için tüpü 30 ila 60 saniye boyunca nazikçe ters çevirin. Tüpü birkaç kez ters çevirdikten sonra, dört santigrat derecede santrifüjleyin.Süpernatanı dikkatlice çıkarmak için serolojik bir pipet kullanın ve peleti 100 mikrolitre hücre kültürü tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlaması ile yaşayabilirliklerini sayın ve onaylayın. Daha sonra nötrofilleri, mililitre hücre kültürü tampon konsantrasyonu başına bir kez on ila altı hücreye seyreltin.Kontaminasyon ve kesme kuvvetleri in vitro nekroz ve hücre lizizine yol açabileceğinden, uygun bir steril teknik kullanmak ve nötrofillerin izolasyon işlemi boyunca dikkatli bir şekilde kullanılması önemlidir. Nötrofilleri floresan mikroskobu ile görüntülemek için, 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için poli-L-lizin kaplı 12 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 200 ila 400 mikrolitre hücre ekleyin. Nötrofiller kuyucukların dibine yapıştığında, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca uygun bir floresan nükleik asit boyası ile etiketleyin.İnkübasyonun sonunda, nötrofilleri mililitre LPS başına 100 mikrogram, pozitif kontrol olarak 100 nanomolar PMA veya 37 santigrat derecede negatif kontrol olarak eşdeğer bir hücre kültürü tamponu hacmi ile aktive edin. Daha sonra nötrofil kültürlerini belirtilen zaman noktalarında 40 kat büyütmede floresan mikroskobu ile görüntüleyin. NET miktar tayini için, 18 milimetre çapında poli-D-lizin kaplı lamelleri 12 oyuklu bir kültür plakasının ayrı oyuklarına dikkatlice yerleştirin ve kuyucukları deneysel uyarana göre etiketleyin.Daha sonra, 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için 100 ila 200 mikrolitre izole nötrofilleri doğrudan lamellerin üzerine tohumlayın. Nötrofiller lamellere yapıştığında, her bir kuyucuktaki nötrofilleri az önce gösterildiği gibi 180 dakika boyunca LPS, PMA veya DPBS ile aktive edin. İnkübasyonun son 30 dakikasında, sığ kuyucuklar oluşturmak için bir test tüpü standının üzerine bir parafin film tabakası yerleştirin ve her oyuğa iki ila üç damla% 4 paraformaldehit ekleyin.Kuyucukları deneysel olarak uygun şekilde etiketleyin ve lamelleri her bir plakadan baş aşağı uygun karşılık gelen PFA dolu kuyuya nazikçe aktarmak için ince forseps kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakika sonra, hücreleri bir DPBS kuyusundan diğerine hareket ettirerek, sabit hücreleri yıkama başına iki ila üç damla tamponlu tuzlu su ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Hücrelere nüfuz etmek için, lamelleri bir dakika boyunca% 1NP-40'lık bir damla üzerine nazikçe baş aşağı yatırın ve ardından bir külbütör üzerinde üç adet bir dakikalık tamponlu tuzlu su yıkama yapın.Son yıkamadan sonra, lamelleri 100 ila 200 mikrolitre% 5 keçi serumu içinde, sallanarak 37 santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için taze plastik parafin film ile kaplanmış ayrı ayrı etiketlenmiş petri kaplarına baş aşağı yerleştirin. Bloke etme inkübasyonunun sonunda, lamelleri tamponlu tuzlu su içinde üç kez gösterildiği gibi sallanarak yıkayın. Lamelleri, sallanarak 37 santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için 50 ila 100 mikrolitre uygun antikor içinde ayrı ayrı plastik, parafin film kaplı petri kaplarına aktarın.Yıkadıktan sonra, lamelleri uygun florofor konjuge ikincil antikor ile ışıktan korunarak 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İkincil antikor inkübasyonunun sonunda, lamelleri karanlıkta tamponlu tuzlu su içinde üç kez sallanarak yıkayın ve ardından oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika boyunca DAPI ile nükleik asit boya boyama işlemi yapın. Karanlıkta sallanarak üç adet bir dakikalık tamponlu tuzlu su yıkamasından sonra, numune başına bir cam slayt üzerine 50 mikrolitrelik bir damla antifade montaj ortamı uygulayın ve her kurutulmuş lamel bir damla montaj ortamının üzerine baş aşağı dikkatlice monte edin.Ardından, numunelerin ışıktan korunarak gece boyunca dört santigrat derecede kürlenmesine izin verin. Ertesi sabah, her lamel farklı bölgelerinden 40 kat büyütme ile rastgele 10 görüntü elde edin. Tedaviden bağımsız olarak tüm sağlam nötrofiller yeşil görünmeli ve stimülasyondan sıfır ila 30 dakika sonra karakteristik lobülasyonlu çekirdekleri sergilemelidir.Yaklaşık 90 dakikada, PMA ile tedavi edilen nötrofillerin çekirdekleri, lobülasyonlu görünümlerini kaybetmeye başlar ve hücresiz DNA salınana kadar yoğunlaşmaya devam eder. Köpek nötrofillerinin daha yavaş ve daha fizyolojik bir uyarıcısı olan LPS, tipik olarak stimülasyondan 90 dakika sonrasına kadar kromatin dekondensasyonu veya NETosis ile sonuçlanmaz. 120 dakikaya kadar, LPS ve PMA ile aktive olan nötrofiller, hücresiz DNA ile çevrili olarak görülebilir.LPS ile uyarılan hücrelerle karşılaştırıldığında, daha fazla PMA ile aktive olan nötrofil, hücre geçirimsiz boya ile boyanmalarıyla kanıtlandığı gibi plazma zarı bütünlüklerini kaybeder. Uyarılmamış nötrofiller, kuluçka süresi boyunca lobüle çekirdeklerini ve sağlam plazma zarlarını korumalıdır. LPS tarafından 180 dakika boyunca uyarılan nötrofiller, yakındaki nötrofillere yakın yerlerde gizli ağ benzeri NET iskeleleri üretir.Buna karşılık, PMA ile aktive olan nötrofiller, alanda gözle görülür şekilde daha büyük olan çok miktarda NET üretir. Gerçekten de, temel NET bileşeni hücre içi sitrüline histon H3'ü katalize eden bir enzimin güçlü bir uyarıcısı olan PMA, uyarılmamış ve LPS ile uyarılmış nötrofillere kıyasla daha fazla sayıda hücre içi sitrüline histon H3 eksprese eden hücreyi indükler. Bu tahlili gerçekleştirirken, operatörün deney koşullarına kör olacak mikroskop görüntülerini elde etmesi ve analiz etmesi, tahlilin objektif değerlendirmesini sürdürmek için son derece önemlidir.Bu prosedürlerin yarısı, hücrelerde sitrüline histon H3'ü daha fazla ölçmek için ELISA veya akış sitometrisi gibi tahlillerine sahiptir. Uyarılmamış nötrofillerden veya peptidil arginin inhibitörü chrolide amidin ile tedavi edilmiş nötrofillerden oluşan negatif kontrolleri dahil etmeyi unutmayın. Ayrıca, spesifik olmayan bağlanma ve girişimleri en aza indirmek için birincil ve ikincil antikorların farklı dilüsyonlarının test edilmesini öneririz.

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Isıya bağlı antijen alma ve çift immün etiketleme protokolü kullanarak formaldehit sabit ve parafin gömülü kedi kardiyojenik arteriyel trombisinde nötrofil ekstrasellüler tuzaklarını (NET) tanımlamak için bir yöntem tanımladık.

İmmünofluoresans Mikroskobu kullanılarak Parafin Gömülü Kedi Arteriyel Trombisinde Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Belirlenmesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Öğrenin köpek nötrofillerinden NET oluşumunu floresans mikroskobu ile canlı görüntüleme ve citH3 ekspresyonunu nicel analiz yöntemlerini. Bu teknikler immünoloji araştırmalarında patojen savunma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Daha fazla video keşfet