Name: Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin, insan diş folikülü kök hücrelerinin mikRNA ile geçici genetik mühendisliğini. Bu yöntem, kalıcı genom entegrasyonu riski olmadan hücreleri güvenle modifiye eder ve rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889018) ve nemli Vakfı (2016-11) FORUN Program tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak,'da ve R.D. BMBF (VIP + 00240) tarafından desteklenmektedir.

HDFSCs çıkarılan yirmilik dişler bölümü Oral ve Maksillofasiyal Cerrahi plastik cerrahi Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından sağlanan diş köklerinin etkilenmezsiniz. Aydınlatılmış onam ve yazılı onayı elde edilen tüm hastalar. Bu çalışmada Rostock Üniversitesi (izni Hayır ' 2017-0158) Yerel Etik Komitesi tarafından yetkilendirilmiştir.
1. hDFSCs yalıtım
Not: Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yirmilik dişler çıkarma önce patlak değil
<ol><li>
Gerekli çözümleri hazırlanması
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hazırlamak / penisilin-streptomisin-glutamin (P-S-G) çözüm: PBS 495 mL 5 mL P-S-G çözeltisi ile karıştırın. Mağaza aliquots 4 ° C'de 50 ml</li>
		<li>HDFSC kültür ortamı hazırlamak: Bazal orta 445 mL 5 mL antibiyotik Ajan ve 50 mL fetal Sığır serum (FBS) ile karıştırın. 4 ° C'de mağaza</li>
		<li>Collagenase türü hazırlamak çözüm (30 mg/mL) stok: 300 mg Collagenase tip ı bazal orta 10 mL % 1 antibiyotik ajanı ile desteklenmiş oranında seyreltin. Çözüm kuvvetle karıştırın. Çözüm 0.2 µm filtre kullanarak filtre. Mağaza aliquots Collagenase 500 µL olan tip ı hisse senedi çözüm-20 ° C'de</li>
		<li>Dispase II stok çözüm (40 mg/mL) hazırlamak: Dispase II 40 mg 10 ml % 1 antibiyotik ajanı ile desteklenmiş bazal orta oranında seyreltin. Çözüm kuvvetle karıştırın. Çözüm 0.2 µm filtre kullanarak filtre. -20 ° C'de Dispase II stok çözeltinin 500 µL deposu aliquots</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cerrahi müdahale
	<ol>
<li>Yeterli miktarda enjekte (en fazla: 2 mL) Yerel anestezi.</li>
		<li>Oluşturmak ve bir üç cepheli mucoperiosteal kapak yükseltmek. Dilli bir kapak yükselterek gerekli değildir.</li>
		<li>Dilli yönü periosteal bir Asansör ile korumak.</li>
		<li>Yavaşça değirmen bukkal ve distal kemik ile bir yuvarlak sert metal burr.</li>
		<li>Periosteal bir Asansör ile folikül dokusu gevşetin. Dikkatli bir şekilde tam diş (mikrop) ve taç çekerek folikül (ve folikül) posterior (üçüncü molar) forseps ile çıkarın.</li>
		<li>Yarayı ve soket NaCl çözüm ile iyice sulama.</li>
		<li>Mucoperiosteal flep ( Tablo malzemelerigörmek) vicryl sütür ile değiştirin.</li>
		<li>Diş kökü ağız boşluğu kaldır ve çözüm PBS/P-S-G 50 mL bir aliquot koyun. Not: Örnek 4 ° C'de daha fazla işleme kadar saklanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diş folikülü enzimatik sindirim
	<ol>
<li>HDFSC kültür orta ve oda sıcaklığında (RT) PBS/P-S-G çözüm önceden ısıtmak.</li>
		<li>Çözülme her Collagenase türden bir aliquot ben ve Dispase II stok çözümleri. Hazırlamak bir sindirim çözüm olarak 3 mg/mL Collagenase türü ben ve 4 mg/mL Dispase II her Collagenase 500 µL tip ı ve Dispase II stok çözüm 4 ml bazal orta içeren % 1 antibiyotik Aracısı ekleyerek.</li>
		<li>Ayıklanan folikül içinde steril Petri kabına yerleştirin ve 10 mL çıkarılan doku yıkamak için PBS/P-S-G çözeltisi ekleyin. İki kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
		<li>Yaklaşık 1 mm x 1 mm içinde Petri kabına 10 mL PBS/P-S-G çözeltisi içeren steril neşter ile parçalara ayıklanan folikül kıyma.</li>
		<li>Kıyılmış transferi doku ve 50 mL konik santrifüj tüpü Petri kabına çözümden PBS/P-S-G. Petri kabına 10 mL PBS/P-S-G çözeltisi ile yıkayın ve çözüm aynı tüpün içine aktarın.</li>
		<li>Konik santrifüj tüpü için de RT 353 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>5 mL sindirim çözeltisi pelleted doku ekleyin. Çözüm ve doku karışımı yavaşça. Titreyen bir kuluçka 2 h 37 ° C ve % 5 CO2 karisimin kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj hücre/doku süspansiyon vasıl 353 x g 10 dakika dik atma süpernatant, sindirmek ve elde edilen Pelet 6 mL hDFSC kültür ortamının yeniden askıya alma.</li>
		<li>Tohum hücre süspansiyon 25 cm2 ' deki kültür şişesi hücre ve hücre 37 ° C, % 5 CO2 ve %20 O2kuluçkaya. Not: Doku tamamen sindirilmiş değil, kalan doku hücre kültür şişesi için de aktarın.</li>
		<li>Orta hücre tohum sonra 24 h dikkatli bir şekilde değiştirin. Daha sonra orta confluency kadar üç her gün değiştirin. Not: HDFSCs plastik-yapışık 24 h hücre tohum sonra olmalıdır ve yapışık olmayan hücreleri ve kan bileşenleri sadece orta değiştirerek ayrılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre hasat
	<ol>
<li>HDFSC kültür orta, PBS/P-S-G çözüm ve tripsin/Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm RT. için önceden ısıtmak</li>
		<li>Süpernatant kültür balonun üzerinden atmak ve konfluent hücreleri 5 mL PBS/P-S-G çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Kültür şişeye 1 mL tripsin/EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 3 min için kuluçkaya Kültür şişeye hDFSC kültür orta 3 mL ekleyerek sindirim işlemini durdurun.</li>
		<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarmak ve süspansiyon RT. atma süpernatant de 353 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi ve Pelet hDFSC kültür orta uygun bir miktar yeniden askıya alma.</li>
		<li>Hücreleri saymak: hücre süspansiyon 10 µL Trypan mavi çözüm 10 µL ile karışımı yavaşça. 10 µL sayım odasına uygulamak ve hDFSC hücre tutarını hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hDFSCs karakterizasyonu
<ol><li>
Immunophenotyping
	<ol>
<li>Akış sitometrik çözümlemesi için hücre hazırlık<ol>
<li>Gerekli çözümleri hazırlanması<ol>
<li>PBS/EDTA (2 mM) hazırlamak: PBS 996 mL EDTA (0,5 M) 4 mL ile karıştırın.</li>
				<li>Boyama arabellek hazırlamak: PBS/EDTA (2 mM) 995 mL 5 g BSA ile karıştırın. 0,22 µm filtre birimini kullanarak çözüm filtre ve kullanım kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
				<li>Paraformaldehyde (PFA) hisse senedi çözüm (% 4) hazırlamak: 4 g PFA PBS 100 ml seyreltik ve çözüm ile 80 ° c ısı Çözüm mix ve 7.3 pH değerine ayarlayın. Aliquot İngiltere'de yılın ilgili tutarları (1,5 mL) ve mağaza-20 ° C'de çözümde kullanımı kadar elde. Dikkat: PFA duman zehirli olduğundan, İngiltere'de yılın çözüm havalandırılmış duman başlıklı hazırlayın.</li>
			</ol>
</li>
			<li>(1.4) hasat hücre sonra 14 örnekleri 5 x 104 hücre 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın. Süspansiyonlar, 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreleri ve Kimyasalları buz Aksi belirtilmediği sürece tutun.</li>
			<li>Boyama arabellek (4 ° C) belirli miktarda hücrelerde yeniden askıya alma ve Tablo 1' de gösterildiği gibi reaktif (4 ° C) engelleme FcR ekleyin.</li>
			<li>İlgili örnek iç tarafında üzerine aşağıdaki antikorlar Tablo 1' de gösterildiği gibi ekleyin: Allophycocyanin (APC) fare anti-insan CD29; APC fare Igg1 κ izotip kontrol; Peridinin-klorofil protein (PerCP)-Cyanine5.5 fare anti-insan CD44; PerCP-Cyanine5.5 fare Igg2b κ izotip kontrol; V500 fare anti-insan CD45; V500 fare Igg1 κ izotip kontrol; Phycoerythrin (PE) fare anti-insan CD73; PE fare Igg1 κ izotip kontrol; PerCP-Cyanine5.5 fare anti-insan CD90; PerCP-Cyanine5.5 fare Igg1 κ izotip kontrol; Anti-insan CD105 fare: Alexa Fluor (AF) 488; fare Igg1 negatif kontrol: AF488; PE-Cyanine7 fare anti-insan CD117; PE-Cyanine7 fare Igg1, κ izotip kontrol. Antikorlar her örnek için eklendikten sonra antikorları Döndür ve karışımı yavaşça. 4 ° C'de 10 dakika için çözümler kuluçkaya</li>
			<li>PBS (4 ° C'de) 1 mL ekleyin ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
			<li>PBS (4 ° C) 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma ve İngiltere'de yılın (% 4) 33 µL ekleyin. Çözüm mix ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Akış sitometrik ölçüm hücre Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreler buz üzerinde ölçüm kadar tutmak.<ol>
<li>Ifade yüzey antijenleri incelemek tüpler akış sitometrik ölçümleri için uygun içine örnekleri aktarın.</li>
			<li>Akış Sitometresi kullanarak en az 2 x 104 olayları ölçmek. Şekil 2' de gösterildiği gibi analiz.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HDFSCs multipotent farklılaşma potansiyeli
	<ol>
<li>Adipojenik ve osteojenik ve hDFSCs chondrogenic farklılaşma potansiyeli onaylamak için bir ticari olarak mevcut insan mezenkimal kök hücre fonksiyonel kimlik seti kullanın. Eşek Anti-keçi AF488 ikincil antikor yağ asidi bağlayıcı protein 4 (FABP4) boyama için geçerlidir ve aggrecan yanı sıra eşek Anti-fare AF488 ikincil antikor osteokalsin boyama için. Çekirdekleri boyama için montaj orta 4' ile 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanın. Not: Örnekleri olmadan birincil antikor negatif denetimleri mikroskobik analizleri için hazırlamak.</li>
		<li>İfade proteinlerin confocal mikroskobu tarama lazerle inceliyorlar. Mikroskopi ayarları: 40 x amacı ile petrol daldırma; uyarma lazer 488 nm (için AF488) ve 405 nm (için DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hDFSCs transfection
<ol><li>(1.4) hasat hücre sonra 24-şey hücre kültür tabakta transfection önce 24 h hDFSCs tohum. Not: Hücre yoğunluğu yaklaşık Iyi başına 4 x 104 hücre ulaşıyor. Hücreleri ~ %80 izdiham transfection gününde ulaştırılması gerekmektedir. Not: bir diğer hücre örnek olarak denetim akış sitometrik çözümlemesi için tohum.</li>
	<li>Transfection konut projeleri hazırlanması Not: RNases gelen önlemek amacıyla RNase dekontaminasyon çözüm kullanarak transfection kompleksleri hazırlanması önce doğrudan çalışma alanı temiz. Yalnızca RNase ücretsiz malzeme ve çözümleri kullanın. Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin.<ol>
<li>MiR hisse senedi çözüm (50 µM) hazırlamak: nükleaz ücretsiz 100 µL suda Cy3 etiketli habercisi miR (5 nmol) yeniden askıya alma. Aliquot miR ilgili tutarları (5 µL) hisse senedi çözümde ve mağaza-20 ° C'de karanlıkta kullanım kadar elde.</li>
		<li>MiR (50 µM miR hisse senedi çözüm 0.8 µL) indirimli serum orta 66.7 µL 40 pmol oranında seyreltin. Çözüm karışımı yavaşça</li>
		<li>İndirimli serum orta 66.7 µL katyonik lipit tabanlı transfection reaktif 0.67 µL sulandırmak. Çözüm karışımı yavaşça ve RT., 5 min için kuluçkaya</li>
		<li>Kuluçka sonra önceden seyreltilmiş transfection reaktif için önceden seyreltilmiş miR ekleyin. Çözüm karışımı yavaşça ve RT., 15 dk için kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazır transfection kompleksleri dropwise doğrudan hücre kültür medyada ekleyin. 24-şey hücre kültür plaka ileri geri sallanan tarafından karışımı yavaşça.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C, % 5 CO2ve %20 O2 24 h için kuluçkaya.</li>
</ol>4. Transfection Analizi
Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin.
<ol><li>
Transfection sonra hasat hücre Not: Tüm hücre çözümleri aynı 15 mL konik santrifüj tüpü içinde bir örneği toplamak.<ol>
<li>24 h transfection sonra ilgili santrifüj tüpleri örneklerinde süpernatant toplamak.</li>
		<li>PBS 1 mL hücrelerle yıkayın, PBS ilgili santrifüj tüpüne aktarmak ve 500 µL eklemek tripsin/EDTA (RT) hücrelere. 37 ° C'de 3 dk için çözümler kuluçkaya</li>
		<li>Trypsinization 1 mL (RT) kültür ortamının ekleyerek hücreleri ve transfer çözüm ilgili santrifüj tüpü içine bırak. 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj hücreleri Not: Bu tarihten itibaren aksi belirtilmedikçe hücreleri ve Kimyasalları buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış sitometrik çözümlemesi için hücre hazırlık
	<ol>
<li>Süpernatant atmak. Boyama arabellek (4 ° C) ve transfer hücre çözümü için 1.5 mL microcentrifuge tüp 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
		<li>0.5 µL Amin reaktif boya örnekleri için canlı ve ölü hücreleri arasında ayırmak için ekleyin. Yavaşça çözüm mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
		<li>Hücreleri ve 300 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için PBS (4 ° C'de) 1 mL ekleyin Süpernatant atmak.</li>
		<li>PBS (4 ° C) 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma ve İngiltere'de yılın (% 4) 33 µL ekleyin. Çözüm mix ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış sitometrik ölçüm hücre Not: Aşağıdaki iş yerine gölgeli bir odada gerçekleştirin. Hücreler buz üzerinde ölçüm kadar tutmak.<ol>
<li>Örnekleri tüpler akış sitometrik ölçümleri için uygun içine aktarın.</li>
		<li>Hücre canlılığı ve miR alımını verimliliği bir akış sitometresi kullanarak inceleyin. En az 2 x 104 olaylar ölçmek. Şekil 4' te tasvir gating stratejiyi kullanın. Not: Untransfected hücreleri negatif kontrol Cy3 pozitif hücreler için geçişi düzenlemek ve transfection tarafından neden olduğu hücre ölümü hesaplamak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Erişkin kök hücrelerin şu anda birçok dejeneratif hastalıkların tedavisi için odak vardır. Özellikle, kemik iliği (BM)-hematopoetik kök hücre (HSCs) de dahil olmak üzere, kök hücre elde edilen ve MSCs, yoğun klinik soruşturma47altında. Ancak, BM hasat bağış yerinde ağrı neden invaziv bir işlemdir ve istenmeyen olaylar48olarak yol açabilir. Son zamanlarda, Doğum sonrası diş dokusu bir roman ve kök hücre için kolayca erişilebilir kaynak olarak ortaya çıkmıştır. Bu diş kök hüc...

İnsan diş kökü bir gevşek ectomesenchymally kaynaklı bag gelişmekte olan diş1,2çevreleyen doku var. Işlevini koordinat osteoclastogenesis ve osteogenesis diş Erüpsiyonu işleminin, özellikle periodontium3,4,5geliştirilmesi için kök ve progenitör hücrelerin bu doku liman. Bu nedenle, diş kökü insan yetişkin kök hücreleri6,7hasat için alternatif bir kaynak olarak kabul edilir.
Çeşitli çalışmalarda insan diş kökü kök hücreler (hDFSCs) dokusunu, bağ fibroblastlar ve cementoblasts8,9,10 da dahil olmak üzere periodontal lineage ayırt yetenekli olduğunu gösterdi . Ayrıca, bu hücreler kendini yenileyerek kapasitesi, plastik bağlılık, ifade belirli yüzey işaretleri de dahil olmak üzere tüm özellikleri mezenkimal stromal hücre (MSCs) Maç gösterilmiştir (örneğin, CD73, CD90, CD105) olarak osteojenik de, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma potansiyeli11,12,13. Diğer çalışmalar da hDFSCs2,14,15,16,17,18bir sinirsel farklılaşma potansiyeli ortaya koydu.
Umut verici özellikleri ve kolay erişim nedeniyle, hDFSCs doku mühendisliği19,20,21için son zamanlarda ilgili oldu. İlk çalışmalar DFSCs potansiyeli kemik, periodontal yeniden üzerinde yoğunlaştı ve19,22,23,24,25,26Diş kökleri, 27,28,29,30. HDFSCs nörojenik yeteneğini bilen beri onların uygulama nörodejeneratif hastalıklar için olası tedavi olarak incelenen31,32,33olmuştur. HDFSCs da ile mineral için önem kazandı diğer dokulara (Örneğin, kornea epitel)34,35rejenerasyon. HDFSC tedavi edici potansiyel sadece onların doğrudan farklılaşma potansiyeli aynı zamanda parakrin faaliyetlerini dayalı değildir. Son zamanlarda, hDFSCs bir servet matriks metalloproteinazların (MMPs), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve Hepatosit büyüme gibi biyoaktif faktörlerin salgılar gösterilmiştir faktör (HGF), anjiogenez, immunomodulation, ekstra hücresel matris remodeling ve onarıcı süreçleri36için çok önemli bir rol oynamaktadır.
Ancak, kök hücre tedavisinin geniş klinik çeviri hala büyük ilk hücre ölümü ve düşük faydalı kök hücre etkileri37,38gibi çeşitli sorunlar tarafından Engelli. Genetik Mühendisliği bu sorunları ele almak üzere bir umut verici strateji sağlar ve bu nedenle kök hücre38,39,40tedavi edici etkinliği büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme41,42, tehlike olmadan davranışını kontrol uygun adaylar, mikroRNA (miRs) geçici hücre manipülasyon için şunlardır 43. bugüne kadar birkaç yararlı miRs kök hücre çoğalması, hayatta kalma, posta, parakrin aktivite yanı sıra kendi farklılaşma içine birkaç soy44teşvik tespit edilmiştir. Örneğin, miR-133a hazır sıçan kalpler değiştirilmemiş MSCs45ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş bir kardiyak fonksiyon sonuçlanan bir artan hayatta kalma ve engraftment gösterdi MSCs mühendislik. Aynı şekilde, miR-146a overexpressing MSCs iskemik doku46gelişmiş bir terapötik verimliliği için sırayla açan VEGF daha yüksek miktarda salgılaması için gösterildi.
Bu el yazması seçici ayıklama ve hDFSCs genetik mühendisliği için detaylı bir Protokolü sunar. Bu amaçla, biz insan diş köklerinin hasat ve enzimatik sindirim yanı sıra hDFSCs sonraki yalıtım nitelendirdi. İzole hücreleri ayırdetmek için MSC özellikleri doğrulanması için önemli talimatlar için hücresel tedavi13uluslararası toplumun kurallarına uygun olarak dahil edilmiştir. Buna ek olarak, biz katyonik lipit tabanlı transfection strateji ve transfection verimliliği ve sitotoksisite değerlendirilmesi uygulayarak hDFSCs miR-modified nesil için ayrıntılı bir açıklama sağlar.

<table><tbody><tr><td>Fare anti İnsan CD105 Antikoru: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Klonu SN6, monoklonal</td></tr><tr><td>Fare IgG1 Negatif Kontrol Antikoru: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoklonal</td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD29 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Klon MAR4, monoklonal</td></tr><tr><td>APC Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Klon MOPC-21, monoklonal</td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD73 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Klon AD2, monoklonal</td></tr><tr><td>PE Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Klon MOPC-21, monoklonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Fare Anti-İnsan CD117 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>Klonu 104D2, monoklonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>Klon MOPC-21, monoklonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Fare Anti-İnsan CD44 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>Klon G44-26, monoklonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b, & kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Klon 27-35, monoklonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Fare Anti-İnsan CD90&nbsp; Antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Klon 5E10, monoklonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Klon MOPC-21, monoklonal</td></tr><tr><td>V500 Fare Anti-İnsan CD45 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>Klon HI30, monoklonal</td></tr><tr><td>V500 Fare IgG1, & kappa; İzotip Kontrol Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Klon X40, monoklonal</td></tr><tr><td>FcR Bloke Edici Reaktif, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0.22 & mikro; m, radyo-sterilize, polietersülfon</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Mezenkimal Kök Hücre Fonksiyonel Tanımlama Kiti</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>RNase dekontaminasyon solüsyonu; RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 etiketli öncü miR; Cy3 Boya Etiketli Pre-miR Negatif Kontrol #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA Öncü Negatif Kontrol #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AM17110 5 nmol</td></tr><tr><td>Katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi; Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Azaltılmış serum ortamı; Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Keçi IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>poliklonal</td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>poliklonal</td></tr><tr><td>Montaj ortamı; DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>histoloji montaj ortamı</td>ile Fluoroshield</tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Yazılımı 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011 yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin / EDTA çözeltisi (% 0.05 / % 0.02)</td> <td>PBS'de Biochrom</td><td>L2143</td><td>, w/o: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Amin reaktif boya; CANLI/ÖLÜ&ticaret; Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7.4; w/o: Ca ve Mg</td></tr><tr><td>PSG (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Bazal ortam; Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filtre, Sterifix şırınga filtresi 0.2 ve mikro; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; mL konik santrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,002</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>Dondurma ortamı, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Kriyotüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1.8 mL</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>%0.4</td></tr> <tr><td>Sayma odası</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lokal anestezik, Ksilositin (lidokain hidroklorür) %2 epinefrin (adrenalin) ile %0.001</td> <td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl çözeltisi</td><td>Braun</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikrorna tabanlı

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Bugüne kadar odak dejeneratif hastalıkların tedavisi için farklı gelişim aşamalarında birkaç kök hücre türü vardır. Henüz, ilk büyük hücre ölümü ve düşük tedavi edici etkileri, gibi belirli özellikleri onların geniş klinik çeviri bozulmuş. Genetik Mühendisliği kök hücre nakli öncesinde tedavi kök hücre efektleri optimize etmek için umut verici bir yöntemi olarak ortaya çıktı. Ancak, güvenli ve verimli gen vasıtalarının hala eksik. Bu nedenle, uygun yöntem geliştirme kök hücre tabanlı tedaviler mevcut sorunları çözmek için bir yaklaşım sağlayabilir.
Mevcut Protokolü çıkarma ve karakterizasyonu insan diş kökü kök hücre (hDFSCs) yanı sıra kendi viral genetik değişiklik açıklar. Doğum sonrası diş kökü yüksek yayılma potansiyeli haiz yetişkin multipotent kök hücre hasat için umut verici ve kolayca erişilebilir bir kaynak olarak açıkladı. Açıklanan yalıtım yordamı hDFSCs gömülü yirmi yaş dişleri üzerinden hasat için basit ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Ayrıca bu iletişim kuralı izole hücreler kök hücre özelliklerini tanımlamak için yöntem oluşmaktadır. Genetik mühendisliği için hDFSCs, bir en iyi duruma getirilmiş katyonik lipit tabanlı transfection strateji sitotoksik efekt neden olmadan sağlayan yüksek verimli mikroRNA giriş sunulmaktadır. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme tehlike olmadan davranışını kontrol mikroRNA'lar geçici hücre düzenleme, uygun adayları şunlardır. Böylece, bu iletişim kuralını onların tedavi edici etkinliği optimize etmek için önemli hale gelebilir hDFSCs Mühendisliği için güvenli ve verimli yordamı temsil eder.

Burada, hDFSCs insan diş kökü dokusundan hasat için detaylı yalıtım talimat mevcut. Rutin bir ameliyat sırasında diş kökü kolay erişim nedeniyle, bu yetişkin kök hücreleri çıkarım için umut verici bir kaynaktır.
İzole hDFSCs MSCs13tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi. Aslında, plastik-yapışık hücreleri küçük kültür koşulları açıklanan ve fibroblast benzeri morfoloji (Şekil 1...

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Bu yöntem Rejeneratif Tıp alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bir insan diş folikül kök hücreleri genetik olarak tedavi özelliklerini geliştirmek için tasarlanmış olabilir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kök hücrelerin kararlı genom entegrasyonu tehlikesi olmadan mikroRNA girişi ile modifiye edilebilmektedir. Oda sıcaklığına, insan diş folikülü kök hücresine veya hDFSC kültür ortamına ve PBSPSG çözeltisine önceden ısıtılarak iki folikülün enzimatik sindirim prosedürüne başlayın.Çözülme bir aliquot her Kollajenaz tip I ve Dispase II stok çözümleri. Kollajenaz tip I stok çözeltisi 500 mikrolitre ve% 1 antibiyotik ajan içeren Bazal Medium 4 mililitre Dispase II stok çözeltisi 500 mikrolitre ekleyerek bir sindirim çözümü hazırlayın. İnsan diş folikülü kök hücre izolasyonu sırasında site kontaminasyonunu önlemek için yıkama tamponları ve kullanılan kültür ortamı antibiyotik ajanlar içermelidir.Steril petri kabına çıkarılmış bir diş folikülü yerleştirin. Çıkarılan dokuyu yıkamak için 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ekleyin. Aspirat ve çözelti atın ve yıkama tekrarlamak için taze PBSPSG çözeltisi ekleyin.Steril bir neşter kıyma kullanarak parçalarhalinde çıkarılan folikül eğer 1 ile 1 milimetre. Kıyma lı dokuyu ve PBSPSG çözeltisini Petri kabından 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın, Petri kabını 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ile yıkayın ve çözeltiyi aynı tüpe aktarın. Konik tüpü oda sıcaklığında 353 x g'de on dakika santrifüj edin.Paletli dokuya 5 mililitre sindirim çözeltisi ekleyin, çözeltiyi ve dokuyu hafifçe karıştırın, karışımı 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de iki saat boyunca sallayarak kuvözde kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, oda sıcaklığında on dakika boyunca 353 g sindirilmiş hücre ve doku süspansiyon santrifüj. Supernatant atın ve HDFSC kültür orta 6 mililitre elde edilen palet yeniden askıya.Hücre süspansiyonuna 25 santimetre karelik bir hücre kültür şişesinde tohum atve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücre hasadı ve HDFSC karakterizasyonu metin protokolünde açıklandığı gibi sonra, 24 iyi hücre kültür plakası tohum hDFSCs. 24 saat boyunca 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %20 Oksijen ile kuluçkaya yat.Ertesi gün azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre mikroRNA mikroRNA 40 pikomol seyreltmek ve çözelti girdap. Katyonik lipid bazlı 0,67 mikrolitre seyreltin, azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre transfeksiyon reaktif, çözelti girdap, ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Beş dakika sonra önceden seyreltilmiş mikroRNA önceden seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin, çözelti karıştırın ve on beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra, hazırlanan transfeksiyon karmaşıklıkları, dropwise, doğrudan hücreler üzerinde kültür ortamı ekleyin. 24 iyi hücre kültürü plakasını ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Transfeksiyondan 24 saat sonra, 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde numunelerin süpernatantını toplayın. Hücreleri 1 mililitre PBS ile yıkayın ve PBS'yi ilgili santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelere 500 mikrolitre damla ve EDTA ekleyin ve 24 kuyu plakasını 3 7 santigrat derecede 3 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreler için hücre kültürü ortamı 1 mililitre ekleyerek ve ilgili santrifüj tüpü içine çözüm aktararak tripsinizasyon durdurun. Hücreleri 300 x g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Aksi belirtilmedikçe hücreleri ve reaktifleri buzüzerinde tutun.Supernatant atın, boyama tampon 100 mikrolitre hücreleri resuspend, ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp hücre çözeltisi aktarın. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için her örneğe 0,5 mililitre amin reaktif boya ekleyin. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.Hücrelere 1 mililitre PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 300g ve 4 santigrat derecede santrifüj atın Süpernatant'ı atın ve pbs'nin 100 mikrolitresi ndeki hücreleri yeniden askıya alın, 33 mikrolitre paraformaldehit ekleyin ve çözümleri karıştırın, numuneleri akış sitometrik ölçümlerine kadar ışıktan korunan 4 derece santigrat derecede saklayın. Örnekleri akış sitometrik ölçümleri için uygun tüplere aktarın ve metin protokolünde açıklanan gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi gerçekleştirin. İzole insan diş folikül kök hücreleri mezenkimal stromal hücrelerin tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi, hücreler plastik yapışık ve morfolojisi gibi bir fiberglas görüntülenen, standart kültür koşulları altında.Akış sitometrik analizi, hDFSC'lerin CD29, CD44, CD73, CD90 ve CD105 gibi belirli yüzey antijenlerinden oluşan bir paneli ifade ettiğini ortaya çıkardı. CD45 ve CD117 yokiken. Belirli In Vitro kültür koşulları altında hücrelerin adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma potansiyelleri immünboyama ile doğrulandı, için bir yağ asidi bağlayıcı protein:Osteokalsin, ve Aggrecan.Sitotoksisite ve Cy3'ün sayısallaştırılması için kullanılan gating stratejisi, transfeksiyon sonrası 24 saat mikroRNA alım verimliliğini etiketledi, canlı hücrelerin %100'ünde mikroRNA alımını doğruladı. Transfektasyonlu ve transfektasyonsuz örneklerdeki ölü hücrelerin karşılaştırılabilir miktarları mikroRNA'nın sitotoksik etkiler olmadan verimli bir şekilde sunulduğuna işaret eder. Bu prosedürü takiben Cytolab plastisite gibi ek soruları cevaplamak için transdifferentiation gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.

isolation-characterization-microrna-based-genetic-modification-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Burada insan diş Pulp kök hücre izolasyon ve yayılması için bir protokol Nöronal Farklılaşma süreci sırasında prion protein ifade değerlendirmek için mevcut.

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.

Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

İnsan dişinden başlayarak epitelyal organoid kültürlerin geliştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Organoidler sağlam bir şekilde genişletilebilir ve ameloblast farklılaşma kapasiteleri de dahil olmak üzere dişin epitel kök hücrelerini özetler. Eşsiz organoid model, insan diş (kök hücre) biyolojisini diş rejeneratif yaklaşımlar için perspektiflerle incelemek için umut verici bir araç sağlar.

İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması

Bu makale, eksplant kültür yöntemini kullanarak dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak ve bu hücrelerin ICSCRT yönergelerine dayalı olarak karakterizasyonunu yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokol ile izole edilen hücreler, daha sonraki uygulamalar için mezenkimal kök hücreler olarak kabul edilebilir.

Dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürü

Bu protokol, multipotent kök hücrelerin enzimatik sindirim yoluyla diş pulpasından ekstraksiyonunu, kültürünü ve korunmasını vurgular. Ek olarak, osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyellerini göstererek süreçte hassasiyet ve tutarlılığın önemini vurgular.

İnsan Süt ve Daimi Dişlerinden Dental Pulpa Kök Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Öğrenin, insan diş folikülü kök hücrelerinin mikRNA ile geçici genetik mühendisliğini. Bu yöntem, kalıcı genom entegrasyonu riski olmadan hücreleri güvenle modifiye eder ve rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

Daha fazla video keşfet