Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Bu yöntem, nörobilim, onkoloji ve ötesinde, hücre tipine özgü ekspresyon ve beyin ve tümör mikro ortamlarındaki ek varyantlarının uzamsal haritalanması gibi temel araştırma sorularını ele alabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerde doku bağlamında ekzon bağlantılarını, kısa dizileri ve nokta mutasyonlarını çok yüksek hassasiyet ve özgüllük ile tespit edebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yardımcı bilim adamı olan Hell Pimentel olacak.

Dokuyu hazırlamak için, diseksiyondan hemen sonra oda sıcaklığında% 10 nötr tamponlu formalin içinde 16 ila 32 saat sabitleyin. Daha sonra, numune işlenir ve standart prosedürler kullanılarak parafine gömülür. Gömülü dokuyu bir mikrotom kullanarak beş artı veya eksi bir mikronluk bölümlere kesin.

Bölümleri elektrostatik olarak yapışkanlı cam slaytlara monte edin ve gece boyunca oda sıcaklığında havayla kurutun. RNA NC2 hibridizasyon testini gerçekleştirmeden bir saat önce, monte edilmiş doku slaytlarını bir sürgülü rafa yerleştirin ve 60 santigrat derecede sirkülasyonlu bir hava fırınında pişirin. RNA NC2 hibridizasyon testine başlamadan önce, hibridizasyon fırınının 40 santigrat dereceye ayarlandığından emin olun.

Nemlendirme kağıdını iyice ıslatın, kalan suyu alın ve kapağı nem kontrol tepsisine yerleştirin. 180 mililitre suya 20 mililitre 10X hedef alma reaktifi ekleyerek 200 mililitre ticari olarak temin edilebilen 1X hedef alma reaktifi hazırlayın. Bir buharlı pişiriciye iki sürgü tutucu yerleştirin.

Bir sürgü tutucuyu 200 mililitre 1X hedef alma reaktifi ve diğerini 200 mililitre su ile doldurun. Buharlı pişiriciyi kullanarak her iki çözeltiyi de kaynatın. 50X yıkama tamponunu 10 ila 20 dakika boyunca 40 santigrat dereceye ısıtın.

Ardından, 60 mililitre önceden ısıtılmış 50X yıkama tamponunu 2,94 litre su ile seyrelterek üç litre 1X yıkama tamponu hazırlayın. Bir davlumbazda, 100 mililitre suya 100 mililitre Gill hematoksilen ekleyerek Gill'in hematoksilen karşı boyama solüsyonunun %50'sini hazırlayın. 250 mililitre suya 1.43 mililitre% 20 ila% 30 amonyum hidroksit ekleyerek mavileştirme reaktifi hazırlayın.

Prob hibridizasyonundan önce hedef probları 40 santigrat derecede 10 dakika önceden ısıtın. Yedi yükseltici reaktifi, Amp 0 ila 6, oda sıcaklığına. Fırından bölümleri çıkararak ve monte edilen doku slaytlarını beş dakika boyunca çalkalayarak ksilene daldırarak numune ayrıştırmasını başlatın.

Beş dakika boyunca taze ksilen içinde tekrar deparifinize edin. İki dakika boyunca çalkalama ile% 100 etanol içinde kurutun. Ve taze% 100 etanolde iki dakika boyunca tekrarlayın.

Slaytları 60 santigrat derecede sirkülasyonlu bir hava fırınında tamamen kuruyana kadar beş dakika havayla kurutun. Daha sonra, endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için bölümleri oda sıcaklığında yaklaşık dört damla kullanıma hazır hidrojen peroksit ile 10 dakika inkübe edin. Çözeltiyi slaytlardan boşaltın ve iki kez suyla durulayın.

Bölümleri önceden ısıtılmış suya kısa bir süre batırın ve ardından bölümleri buharlı pişiricide 15 ila 30 dakika boyunca 100 santigrat derecede 200 mililitre hedef geri alma reaktifine yerleştirin. Slaytları hedef alıcıdan çıkarın ve iki kez suyla durulayın. Üç dakika boyunca% 100 etanole batırın.

Daha sonra slaytları tamamen kuruyana kadar sirkülasyonlu bir hava fırınında 60 santigrat derecede kurutun. Slaytlar kuruduktan sonra, bölümün etrafına yaklaşık 0,75 x 0,75 inç hidrofobik bir bariyer çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Bariyerin oda sıcaklığında bir dakika tamamen kurumasını bekleyin.

Slaytları bir sürgü tutucuya yerleştirin ve sürgü tutucuyu önceden ısıtılmış nem kontrollü tepsiye yerleştirin. Her slayta yaklaşık dört damla proteaz 3 ekleyin ve hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi slaytlardan boşaltın ve iki kez suyla durulayın.

Prob hibridizasyon prosedürüne başlamak için, tüm bölümü kaplayacak şekilde kullanıma hazır uygun prob solüsyonundan yaklaşık dört damla ekleyin. Probları hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede iki saat boyunca hibritleştirin. Solüsyonu slaytlardan boşaltın ve slaytları 200 mililitre 1X yıkama tamponunda oda sıcaklığında ara sıra iki dakika çalkalayarak yıkayın.

Yıkama işlemini tekrarlayın. Bir sonraki adım, bölümleri bir dizi yükseltici reaktor halinde inkübe ederek sinyali yükseltmektir. Her slayttaki tüm bölümü kaplamak için yaklaşık dört damla Amp 0 ekleyin ve hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra çözeltiyi boşaltın ve slaytları 200 mililitre 1X yıkama tamponunda oda sıcaklığında ara sıra iki dakika çalkalayarak yıkayın. Yıkama işlemini tekrarlayın. Aynı şekilde, Amp 1'den Amp 6'ya kadar olan bölümleri bu şemada belirtilen sıcaklıkta ve süre boyunca inkübe edin.

Slaytlar bir dizi amplifikasyon reaktifi ile muamele edildikten sonra, bir Hızlı Kırmızı boya çalışma çözeltisi hazırlayın. Uygun hacimde Fast Red-B boyası ve Fast Red-A boyayı bir tüpe ekleyin ve iyice karıştırın. Slaytlardaki fazla sıvıyı boşaltın ve Hızlı Kırmızı boya çalışma solüsyonunu slaytlara ekleyin.

Slaytları kapaklı bir tepside oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra Fast Red solüsyonunu boşaltın ve musluk suyuyla yukarı ve aşağı batırarak slaytları iki kez durulayın. Doku bölümlerini lekelemek için, slaytları oda sıcaklığında% 50 Gill'in hematoksilen çözeltisine iki dakika daldırın.

Slaytları musluk suyuyla yıkayın, bölümler mor kalırken slaytlar berraklaşana kadar bunu birkaç kez tekrarlayın. Slaytları mavileştirmek için iki ila üç kez %02 amonyaklı suya batırın. Amonyak suyunu musluk suyuyla değiştirin ve slaytları üç ila beş kez yıkayın.

Slaytları tamamen kuruyana kadar 15 dakika boyunca 60 santigrat derecede sirkülasyonlu bir hava fırınında kurutun. Bir kapak kızağı üzerine bir ila iki damla montaj reaktifi yerleştirin ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önlerken sürgüyü kapak kızağının üzerine yerleştirin. Slaytları en az beş dakika havayla kurutun.

Son olarak, slaytları standart bir parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Çift-Z ekzon bağlantı probları, iki formalin sabit parafin gömülü veya FFPE glioblastoma örneğinde EGFRvIII durumunu belirlemek için tasarlanmıştır. Her iki vahşi tip prob, her iki numunede de sinyal tespit etti, bu da iki numunenin vahşi tip EGFR'yi ifade ettiğini gösterdi.

Bununla birlikte, mutant prob, EGFRvIII negatif numunede değil, yalnızca EGFRvIII pozitif numunede sinyal tespit etti. Pozitif ve negatif kontrol probları teste dahil edildi. Antisens veya sense probları kullanılarak bir FFPE hücre peleti olarak hazırlanan ve dizileri kırmızı olarak hedefleyen Jurkat hücreleri üzerinde kısa bir hedef testi gerçekleştirildiğinde, hem CDR3-alfa hem de CDR3-beta için antisens problarla sağlam boyama gözlenirken, sense probları çok az sinyal tespit etti veya hiç sinyal tespit etmedi.

Negatif kontrol olarak dapB kullanıldı. Test ayrıca nokta mutasyonlarını da tespit edebilir. Bu örnekte, biri L858R mutasyona uğramış EGFR dizisini ve diğeri EGFR L858 vahşi tip dizisini tespit etmek için olmak üzere iki prob tasarlanmıştır.

Mutant prob, EGFR L858R mutasyonu için heterozigot olan H1975 hücre hattında sinyal tespit etti, ancak sadece EGFR L858 vahşi tipini ifade eden H2229 hücre hattında sinyal tespit etmedi. Vahşi tip prob, her iki hücre hattında da sinyal tespit etti. Bu prosedürü denerken, dokularınızı düzgün bir şekilde sabitlemeyi, pozitif ve negatif kontrol problarını çalıştırmayı ve hibridizasyon fırınında slayt işleme sistemini kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hücre tipine özgü ekleme varyantlarının ifadesinin veya kısa hedef dizilerinin tanımlanması gibi ek soruları yanıtlamak için hücre işaretleyicili IHC gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim, onkoloji ve ötesindeki araştırmacıların doku bağlamında alternatif birleştirme olaylarını keşfetmeleri, uzamsal olarak haritalanmış nokta mutasyonlarını tanımlamaları ve yüksek derecede homolog ve kısa dizileri yerinde görselleştirmeleri için yol açtı. Nötr tamponlu formalin ve ksilen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocakta çalışmak ve kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.