Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Bu yöntem, böcek toksikolojisi alanındaki temel sorulara yardımcı olabilir, örneğin, metabolik detoksifikasyon genlerinin tümü insektisit direncinde rol oynarsa? Bu tekniğin temel avantajı, daha büyük protein ölçeklerinin üretilmesine izin vermesi ve bu proteinlerin in vitro insektisitlerin metabolize edilmesindeki işlevini karakterize etmesidir. Prosedürleri gösteren, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Xuechun Feng olacak.

Xuechen'in doktora araştırması, karasineklerin parazit direncinde karboksil esterazın işlevinin karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır, Musca domestica. Başlamak için, bir mikrolitre GFP giriş plazma DNA'sını, 250 mikrolitrelik PCR tüplerinde ticari olarak temin edilebilen beş mikrolitre C-term lineer DNA ile karıştırın. Ardından, PCR tüplerinin her birine ticari olarak temin edilebilen iki mikrolitre lambda rekombinasyon karışımı ekleyin.

Tüpleri yavaşça karıştırın ve gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İki mililitre log faz büyüme böceği SF9 hücre kültürünü bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına eşit şekilde tohumlayın. Ardından, hücrelerin davlumbazda oda sıcaklığında en az üç saat tutturulmasına izin verin.

250x'te ters çevrilmiş bir faz mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Ardından, hücre kültürü ortamını çıkarın ve iki mililitre Grace'in böcek ortamı ile değiştirin. Bundan sonra, metin protokolüne göre transfeksiyon karışımı A ve B çözeltilerini hazırlayın.

Daha sonra tüplere vurarak transfeksiyon karışımları A ve B'yi yavaşça karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında, davlumbazda 35 dakika inkübe edin. Daha sonra, karışımı tohumlanmış hücrelerin üzerine damla damla ekleyin.

Kuyucukları bantla kapatın ve hücreleri gece boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Grace'in böcek ortamının iki mililitresini iki mililitre tam büyüme ortamıyla değiştirin. Ardından, her bir oyuğa 100 mikromol Gansiklovir ekleyin.

Kuyucukları bantla kapatın ve hücreleri 72 saat boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Enfeksiyondan 72 saat sonra, ortamı her kuyudan toplayın ve 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra tüpleri 1500 kez G'de, dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Kuyuya bir mililitre tam büyüme ortamı ekleyin ve P1 bakulovirüs amplifikasyon aşamasında hücrelerin enfeksiyon belirtilerini gözlemlemek için floresan ışıklı bir mikroskop kullanın. Süpernatanı yeni 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve karanlık koşullarda dört santigrat derecede saklayın. Bundan sonra, iki mililitre log faz büyüme böceği SF9 hücre kültürünü, bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına eşit şekilde tohumlayın.

Hücrelerin oda sıcaklığında, davlumbazda en az üç saat tutturulmasına izin verin. Beş mikrolitre P1 virüsü stoğunu hücre tohumlu oyuklara aşılayın, ardından her oyuğa 100 mikromol Gansiklovir ekleyin. Kuyuları kapatın ve hücreleri 27 santigrat derecede 72 saat inkübe edin.

İlk olarak, T25 işlenmemiş şişelerde tam büyüme ortamı ile beş mililitre log faz büyüme böceği SF9 hücrelerini kültürleyin. Daha sonra, hücre kültürünü enfekte etmek için 25 mikrolitre P1 virüsü stok çözeltisi ekleyin, 48 saat boyunca, 27 santigrat derecede hafifçe çalkalanarak. Asetonitril kullanarak, 100 milimol permetrin seri dilüsyonları hazırlayın.

Daha sonra, 300 mikrolitre tam büyüme ortamı ile desteklenmiş 200 mikrolitre enfekte hücre kültürünü 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Permetrin'in asetonitril içinde tamamen çözüldüğünden ve plakanın her bir oyuğuna eşit şekilde verildiğinden emin olun. Permetrin'i ekledikten sonra, permetrini ortamdaki tamamen karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın.

Bundan sonra, plakayı bantla kapatın ve plakayı karanlık koşullarda 48 saat boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Alttaki bağlı hücre tabakasını bozmadan hücre kültürü ortamını plakadan çıkarın. Her oyuğa 200 mikrolitre MMT reaktifi ekleyin.

Daha sonra, plakayı 37 santigrat derecede dört saat boyunca, her bir oyukta koyu mor formazan çökeltileri oluşana kadar inkübe edin. Çökelticileri tamamen çözmek için her kuyucuğa 500 mikrolitre DMSO ekleyin. Daha sonra 200 mikrolitre çözünmüş çözeltiyi 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın.

Çökeltinin DMSO'ya tamamen çözülmesi, sonuçların doğruluğu için çok önemlidir. DMSO'yu plakadaki numunelere ekledikten sonra, numuneler, çökelti tamamen çözülene kadar pipet kullanılarak birkaç kez yıkanacaktır. Son olarak, plakanın absorbans değerlerini 540 nanometrede ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.

P1 aşamasında enfeksiyon oranı düşüktür. P2 aşamasında, enfeksiyon oranı önemli ölçüde artmıştır. P3 enfeksiyonu aşamasında, hemen hemen tüm hücreler, hücre kültürü plakasından ayrılma, hücre çapında artış ve hücre büyümesinin durması belirtileri gösterdi.

Tespit edilen absorbans değerlerine dayanarak, Md alfa E7 eksprese eden hücreler, kontrol CAT hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek canlılık göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, hücre deneylerini gerçekleştirmeden önce şişe ve tüp gibi maddelerin yüzeyini yüzde 70 etanol ile silerek tüm adımlarda hücre kontaminasyonunu önlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, karboksil esteraz proteini ve permetrin ligandı arasındaki etkileşimler gibi ek soruları yanıtlamak için homoloji modellemesi ve karanlık analiz gibi diğer bazı yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, böcek toksikolojisindeki araştırmacıların, böceklerin böcek ilacına direncindeki genlerin ve mekanizmaların fonksiyonel karakterizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Böcek ilacı ile çalışmanın çok zararlı olabileceğini ve bu prosedürleri uygularken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.