Virüslü Ifnar1^{- / -} farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Zika virüs enfeksiyonu sırasında, T hücreleri virüs ortadan kaldırılması için immünoayrıcalıklı organlara sızabilir ama aynı zamanda guillain-Barre sendromu veya testis yaralanması gibi immünopatogenez katkıda bulunabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hem Zika virüsü enfeksiyonu sırasında hem de aşı aşısı sonrası immünojen ekibe özgü t hücrelerinin tetramer bazlı olarak saptanmasıdır. Bu modelde, Zika virüs enfeksiyonu interferon alfa / beta reseptör nakavt fareler de başlatılan, beyinde Zika virüsüne özgü T hücrelerinin izlenmesine izin, testisler, ve dalak.

Tetramer boyama yaklaşımı kullanarak, immünkoruma ve immünopatojenik hücrelere T-hücre katkılarını araştırmak için Zika virüsüne özgü T hücrelerine sızan immünoayrıcalıklı organın sadece özelliklerini araştırmak mümkündür. Zika virüs enfeksiyonu için, altı ila sekiz haftalık interferon alfa/beta reseptör nakavt farelere retro-orbital aşılama yoluyla PBS'nin 100 mikrolitresinde zika virüsünün dört odak oluşturan birimine 10 kez teslim edin. Daha sonra, 15 gün boyunca günlük enfekte hayvanların ağırlığı ve klinik belirtileri izleyin.

Yedi gün sonra aşı, cerrahi bir köpük üzerinde supine pozisyonda enfekte hayvan güvenli, ve karın orta hattı boyunca bir deri kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Karın kasları açmak için makas kullanın, ve yavaşça karaciğer ayıklamak. Sonra, dalak çıkarın ve kan kaldırmak için PBS üç kez doku durulayın.

Son yıkamadan sonra, dalağını 1,5 mililitre buz üzerinde, tüm dalaklar toplanana kadar buz üzerine yerleştirin. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, 50 mililitrelik bir tüpün üzerine steril, 40 mikrometrelik kafes hücresüziçine dalak yerleştirin ve süzgeçe %10 fetal sığır serumu veya FBS ile takviye edilmiş iki mililitre buz gibi RPMI ortamı ekleyin. Daha sonra, beş mililitrelik şırınganın pistonlu kısmını kullanarak, serbest bırakılan hücreleri kafesten temizlemek için taze ortam kullanarak, sazdan gelen dokuyu filtreden geçirin.

Santrifüj için tek hücreli süspansiyonu 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve peleti beş mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponunda yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş ila altı dakika sonra, ikinci bir santrifüj için 10 mililitre buz gibi RPMI artı FBS ile lysis durdurmak ve sayma için tam orta 10 mililitre pelet resuspend. Yedi gün sonra aşı, bir kesme tahtası üzerinde eğilimli pozisyonda bir ötenazi, enfekte, erkek fare immobilize ve düz bir-by-iki-diş forceps ile kafa derisi güvenli.

Kafa derisi üzerinde bir orta hat kesi yapmak için iris makas kullanın, kafatası açığa, ve keskin cımbız ile yörüngelerin iki tarafını kenetlemek için keskin cımbız kullanın, beyin sabitleme. Foramen magnum içine keskin iris makas bir ucu yerleştirerek, her iki tarafta kafatası içine yanal kesilmiş. Dikkatle orta hatta kadar aynı boşluktan kesilmiş, burun doğru, beyin yaralanmasını önlemek için mümkün olduğunca yüzeysel olarak makas uçları tutmak.

Forseps ile beyin kaldırın ve dikkatle kranial sinir lifleri incelemek için keskin iris makas kullanın. Daha sonra, beş mililitre buz gibi RPMI artı FBS içeren 15 mililitrelik bir tüp içine beyin aktarmak için forceps kullanın. Testisleri izole etmek için, forseps ile karın deri asansör, ve integument ve karın duvarı ile uzunlamasına bir kesi yapmak ve karın alt kısmını ortaya çıkarmak için iris makas kullanın.

Testisleri kesiye kadar itin ve her iki tarafta küresel bir testis ortaya çıkarmak için yağ tabakasını yavaşça çekmek için cımbız kullanın. Yağ tabakasını ve epididimisi dikkatlice incelemek için iris makası kullanın ve testisleri beş mililitre buz gibi RPMI artı FBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hasat edilen dokulardan herhangi birinden tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, 50 mililitrelik bir tüpün üzerine 100 mikronluk bir kafesiçeren steril bir hücre süzgecine organı yerleştirin ve süzgeçe iki mililitre buz gibi RPMI artı FBS ekleyin.

Beş mililitrelik bir şırıngadan gelen pistonu kullanarak, dokuyu püre haline getirin ve organ mesh ten tamamen topraklanmış olana kadar filtreyi taze orta ile yıkayın. Tek hücreli süspansiyonu santrifüj için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve peleti %30 yoğunlukgradient ortamda beş mililitre deaskıya alın. Hücre çözeltisini yeni bir 15 mililitrelik tüpte %70 yoğunlukgradient ortamının iki mililitreüzerine dikkatlice katlayın ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjü ile ayırın.

Daha sonra, iki yoğunluk degradesi arasındaki interfazhücreleri başka bir santrifüj için 10 mililitre soğuk RPMI artı FBS içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve toplama için 10 mililitre buz gibi RPMI/FBS peleti yeniden askıya alın. Akış sitometri sitometri ile hücreleri analiz etmek için, FACS tampon konsantrasyonunda 100 mikrolitre başına altı hücreye beş kez 10 hücreleri seyreltin ve hücre örnek başına 10 mikrolitre anti-fare CD16/CD32 bloke antikor ile hücre örnekleri kuluçka. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, deneysel akış sitometri boyama protokolüne göre 96 kuyulu, yuvarlak alt plakanın uygun sayıdaki kuyularına 20 mikrolitre hücre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka için her kuyuya 20 mikrolitre E-protein tetramet karışımı ekleyin.

Kuluçka sonunda, ışıktan korunan dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için hücrelere ilgi hücre yüzeyi antikorları ekleyin. Daha sonra, yıkama başına 200 mikrolitre FACS tampon ile hücreleri iki kez yıkayın ve her bir kuyudaki hücreleri 200 mikrolitre taze FACS tamponuyla dikkatlice yeniden askıya alın. Daha sonra, numuneleri ışıktan korunan dört santigrat derecede, akış sitometresi üzerinde analiz edilene kadar saklayın.

Zika virüsü ile aşılamadan yedi gün sonra interferon alfa/beta reseptör 1 nakavt farelerinde patolojik belirti ve miyeloparalizi ve motor paraparezi gibi bulgular gözlenmektedir. Enfekte interferon alfa/beta reseptör1 nakavt hayvanlarda kilo değişiklikleri 15 gün boyunca izlendi, kilo kaybı ilk enfeksiyon ve kilo kurtarma gün yedi post-enfeksiyon başlayan dört gün sonra gözlenen ile. Enfekte murin beyinlerinin temsili görüntüleri, Zika virüsü ile aşılamadan yedi gün sonra belirgin ödem ve hiperemi olduğunu ortaya koymaktadır.

Murine Zika enfekte testislerinin temsili görüntüleri enfeksiyon sonrası yedinci günden 30 güne doğru kademeli bir küçülme olduğunu göstermektedir. Zika enfekte beyin ve testis doku bölümlerinin histopatolojik analizi de enfekte olmayan kontrollere göre yıkıcı patolojik değişikliklerin etkisini göstermektedir. Makro ve histopatolojik analizlerden beklendiği gibi, beyinde yüksek viral yükler de tespit edilir ve zika virüsü bulaşmış farelerin testislerinde immünboyama ile testisler de tespit edilmektedir.

Buna Zika sonrası beyne sağlam bir CD3-pozitif T-hücre infiltrasyonu eşlik ediyor. Zika virüsüne özgü CD3-pozitif, CD8-pozitif T lenfositleri hem Zika virüsü neşrile hem de aşı-aşılı farelerde E-protein tetramer boyama ile saptanır. E-protein tetramer spesifik CD8-pozitif T hücreleri de beyinde tespit edilebilir ve zika virüsü ile aşılama dan sonra yedi gün testisler.

Bu teknik, geliştirildikten sonra hayvan modellerinde doğal enfeksiyonlar sırasında immünoprevalent organlarda patojene özgü T-hücre karakterizasyonu çalışmalarında araştırmacıların önünü açmıştır. Bu yöntem aynı zamanda plasenta veya göz gibi diğer bağışıklık yaygın organlara uygulanabilir, hem viral enfeksiyon ve kanser. Bu prosedürü takiben, MHC-I tetramerleri beyin veya testis-infiltrasyon T hücrelerinin dağılımıerişmek için patojen-spesifik T hücrelerinin immünohistokimyasal veya immünofloresan tespiti için kullanılabilir.