Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Bu yöntem, hem kararlı hem de hastalık durumlarında kalpteki bağışıklık hücresi alt kümelerinin bileşimi hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, çok nadir alt kümeler de dahil olmak üzere kardiyak immün hücre popülasyonlarının doğru immünofenotiplemesi için kullanılabilmesidir. Bu protokol nispeten basittir.

Bununla birlikte, kuyruk damarı enjeksiyonları zor olabilir, bu nedenle deney hayvanlarını kullanmadan önce rahat olana kadar bu tekniği uygulamak önemlidir. Dolaşımdaki lökositleri etiketlemek için, PBS'de 200 mikrolitre taze hazırlanmış fare florofor konjuge anti-CD45 antikorunu 28.5 gauge insülin şırıngasına yükleyin ve sekiz adet 12 haftalık fareyi dolaşımdaki bir su battaniyesi üzerinde 35 ila 41 santigrat dereceye ayarlayın beş ila on dakika. Kuyruk damarı genişlediğinde, ilk hayvanı sternal pozisyonda uygun bir kısıtlama cihazında tutun.

Kuyruk damarları yeterince genişlememişse, kuyruğu bir ila iki dakika boyunca 36 ila 40 santigrat derece suya batırın. Kuyruk damarları hazır olduğunda, enjeksiyon alanını% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bezle temizleyin ve kuyruğun tabanını işaret ve orta parmaklarla ve kuyruğun orta distal bölgesini başparmak ve yüzük parmağıyla hareketsiz hale getirin. İğneyi eğimli tarafı yukarı ve damara paralel tutarak, iğneyi genişlemiş bir kuyruk damarına yerleştirin ve tüm antikor hacmini intravenöz olarak enjekte edin.

Ardından, insancıl ötenaziden önce antikorun beş dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Kalbi hasat etmek için, fareye% 70 etanol püskürtün ve karnı kalçalardan sternuma kadar ventral orta hat boyunca açmak için karın derisini kaldırın. Peritonu açın ve diyaframı ortaya çıkarmak için karaciğeri hareket ettirin.

Akciğerleri ve kalbi delmemeye dikkat ederek orta hattın her iki yanındaki diyaframı ve kaburgaları kesin. Sol ve sağ kulakçıkları kesmeden önce kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru soyun. Kalbin tabanını forseps ile nazikçe kavrayarak, 60 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 21 gauge iğneyi apeksin yakınındaki sol ventriküle yerleştirin ve kalbi 15 ila 20 mililitre soğuk PBS ile perfüze edin.

İntravasküler kontaminantlardan kaçınmak için kalbin uygun şekilde perfüzyonu şarttır. Bu nedenle, pıhtılaşmış kan nedeniyle kontaminasyonu önlemek için ötenaziden sonra kalbi hızlı bir şekilde incelemeye ve perfüze etmeye özen gösterin. Az önce gösterildiği gibi sağ ventrikül perfüze edildikten sonra, beyaz akciğerler ve soluk bir karaciğer gözlenmelidir.

Kalbin tabanını forseps ile tutarak kalbi nazikçe yukarı çekin ve kalp dokusunu ayırmak için ana pulmoner arterleri ve venleri, aortu ve perikardiyal kesesi kesin. Kalbi başparmak ve işaret parmakları arasında nazikçe tutarak, kalbi temiz, tüy bırakmayan bir kağıt havluyla dikkatlice temizleyin ve atriyumları ve ana arterlerin ve damarların kalıntılarını veya diğer kirleticileri çıkarmak için forsepsleri kullanın. Temizlenmiş kalbi beş santimetrelik plastik bir tabağa koyun ve 50 mikrolitre soğuk PBS ekleyin.

Kavisli diseksiyon makası kullanarak, görünür parça kalmayana ve doku pürüzsüz, kalın bir kıvama gelene kadar kalbi kıyın. Dokuyu 800 mikrolitre soğuk DMEM içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için kavisli forseps kullanın. Kollajenaz, DNaz ve hyaluronidaz ile takviye edin ve 37 santigrat derece ve 50 rpm'de 45 ila 60 dakika inkübe edin.

Sindirimin sonunda numuneleri 20 saniye boyunca vorteksleyin ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Aksi belirtilmedikçe numune her zaman dört santigrat derecede tutulmalıdır, çünkü bazı yüzey antijenleri oda sıcaklığında bırakılırsa içselleştirilebilir. Daha sonra, bir mililitre soğuk HBB ile numune başına 50 mililitrelik konik bir tüpte 140 mikrolitrelik hücre süzgecini önceden ıslatın.

Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, doku süspansiyonları homojen olana ve pipet ucunu tıkamayana kadar numuneleri pipetleyin ve homojenize edilmiş numuneleri filtrelere ekleyin. Numuneleri, numune başına 12 ila 14 mililitre soğuk HBB ile filtrelerden yavaşça yıkayın ve filtrelenmiş numuneleri buz üzerinde etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. İyi bir sindirim, filtrede kalp kalıntılarının olmaması ile gösterilir.

Numuneleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın. Her numuneye bir mililitre amonyum klorür potasyum lizis tamponu ekleyin. Numuneleri kısa bir girdap ile yeniden askıya alın, ardından oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon yapın.

Daha sonra hemolizi beş ila sekiz mililitre soğuk HBSS ile durdurun. Numuneleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri bir mililitre floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasında veya FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve başka bir santrifüjleme için ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için peletleri 50 mikrolitre anti-CD16 / CD32 antikoru ve bir monosit blokeri içinde yeniden süspanse edin.

Yıkamadan, ışıktan korunarak dört santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için karıştırarak her numuneye 50 mikrolitre antikor ana karışımı ekleyin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri tüp başına 600 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayın ve peletleri 300 mikrolitre taze FACS tamponu veya% 1 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra kardiyak lökositleri standart akış analizi protokollerine göre akış sitometrisi ile analiz edin.

Kardiyak tek hücreli süspansiyonun akış sitometrisi ile analizi, bağışıklık hücrelerini kalbin immün olmayan hücrelerinden ayırt etmek için CD45 ile ön geçitlemeyi, ardından tek hücreli ve küçük boyutlu dışlama kapısını gerektirir. CD64 ekspresyonu ile tanımlanan makrofajlar, kalbin ana bağışıklık hücresi popülasyonudur ve tüm bağışıklık hücrelerinin %60 ila 70'ini temsil eder. Konvansiyonel kardiyak dendritik hücreler, yüksek seviyelerde MHC sınıf II ve CD11c eksprese eden CD64 negatif hücrelerdir.

Bu hücreler, CD103 veya CD11b ekspresyonlarına bağlı olarak daha da bölünebilir ve makrofajlara kıyasla çok daha küçük bir kardiyak alt popülasyonu temsil eder. Tek hücreli bir miyokard süspansiyonunun akış sitometrisinin kullanılması, kalpteki küçük lökosit alt popülasyonlarının incelenmesine izin verir. Örneğin, vahşi tip miyokardın bağışıklık hücrelerini Batf3 eksikliği olan farelere karşı karşılaştırmak için akış sitometrisi analizi kullanılarak, nakavt hayvanlarda CD103 pozitif dendritik hücrelerin eksikliği doğrulanabilir.

Ek olarak, bu analiz, Batf3 eksikliği olan hayvanlarda diğer kardiyak popülasyonların bileşiminde önemli bir değişiklik olmadığını ortaya çıkardı ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bu kombine enzimatik ve mekanik sindirim yöntemi kullanılarak elde edilebilecek hassasiyet derecesini gösterdi. Bu prosedürü denerken, hücre izolatınızın canlılığını her zaman hesaba katmak önemlidir. Bu nedenle, sindirimin süresini ve enzim konsantrasyonunu deneysel koşullarınıza göre optimize etmenizi öneririz.

Bu prosedürü takiben, izole edilen hücrelerin işlevleri hakkında ek soruları yanıtlamak için tek hücreli RNA dizilimi, fonksiyonel testler ve manyetik boncuk izolasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.