Kynurenine ve Kynurenic asit yüksek performanslı sıvı kromatografi ölçüsü: Biyokimya biliş ve uyku sıçanlarda ilişkin

Bu yöntem, sıçanlarda akut kinürenin tehdidinin etkisi hakkında sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için biyokimyasal ve davranışsal yaklaşımları birleştirir. Tekniğin ana avantajı, sıçan beyni ve plazmasındaki kinürenin yolağı metabolitlerinin ölçümü için güvenilir ve tutarlı bir yöntem sağlamasıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir öğrenci araştırma asistanı olan Carly Fabian olacak.

İntraperitoneal kinürenin uygulamasından sonra uygun deneysel son noktada, donmuş hasat edilmiş plazmayı ıslak buz üzerinde çözdürün ve çözülmüş numuneleri ultra saf su ile seyreltin. 100 mikrolitre seyreltilmiş numuneyi 25 mikrolitre% 6 perklorik asit içeren ayrı kaplara aktarın ve numuneleri santrifüjleyin. Daha sonra, kinürenin ve kinürenik asit tayini için her tüpten 100 mikrolitre süpernatanı ayrı ayrı 250 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Beyin örneklerinden kinürenik asit ölçümü için, donmuş hasat edilmiş beyin örneklerini kuru buz üzerinde çözdürün ve her örneği hassas bir analitik terazide ayrı ayrı tartın. Tüm numuneler tartıldığında, tüpleri ıslak buz üzerine taşıyın ve her doku numunesini ultra saf su ile hacimce bir ila 10 ağırlık oranında seyreltin, ardından bir sonikatör ile homojenizasyon yapın. Her numune bulamacından 100 mikrolitre yeni bir tüpe alın, ardından vorteksleme ve santrifüjleme için 25 mikrolitre% 25 perklorik asit ekleyin.

Daha sonra, kinürenik asit tayini için 100 mikrolitre süpernatanı ayrı ayrı 250 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kinurenin analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC makinesini hazırlamak için, önce tek tek HPLC giriş tüplerini mobil faz, ultra saf su ve% 100 asetonitril kaplarına yerleştirin. Ardından, cihazı dakikada 0,5 mililitrede %5 asetonitril ve %95 ultra saf su çalıştıracak şekilde programlayın ve HPLC makinesinin 20 ila 30 dakika çalışmasına izin verin.

Kararlı bir basınç ve taban çizgisi elde edildiğinde, çözelti bileşimini %5 asetonitril ve %95 sodyum asetat mobil fazına değiştirin ve cihazı 30 dakika daha dengeleyin. Cihaz dengelenirken, floresan dedektöründeki lambayı açın. Türevizasyondan önce, çinko asetat çözeltisini mobil faz direk kolonu ile birleşen peristaltik bir pompadan ayrı olarak pompalayın ve kolon sonrası pompayı, yaklaşık 500 psi'lik sabit bir basınca ulaşana kadar yaklaşık 20 dakika boyunca dakikada 0,1 mililitre akış hızına getirin.

Cihaz analiz için hazır olduğunda, sistem yazılımını numune dizisi parametrelerini kontrol edecek ve birden fazla numunenin otomatik enjeksiyonuna izin verecek şekilde ayarlayın. Örneği Çalıştır'ekranında, Dosya'yı tıklayın ve Yeni Örnek Seti Oluştur'u aşağı sürükleyin'Boş'u seçerek'yeni pencerede. Tüm standartları ve numuneleri, sıranın başında ve sonunda test edilen standartlar ile çalıştırılmaları gereken sırayla ayrı ayrı listeleyin.

İşlev sütununda, standartları ve numuneleri belirleyin ve programı her beş numune arasına su enjekte edecek şekilde ayarlayın. Her numune için çalışma süresini 15 dakikaya ayarlayın ve standartlardan 20 mikrolitre numune enjekte edin, ardından deneysel olarak uygun olduğu şekilde 20 mikrolitre plazma numunesi ve 30 mikrolitre beyin homojenat numunesi enjekte edin. Ardından, uyarma ve emisyon dalga boylarını ölçülen bileşiğe göre ayarlayın ve diziyi çalıştırın.

Verileri ölçmek için Projeye Gözat'ekranını açın ve Örnek Setler'sekmesi altında, nicelleştirilecek örnek setine çift tıklayın. Enjeksiyonlar listesinden tüm standartları vurgulayın ve yeni pencerede İşlem'i seçmek için sağ tıklayın. Ardından, seçmek için açılır menüyü kullanın Kalibre Et ve Nicelikle'Tüm standartları tekrar vurgulayın, sağ tıklayın ve Gözden Geçir'i seçin. Kromatogramlar açıldığında, standart eğriyi oluşturmak için her standardı entegre edin ve kalibre edin.

Ardından, Numune Setleri sekmesine dönün ve gösterildiği gibi ölçmek ve gözden geçirmek için numune setine çift tıklayın, önceden oluşturulan standart eğriye dayalı olarak her bir numunenin konsantrasyonunu çıkarmak için her bir numuneyi entegre edin ve nicelleştirin. Kinürenin uygulanan hayvanlardan toplanan doku örneklerinin HPLC analizi, yaklaşık altı dakikalık bir kinürenin tutma süresi ve yaklaşık 11 dakikalık bir kinürenik asit tutma süresi ortaya koymaktadır. Plazma kinürenin ve hipokampal kinürenik asidin miktar tayini, akut kinürenin enjeksiyonunun, enjeksiyondan iki saat sonra elde edilen ve enjeksiyondan dört saat sonra taban çizgisine geri dönen bir tepe noktası ile beyin kinürenik asit seviyelerini arttırdığını ortaya koymaktadır.

Pasif kaçınma paradigması eğitim denemeleri sırasında herhangi bir grup farklılığı gözlenmese de, kontrol hayvanları test denemeleri sırasında karanlık tarafa girme gecikmesinde önemli bir artış gösterirken, 24 saat önce kinürenin enjekte edilen hayvanlar gecikmede aynı artışı göstermez ve bu da öğrenmede bir eksiklik olduğunu gösterir. Ayrıca, ışık fazı sırasında akut kinürenin yükselmesinin uyku-uyanıklık mimarisi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi, kinürenin enjeksiyonundan sonraki ilk iki saat boyunca toplam hızlı göz hareketi uyku süresinde bir azalma olduğunu gösterir. Bu veriler, bu zaman dilimlerinde uyanma süresinde bir artış ve hızlı olmayan göz hareketi uykusunda hafif bir azalma ile yansıtılır ve akut kinürenin yükselmesinin de uyku-uyanıklık dinamiklerinde bozukluklara neden olduğunu gösterir.

Bu prosedürü takiben, biliş ve uykuyu modüle etmede yüksek kinürenik asit oluşumunun rolü hakkında ek soruları yanıtlamak için davranışsal analiz gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.