Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

Bu protokolün amacı, uç çerçeve N veya C terminal floresan etiketlerine kaynaşmış endojen füzyon proteinlerini eksprese eden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmektir. İstenilen vuruşu elde etmek için, CRISPR-Cas9 sistemini ve vahşi tip S.pyogenes Cas9 proteini ve sentetik iki parçalı CRSPR RNA ve tracrRNA kullanan ribonükleoprotein tabanlı bir yaklaşım kullanıyoruz. Bu RNP, elektroporasyon yoluyla bir donör plazmidi olarak istenen floresan etiket dizisi ile birlikte verilir.

Floresan etiketli proteini ifade eden varsayılan olarak düzenlenmiş hücreler, FACS ile zenginleştirilir. Daha sonra kesin düzenleme sonuçlarının analizi için klonal çizgiler oluşturulur. Bu gen düzenleme protokolü, geleneksel aşırı ekspresyon yapılarına göre birçok avantaja sahiptir.

Genoma bir floresan etiketi eklendiğinden, elde edilen füzyon proteininin hücre altı lokalizasyonu ve dinamikleri endojen düzenleyici kontrol altında incelenebilir. Burada indüklenmiş pluripotent kök hücreleri bir model sistem olarak kullanıyoruz çünkü bu, diploid transforme olmamış hücrelerdeki etiketli proteinleri incelememize izin veriyor. Ek olarak, hücreler burada gösterilen kardiyomiyosit hücreleri gibi birden fazla hücre tipine farklılaştırılabildiğinden, bu yaklaşım, çeşitli izojenik hücresel bağlamlarda etiketli proteinler oluşturma ve çalışma fırsatı sağlar.

Bununla birlikte, dikkatli bir optimizasyonla, bu protokol diğer memeli hücre tiplerinin genomlarını düzenlemek için uyarlanabilir. Merhaba, ben Amanda Haupt, Allen Hücre Bilimi Enstitüsü'ndeki kök hücreler ve gen düzenleme ekibinin bir parçasıyım. Bugün, endojen füzyon proteinlerini ifade eden 35'ten fazla farklı hücre hattı oluşturmak için bu yaklaşımı kullandık.

Bunları çok çeşitli benzersiz hücresel yapıları ve süreçleri incelemek için kullanıyoruz. Bu yaklaşım, grubumuzla bugüne kadar denenen lokusların %95'ine varan oranda başarılı olmuştur. Bu yöntem, canlı hücrelerdeki bir proteinin dinamiklerini daha iyi anlamakla ilgilenen hücre biyologları için özellikle yararlı olacaktır.

Bununla birlikte, düzenlenmiş klonal çizgiler bir kez oluşturulduktan sonra, çalışma olanakları sonsuzdur. Bu yöntemle, genomik dizilimde başka herhangi bir bozulma olmaksızın monoalelik floresan protein etiketlerine sahip klonları tutarlı bir şekilde tanımlayabiliyoruz. Ayrıca zaman zaman iki elik olarak düzenlenmiş klonlar da elde edebiliyoruz.

Bu videoda, endojen olarak düzenlenmiş floresan füzyon proteinlerini eksprese eden klonal hücre hatlarının transfekte edilmesi, FACS zenginleştirilmesi ve izole edilmesindeki bazı önemli adımları göstereceğiz. Transfeksiyondan iki ila üç saat önce, hiPSC'leri büyüme ortamına eklenmiş on mikromolar ROCK inhibitörü ile tedavi edin. Bu, elektroporasyondan sonra hayatta kalmayı teşvik edecektir.

Bu tedaviden sonra hücreler dikenli bir görünüme sahip olacaktır. Hücreler, tek bir hücre ayrışma bölgesi kullanılarak doku kapatma plakasından çıkarılmalı ve hücre süspansiyonu, transfeksiyondan önce konik bir tüpte toplanmalıdır. Transfekte edilecek her deneysel koşul için altı hücreye 1.84 çarpı 10'luk bir alikot hazırlayın.

1.5 millik bir tüpe 2.88 mikrolitre 10 mikromolar kılavuz RNA ve 2.88 mikrolitre 10 mikromolar Cas9 ekleyerek her transfeksiyon için ribonükleoprotein kompleks tüpleri hazırlayın. Oda sıcaklığında en az 10 dakika, en fazla bir saat inkübe edin. Önceki adımda hazırlanan hücre alikotunu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 211 kez G'de peletleyin.

Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 220 mikrolitre elektroporasyon tamponunda döndürmek için yarışın. Daha önce hazırlanmış olan 1.5 mil RNP kompleks tüpüne 220 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre ekleyin. Mikrolitre donör plazmidi başına 4.6 mikrolitre bir mikrogram ekleyin.

İki içeriği iki ila üç kez karıştırmak için nükleofeksiyon ucunu ve pipeti kullanın, ardından yüz mikrolitre süspansiyonu hazırlanan elektroporasyon cihazına aktarın. Uçta herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının. Otuz milisaniyelik bir darbe için bin üç yüz volt uygulayın.

Süspansiyonu, dönme hareketiyle altı kuyulu bir hazırlama plakasına yavaşça aktarın. Plakayı hafifçe yan yana ve önden arkaya hareket ettirerek hücreleri dağıtın. Tüm deneysel koşullar ve kontroller için tekrarladıktan sonra, transfekte edilmiş hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin ve ortamı 24 saatte ROCK inhibitörü olmadan normal büyüme ortamına değiştirin.

Ardından, hiPSC'leri 72 ila 96 saat boyunca her 24 saatte bir beslemeye devam edin ve birleşimlerini izleyin. hiPSC'ler %68 ila 80'e ulaştığında, FACS zenginleştirmesine geçin. Transfeksiyondan iki ila üç saat önce, FACS zenginleştirmesinden sonra sağkalımı desteklemek için büyüme ortamına eklenmiş 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile hiPSC'leri tedavi edin.

Hücreleri sıralamak için, tek hücre ayrışma reaktifini kullanarak bunları plakadan çıkarın, ardından hiPSC süspansiyonunu 35 mikron gözenekli filtreden polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün. Hücreleri, aşağıdakiler dahil olmak üzere ileri dağılım ve yan dağılım kullanarak sıralayın: yükseklik ve genişlik, üçlüler, döküntüler ve çiftler. FP pozitif kapısını, yalnızca tampon hücrelerinin %1.1'inden daha azı kapının içine girecek şekilde ayarlamak için yalnızca canlı tampon kontrol hücrelerini kullanın.

Kök hücreleri sıralarken, tartışma bölümünde önerildiği gibi hücre sağkalımını desteklemek için cihaz ayarlarını uyarlayın. FACS tarafından yüzde FP pozitif hücreler tarafından belirlenen tipik verimlilik vuruşu, %0,1 ila %5 arasında değişebilir Hücreleri, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 0,5 ila 2 mil oda sıcaklığında büyüme ortamı içeren 1,5 ila 15 mil polipropilen tüpe sıralayın. Toplanan hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 211 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 200 mikrolitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. Üç bine kadar çeşitli hücreyi, taze matrigel kaplı 96 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Sıralanmış hücreleri 37 santigrat derecede %5 CO2'de 24 saat inkübe edin ve ortamı 24 saatte 5 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş büyüme ortamına dönüştürün.

Daha sonra 48 saatte, hücreleri düzenli büyüme ortamını beslemeye devam edin, 72 ila 96 saat boyunca her 24 saatte bir ROCK inhibitörü yok. Hücreler 96 oyuklu plakadan geçecek kadar olgunlaştığında, bunları kademeli olarak daha büyük plakalara geçirmenizi öneririz. Örneğin, 96 kuyulu bir plakanın bir kuyusundan, bunları 24 oyuklu bir plakanın bir ila iki kuyusuna taşıyın.

Ve sonra oradan 6 kuyulu bir plakaya, vb., aşağı akış amaçları için yeterli hücreye sahip olana kadar. Genellikle en az üç ila dört milyon hücre. Cezalandırıcı olarak düzenlenmiş hücrelerin FACS ile zenginleştirilmiş popülasyonundan klonal çizgiler oluşturmak için, tek hücre süspansiyonuna geçin ve on bin hücreyi 10 santimetrelik bir plakaya yerleştirin ve kolonilerin beş ila yedi gün boyunca büyümesine izin verin.

Koloniler makroskopik olarak görünür olduklarında, izole edilebilecek kadar büyüktürler. Bir diseksiyon mikroskobunda, plaka yüzeyinden tek tek kolonileri nazikçe kazımak ve aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın. Koloniyi içeren hacmi 96 oyuklu plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın.

Tüm koloniler transfer edildikten sonra, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir doku kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca inkübe edin. Ortamı 24 saat sonra ROCK inhibitörü olmadan normal büyüme ortamına değiştirin. Ardından, koloniler yaklaşık üç katına çıkana kadar hücreleri her 24 saatte bir 72 ila 96 saat boyunca beslemeye devam edin.

Genomik DNA ekstraksiyonu için antalize etmek için kriyoprezervasyon yapmak için yeterli hücreye sahip olmak için hücrelerin 96 kuyulu plakada büyütülmesi ve geçirilmesi gerekecektir. Daha fazla ayrıntı için yazılı protokole bakın. 96 kuyulu plakadan geçmek için, medyayı ilk kolondan çıkarmak ve atmak için sekiz kanallı bir aspiratör kullanın.

P200 çok kanallı bir pipet kullanarak, hücreleri yıkamak için plakanın ilk sütununa yaklaşık 200 mikrolitre DPBS ekleyin. Sekiz kanallı bir aspiratör kullanarak, DPBS yıkamasını ilk kolondan çıkarın ve atın. Ardından ilk sütuna 40 mikrolitre ayrışma reaktifi ekleyin.

96 kuyulu plakanın toplam altı sütununa kadar her seferinde bir sütun çalışarak bu adımları tekrarlayın. Kirlenmiş kuyuları geçmediğinizden emin olmak için uçları değiştirin. Plakayı, ayrışma reaktifinin ilk sütuna eklendiği andan itibaren üç ila beş dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.

Plakanın ilk sütunundaki hücreler alttan kalkmaya başladığında, ilk sütuna 160 mikrolitre DPBS eklemek için bir P200 çok kanallı pipet kullanın ve hücreleri saat 12, saat 3, saat 6 ve 9 konumlarında nazikçe ezin. Hücre süspansiyonu ile tüm hacmi V-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. İçlerinde ayrışma reaktifi bulunan kalan sütunlar için bu adımları tekrarlayın, kuyucukları çapraz kontamine etmeyecek şekilde uçları değiştirin.

V-alt plakayı santrifüjde oda sıcaklığında üç dakika boyunca 385 kez G'de döndürün. 96 kuyu geçişi için bu noktaya kadar gösterilen alt, hücrelerin bu plaka formatında geçtiği her seferinde aynı şekilde gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreleri 96 kuyu formatında dondurarak saklamaya hazırsanız nasıl devam edeceğinizi göstereceğiz.

Daha fazla bilgi için yazılı protokole bakın. Önceki bölümde gösterilen santrifüjleme adımından sonra, süpernatanı bir P200 çok kanallı pipet kullanarak aspire edin ve ardından 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 60 mikrolitre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Tüm kuyucuklar için tekrarlayın, uçları çapraz kontamine olmayacak şekilde değiştirin.

30 mikrolitre hücre süspansiyonunu matrigel olmayan kaplı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın. Kalan 30 mikrolitre süspansiyonu bir kardeş plakaya aktarın, ardından karıştırmadan her bir oyuğa hızlı bir şekilde 170 mikrolitre dondurma tamponu ekleyin. Bu işlemin çift kardeş plakalarda yapıldığına dikkat edin, böylece tek tek plakalardan biri çözüldükten sonra yedek bir hücre popülasyonu var olur.

Dondurularak saklanmış hücrelerin 96 oyuklu plakanın yalnızca diğer her sütununa yerleştirilmesi, daha hızlı çözülmeye olanak tanır. Plakayı parafilm ile sarın ve oda sıcaklığında kapaklı strafor kutuya yerleştirin. Tüm kutuyu eksi 80 derece santigrat dondurucuya yerleştirin.

24 saat sonra plakalar strafor kutusundan dışarı aktarılabilir ve dört haftaya kadar eksi 86 santigrat derecede sıralanabilir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin 96 oyuklu formatta dondurularak saklanması, hücre kültüründe zamansal bir kırılmaya izin verir. Araştırmacı, gelecekteki çalışmalar için çözülmesi için genetik olarak arzu edilen klonları belirlemek için klonal madenler üzerinde genomik doğrulama testleri yapabilir.

WTC hiPSC hattının hedefe özgü bir kılavuz RNA Cas9 proteini ve dikkatlice tasarlanmış bir donör şablon plazmidi ile transfekte edilmesinden dört gün sonra, hücrelerin %0.95'inin GFP eksprese ettiği gözlendi. FACS, tüm GFP pozitif hücreleri zenginleştirilmiş bir popülasyon olarak ayırmak için kullanıldı. Ön mikroskopi çalışmaları, mEGFP nükleer lamin B1 füzyon proteininin nükleer zarfa beklenen lokalizasyonunu ortaya koydu.

Floresan olarak işaretlenmiş protein, değişen yoğunluklarda hücrelerin yaklaşık% 95'inde gözlendi. Klonal hat üretiminden sonra, tek tip mEGFP yoğunluğuna sahip klonlar elde edildi ve hassas düzenleme için daha fazla analiz edildi. Sonuç olarak, endojen olarak düzenlenmiş floresan füzyon proteinlerinin ekspresyonu için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin gen düzenlemesi için bir transfeksiyon yöntemi gösterdik.

Tipik vuruntu verimsizlikleri düşük olduğundan, burada gösterilen FACS yöntemi gibi bazı zenginleştirme stratejileri, füzyon proteinini eksprese eden varsayılan olarak düzenlenmiş hücrelerden oluşan bir popülasyonla sonuçlanır. Zenginleştirilmiş popülasyon biyolojik çalışmalar için kullanılabilir veya bu yöntemde tarif edildiği gibi klonal hatlar oluşturulabilir, bu da tam olarak gen düzenlenmiş hücre hatlarının tanımlanmasını mümkün kılar. Genomdaki Cas9'un neden olduğu çift iplikçik kırılmalarının, etiketin amaçlanan lokusa dahil edilmesine rağmen, genellikle kesin olmayan bir şekilde onarıldığını hatırlamak önemlidir.

Ek olarak, monoalelik olarak düzenlenmiş klonlarda, etiketlenmemiş alel sıklıkla, büyük olasılıkla homolog olmayan uç birleştirme onarımının neden olduğu indelleri içerir. Bu bulgular, yalnızca klonal hücre dizilerinin genomunun analizi ile ortaya çıkan bir CRISPR Cas9 vuruşundan sonra genetik doğrulamanın önemini vurgulamaktadır. Beklenen füzyon proteininin ekspresyonu tek başına hassas düzenlemeyi garanti etmez.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri düzenlemek için bu protokolü kullanırken, optimal hücre sağkalımı ve minimal spontan farklılaşma için hücrelerin nazik bir şekilde ele alınmasını sağlamak için yazılı protokolde ayrıntılı olarak açıklanan tavsiyelere uymaya özen gösterin. Bu videonun ve ilgili protokol ve materyal listesinin, en sevdiğiniz protein üzerinde kendi laboratuvarınızda benzer deneyler yapmanıza yardımcı olacağını umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkürler.