Name: Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, MinD ve MinE proteinlerinin desteklenen lipid çift katmanları üzerinde kendi kendini düzenleme davranışlarını incelemek için geliştirilen bu yöntemi. PDMS mikro bölmeler kullanılarak geometrik kısıtlamaların protein deseni oluşumuna etkisi detaylıca analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Michael Heymann teşekkür ediyoruz ve Frank Siedler üretiminin silikon gofret, çekirdek tesis MPI-B için protein saflaştırma ve Simon Kretschmer yardım ve Leon Harrington el yazması üzerine yorumlar için.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz bir protokol MinCDE kendi kendine organizasyon üzerinde düzlemsel vitro sulandırma lipid bilayers desteklenen ve lipid içinde 3D yapılar, bilayer kaplı çubuk şeklinde PDMS microstructures örneği kullanarak anlatmıştık. Bu deneyleri değerli verilerini elde etmek için protein ve membran kalite kontrolü için en önemli faktörler bulunmaktadır.
Protein, protein bir kalite için kitle-var doğruladı SDS-sayfa ve kütle spektrometresi kullanılarak. Ayrıca, bu proteinler analitik jel filtrasyon veya dinamik ışık saçılma kullanarak çözünür ve değil toplanmış olduğunu doğrulanması gerekir. Jel filtrasyon proteinler toplanan herhangi bir kısmını kaldırmak için kullanılabilir. Dikkatli pH ayarlama ve eklenen nükleotit kalitesi kritik, Sigara ayarlanacağını veya kısmen bozulmuş nükleotit protein ek olarak hisse senedi veya kendiliğinden organize deneyleri protein etkinlik, bu nedenle kaldırılması ortadan kaldırmak için yeterli kendi kendine organizasyon.
Protein kalite, yanındaki membran kalite en kritik ve uygunsuz membran oluşumu en sık arızalı kendi kendine organizasyon ve artefactual yüzey yapıların kökeni için nedenidir.
Protokolü ilk kez gerçekleştirilirken, sınav-655-uyuşturucu veya dıı gibi etiketli lipidler düşük molar oranlarda (% 0.05) dahil olmak üzere tarafından desteklenen lipid bilayers etiket yararlıdır. Böylece özellikleri ve membran kalitesini doğrudan karar olabilir. Sıkı bağlamak kullanarak, membran akışkanlık tespit edilebilir. Bu yıkanmış Eğer orada da çok fazla veziküller, hiçbir sıvı membran veya hiçbir membran, olacak gibi Ayrıca, bir doğrudan SLB, yıkama kalitesini değerlendirir. Titizlikle membran, yıkamak için açık odası yaklaşım sağlar ve bu nedenle de SLB yüzeye yapışmasını veziküller kaldırmak için. Temizlik ve hydrophilicity destek yüzeyi ve doğru boyut ve SUvs polimerlerin bilayers olan sıvı ve homojen desteklenen lipid elde etmek için en önemli faktörler SUV boyutu ve boyut dağılımı kullanarak kontrol etmek yardımcı olabilir dinamik ışık saçılma. Dar boyutu dağıtımları için onları sonicating yerine veziküller yükseltme öneririz. Temizlik coverslips, Örneğin, tedavi güçlü bazlar, temel deterjanlar veya doğrudan su ile durulama sonra coverslips kullanarak diğer yöntemleri iyi, uygulama ve lipid karışımı bağlı olarak sonuçlar verebilir.
Burada, vitro sulandırma düzlemsel desteklenen lipid bilayers açık odalarında, üzerinde sunulan Protokolü ilk yarısında yüzey optik microscopies, TIRF mikroskobu gibi30, sıkı bağlamak için erişilebilir oluşturma avantajına sahiptir analiz6, tek-parçacık34yanı sıra atomik kuvvet mikroskobu26gibi yüzey araştırma teknikleri izleme. Büyük homojen alan tanımlı konsantrasyonlarda daha iyi istatistikleri sağlar. Ayrıca açık odası yaklaşım tam olarak protein konsantrasyonu ve bir hızlı ve basit ek bileşenlerinin dolayısıyla protein konsantrasyonu tek odası20titre için izin daha fazla kontrol sağlar. Tahlil FtsZ22,35, ZipA22 veya chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35gibi diğer bakteriyel divisome bileşenler tarafından genişletilebilir.
Diğer gruplar Min sistem vitro, ama kullanımı akış hücre yerine bir açık odası17,18,19başlamaktan için benzer bir yaklaşım almıştır. Akış-hücreleri belirli avantajları, özellikle gerekli18, akış17,19,23 etkisi tamamen kapalı bir 3D çevre veya membran kompozisyon23 MinCDE desenleri olduğunda var araştırdık, ya da koşullar19sınırlama protein altında uyması gereken protein desenler vardır. Yine de, yerel moleküler konsantrasyonları kontrolünü daha zordur. Protein bileşenleri, özellikle zihin, güçlü membran için bağlama karşılaştıkları ilk18,19. Deneyim, proteinler sık non-spesifik bağlama boru, giriş, şırınga ve diğer mikrosıvısal parçalar için sergi. Bu nedenle, yerel protein konsantrasyonları ve giriş konsantrasyonları18 farklı de akışı hücre gibi başkaları tarafından19farklı protein kalıpları arasındaki giriş ve çıkış, zar üzerinde çeşitli sonuçlanan, uzunluğu değişir.
Protokol yarısı burada, çubuk şeklinde microstructures lipid tarafından örtülü bir desenli desteği üzerinde açık odası yaklaşımı yeniden kullanarak vitro rekonstitüsyon sunulan ikinci bilayers sağlar vivo içinde protein davranış basit bir taklit için protein konsantrasyonları üzerinde kesin denetim arabellek kaldırma nedeniyle kayıp olmasına rağmen. Dalga boyu fayans bir büyüklük sırasında olduğundan daha büyük vitro vivo içinde daha çubuk şeklinde microcompartments vardır bir büyüklük daha büyük (10 x 30 µm) bir çubuk şeklinde E. coli daha hakkında da hücre olduğunu unutmayın.
Genel olarak, bu iletişim kuralı protein konsantrasyonu, arabellek oluşturma ve membran özellikleri dahil olmak üzere tüm koşullar hassas kontrol için izin verir. 3D yapılandırılmış destekler kullanımı kayma hapsi, in vivo davranış karmaşık Havacilik ekipman için gerek kalmadan taklit altında incelenecektir tepki sağlar.

Zamanmekansal desenleri doğada çok hücreli ve hücresel düzeyde, morfogenez düzenlenmiş hücre bölünmesi1,2üzerinden her iki karmaşık görevleri düzenleyen temel alır. Tepki-difüzyon sistemleri bu kalıpları kurulmasında önemli bir rol oynamaktadır, ama hala iyi anlaşılır. Başlıca örneklerinden bir tepki-difüzyon ve en iyi karakterize biyolojik sistemleri defa Escherichia coli MinCDE sistem3,4,5,6,7biridir. MinCDE sistemi gelecek bölümü site olarak hücre ortasına belirlemek için E. coli Kutbunda hücre için hücre Kutbu'ndan olsun. Bu sistem ATPaz zihin, benim ve kayma tepki matris8olarak membran protein aktive ATPaz dayanmaktadır. MinC desen oluşumu mekanizmasının bir parçası değil, ama gerçek fonksiyonel aracı: bir inhibitörü ana divisome protein FtsZ5,6. MinC akla bağlar ve bu nedenle salınım hücre kutuplarda maksimal ve hücrenin ortasında, en az bir saat ortalama olarak protein konsantrasyonu degrade sonuçlanan sadece FtsZ midcell9,10 polimerize izin izler . MinCDE sistem bakteri2, kronolojik zamanmekansal kuruluşta hücre düzenleme ve konumlandırma ve protein kompleksleri11 ve plazmidlerin12 taşınması için anahtarıdır Walker A ATPases daha büyük ailesinin bir parçasıdır bölümü13 kromozom segregasyon ve14. Dolayısıyla, MinCDE tepki-difüzyon sistem sadece bir arketipik tepki-difüzyon sistemini temsil eder, ama aynı zamanda bakteri kronolojik zamanmekansal kuruluşta için önemi nedeniyle dikkat çekti.
Genellikle protein ve gen silme manipülasyon sonucu olarak hücre bölünmesi kusur MinCDE sistemi içinde vivo detaylı fonksiyonel çalışmaları karmaşıktır. Ayrıca, membran kompozisyon veya sitozol in vivo özelliklerinin çok zorlu değişiyor15,16. Sistem ve faktörler etkileyen değişiklikler içinde önemli bir işlevi hücre bölünmesi olarak rahatsız ettiysem cep karmaşık ortamı içinde daha çok yorumlamak zordur. Biz ve diğerleri bu nedenle bir vitro sulandırma yaklaşım, sistemin çekirdek bileşenlerinin azaltarak çevirdiler: zihin, benim, bir enerji kaynağı olarak ATP ve desteklenen lipid bilayer bir reaksiyon matris6,17, olarak 18. bir yaşam hücrenin ayrıntılı Karmaşıklık olmadan kendi kendine organizasyon mekanizmasının soruşturma için bu tabandan tavana bir yaklaşım sağlar. Genellikle bir büyüklük vivo içindebüyük hakkında böyle bir dalga boyu ile de olsa yüzey seyahat proteinler formu6 ve desenler17,19 bu koşullar altında diğer tür dalgalar. Desen oluşumu etkileyen tüm yönleri üzerinde tam denetim bir açık odası kullanımı kolaylaştırır: protein konsantrasyonları6, protein özellikleri20, membran kompozisyon10, arabellek oluşturma ve ATP konsantrasyonu 6yanı sıra ajanlar21 ve diğer divisome proteinler22kalabalık gibi diğer faktörler eklenmesi. Buna karşılık, bir akış hücreli18,19,23 MinCDE sisteminde vitro sulandırma akışı17,23, protein etkisini araştırmak için kullanılabilir Sınırlayıcı koşullar19, membran kompozisyon19 ve tam 3D doğumdan18 protein desenleri, ama tam bir denetim protein/bileşen konsantrasyon ve sıralı bileşen ek çok daha karmaşık işler.
Bu açık odası kullanarak, aynı zamanda hangi tarafından bir nasıl geometrik sınırları etkisi desen oluşumu21, son zamanlarda bir fenomen sonda düzlemsel lipid bilayers destek desenli de incelenen vivo içinde bakteri kullanarak microstructures7kalıplanmış. Ayrıca benim nasıl tanımlanmış mutasyonların araştırmak için bu tahlil etkiler desen oluşumu sistem20çalıştırmaya başladık. Ayrıca, aynı temel tahlil biçimi nasıl desen oluşumu bir azobenzene-çapraz mayın peptid tahlil içine tanıtımı ve TIRF mikroskobu24ile düşsel ışık tarafından kontrol edilebilir araştırmak için istihdam edilmiştir.
Fayans modeli çoğaltmak için oluşumu vivo vitro sistem, doğumdan anahtardı gözlenen, bulduk. Desteklenen lipid bilayer ile kaplı büyük dalga boyu fayans vitro (10 x 30 µm) için ayarlanmış boyutları ile microcompartments, çubuk şeklinde kullanarak sulandırma fayans pole pole salınımlar ve protein degrade oluşumu izin 10,25. Bu tahlil desteklenen lipid bilayers üstündeki açık kalan çubuk şeklinde microcompartments birkaç yüz çoğaltmalarını içerir desenli PDMS substrat üzerine yatırılır. Bu, açık bir odasında tepki ayarlanabilir ve daha sonra arabellek microcompartments, böylece küçük bir birim için tepki hapsetmesi RIM için indirilir. Olsa bile bu bölmeleri bir tarafta bir hava-tampon arabirimi ve bu nedenle bir tam 3D doğumdan membran tarafından temsil etmemektedir, protein dynamics in vivo salınımlarını10,25taklit. Tam 3D hapsi için karşılaştırıldığında, çok benzer gösteren18sonuçlar, açık microstructures tahlil nispeten basit ve kolay işlemek ve özel Havacilik ekipman ile donatılmış değil laboratuvarlar tarafından da gerçekleştirilebilir ve Temiz Oda imkanları.
Burada, MinCDE desen oluşumu için tüm bileşenleri ve kolay erişim denetimi tarafından optik mikroskobu ve minor ile sağlar bir açık odası kullanarak lipid bilayers vitro desteklenen başlamaktan için deneysel bir protokol mevcut değişiklikler, aynı zamanda yüzey-soruşturma teknikleri26için adapte olduğunu. Düzlemsel desteklenen lipid bilayers yanında, biz de ne kadar protein hapsi olabilir göstermek basit desenli desteklenen lipid bilayers PDMS microstructures çubuk şeklinde kullanarak elde. Bu deneyleri MinCDE sistemi için en iyi duruma getirilmiş olsa da ayrıca FtsZ27 veya en az aktin korteks28gibi membran ile benzer bir şekilde etkileşim diğer protein sistemlerine aktarılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid özü</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 & prime; - trifosfat disodyum tuzu trihidrat</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 ve asal; - difosfat monopotasyum tuzu dihidrat</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Etilen Diamin Tetraasetat</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik Asit %98</td> <td>Uygulama</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit %50</td> <td>Uygulama</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Gliserol %86</td> <td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB orta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaroz</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS tabanı</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS çapraz bağlayıcı</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Tutkal</td><td>Norland Ürünleri</td><td>6801</td> <td># 68 ve # 63 her ikisi de iyi çalışıyor</td></tr><tr><td>Lameller # 1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl & auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamel #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>sadece PDMS mikroyapıları için kullanılır</td></tr><tr><td>0.5 ml reaksiyon tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>0030123301</tr><tr><td>kültür şişesi 2L</td><td>Corning,</td><td>örneğin 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jelfiltrasyon kolonu: HiLoad Superdex 75 PG veya 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG tuzdan arındırma kolonu önceden paketlenmiş kolon</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>diyaliz cihazı: Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL veya 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 veya 66330</td><td></td></tr><tr><td>tıraş bıçağı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultra saf su: Milli-Q Tip 1 Ultra Saf Su Sistemleri</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>otomatik protein arıtma sistemi: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>banyo sonikatörü</td><td>Branson,</td><td></td><td>örneğin Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mikser</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici Zepto</td><td>Diener elektronik</td><td></td><td>kullanım proses gazı olarak oksijen</td></tr><tr><td>pozitif deplasmanlı pipetler</td><td>Cam</td><td>uçlu</td><td></td></tr> <tr><td>Marka Transferpettor modelleriLSM780 konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 suya daldırma objektifi ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Hücresel ve Moleküler Biyofizik Anabilim Dalı, Biyokimya MPI, Prof. Schwille</td><td></td><td>plazmid, verimi artırmak için His-MinD ve etiketsiz MinE'yi kodluyor</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Hücresel ve Moleküler Biyofizik Anabilim Dalı, Biyokimya MPI, Prof. Schwille</td><td></td><td>plazmid kodlama His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Hücresel ve Moleküler Biyofizik Anabilim Dalı, Biyokimya MPI, Prof. Schwille</td><td></td><td>plazmid kodlaması His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Hücresel ve Moleküler Biyofizik Anabilim Dalı, MPI Biyokimya, Prof. Schwille</td><td></td><td>plazmit kodlaması His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Hücresel ve Moleküler Biyofizik Anabilim Dalı, Biyokimya MPI, Prof. Schwille</td><td></td><td>His-MinC kodlaması plazmid</td></tr></tbody></table>

vitro sulandırma protein kalıpları üzerinde desteklenen lipid bilayers kendi kendini düzenleme

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Hücreleri temel kronolojik zamanmekansal organizasyonu, bir çok yönünü tepki-difüzyon türü sistemleri tarafından yönetilir. Vitro sulandırma böyle sistemleri sağlar mümkün olmaz onların temel mekanizmaları ayrıntılı çalışmalar için içinde vivo. Burada, hangi hücrenin ortasında hücre bölünmesi septum konumlandırır Escherichia coli, MinCDE sisteminin vitro sulandırma için bir protokol sağlar. Tahlil sadece kendi kendine organizasyon için gereken bileşenleri yani bir membran iki protein zihin ve maden ve enerji ATP şeklinde sağlamak için tasarlanmıştır. Bu nedenle bir açık tepki odası üzerinde desteklenen lipid bilayer kuruldu bir coverslip imal. Açık tasarım odasının lipid bilayer en uygun hazırlanması ve toplu içerik kontrollü manipülasyon sağlar. İki protein, zihin ve benim yanı sıra ATP, sonra membran üzerinde toplu cilt içine eklenir. Görüntüleme TIRF mikroskobu hem ve tasarım destekler confocal, geniş alanlı olarak birçok optik microscopies mümkündür. Protokol bir varyasyon lipid bilayer desenli bir desteğinde PDMS microstructures hücre şeklinde cam yerine üzerinde oluşturulur. Bu bölmeler kenarında toplu çözüm düşürücü tepki daha küçük bir kompartımanda içine alır ve in vivo salınım davranışını taklit izin sınırları sağlar. Birlikte ele alındığında, biz MinCDE sistemi ile ve kayma hapsi, olmadan reconstitute için protokolleri araştırmacılar tam konsantrasyon aralıkları ve diğer faktörler eklenmesi gibi desen oluşumu etkileyen tüm özelliklerini yönetmeniz için izin tarif ya da proteinler ve sistematik olarak nispeten basit deneysel ayarı sistem karmaşıklığı artırmak için.

Bizim protokol sonrası protein saflaştırma Min proteinler yeterli saflık verim. Bir referans olarak, zihin, zihin, benim ve MinC fluorescently etiketli SDS-sayfa görüntüsünü resim 1 sağlar. Fayans kendi kendine organizasyon tahlil desteklenen lipid sigara desenli bilayers üzerinde gerçekleştirmek için yordam tek tek adımları Şekil 2' de açıklanmıştır. Bu iletişim kuralını kullanan, düzenli fayans yüzey dalgaları seyahat odası (Şekil 3) görülebilir. Dalga boyunu biraz odası içinde değişir, ancak genel olarak desen benzer. (Bkz. Şekil 3 c) UV tutkal formunda cama daha farklı özellikleri var gibi membran yüzey gibi odası kenarlarını nicel karşılaştırmalar için kullanılmamalıdır. Seyahat yüzey dalgaları yayılma yönünde (Şekil 3B) boyunca yoğunluk komplo tarafından çözümlenebilir. Floresans yaylalar oldukça hızlı öncü--dan belgili tanımlık sallamak ve keskin firar kenarında azalır unutmayın, maden floresans zihin dalga başından beri hemen hemen doğrusal olarak artar ve onun en büyük zihin sonra firar kenarında eriştiği nerede o belirgin6düşüyor.
Protein kalitesi yanında, desteklenen lipid bilayers kalitesini en MinCDE bir düzenli kendi kendine organizasyon için önemlidir. Bir yandan membran çok aşırı derecede yıkanır veya temel yüzey temizlenir ve böylece güçlü kullanılıyorsa, membran içinde delikler oluşabilir (Şekil 6A, üst). Öte yandan membran düzgün yıkanmış değil veya temel yüzey temizliği/hydrophilized değil, veziküller membran için sopa veya membran akışkanlık tehlikeye girer (Şekil 6A, alt). Düz-se bile değil gibi belirgin gibi membran etiketli lipidler üzerinden doğrudan gözlem zaman, bu sorunların da zihin floresans sinyalini gibi desenleri değil düzenli ve floresan maxima içinde homojen değil ama "delik" içerir tespit edilebilir veya parlak noktalar Şekil 6Aorta masası gösterildiği gibi.
Çubuk şeklinde PDMS microstructures içinde fayans kendi kendine organizasyon için yordamı Şekil 4' te özetlenmiştir. Proteinler ve yağlar yeniden kullanılabilir gibi düzenli olarak yapılmasını planlamıştı, birkaç protokol adımları uygulamanız gerekmez. Sigara desenli yüzeyler üzerinde yüzey temizlenir ve (plazma temizleme tarafından) hydrophilized, desteklenen lipid bilayer PDMS üzerinde oluşturulur ve kendi kendine organizasyon tahlil 200 µL hacmindeki kurmak gibi. Uygun bir membran oluşturmuştur ve fayans membran üzerinde kendi kendini düzenler denetlemek için odaları görüntüsü. Uygun bir membran yüzey dalgaları arasında bireysel microstructures PDMS yüzeyinde düzenli seyahat fayans formlar oluşturulmuştur ve dalgalar serbestçe mümkün olduğunca da microstructures alt kısmında kendi kendine organize zaman tüm hareket membran kaplı yüzey (Şekil 5A). Tamamen kuru olmalıdır arabellek kaldırıldıktan sonra yüzey bölmeleri arasında herhangi bir yayılıyor fayans modelleri (5B rakam), gösterecektir değil. Fayans modelleri hala hareket ediyor, daha fazla arabellek kaldırılması gerekiyor. Proteinler şimdi çubuk şeklinde microcompartments membran kaplı PDMS ve hava üst arabirimde hangi onlar kendi kendine organize edecek (Şekil 5C) tarafından sınırlı. Bu koşullar altında iki protein Şekil 5 diçinde gösterildiği gibi kutup kutup salınım gerçekleştirebilir. Bir kısmını zihin ve benim her zaman membran bağlı olduğu gibi Ayrıca arabellek kaldırma sırasında arabellek çıkarıldıktan sonra konsantrasyonları konsantrasyonları giriş için karşılaştırılabilir değildir. Arabellek kaldırma önce desen konumunu bağlı olarak bu etkisi nedeniyle konsantrasyonları arasındaki bireysel microstructures aynı coverslip üzerinde de değişir. Silikon Gofret üretim veya PDMS kalıplama silikon gofret üzerinden analiz (Şekil 6B) için kullanılamaz eksik microstructures neden olabilir. Ayrıca, arabellek nedeniyle kaldırma microstructures işlemi sırasında kuru ve bu nedenle, daha fazla çözümleme (Şekil 6B) tutulmalıdır. Sonuç olarak microstructures bir odasında sadece bir kısmını istenen pole pole salınımlar gösterir. Microstructures protein dinamiklerini analiz etmek için bir kymograph tüm yapısı (Şekil 5E) üzerinde bir seçim çizerek elde edilebilir. MinCDE salınım pole pole, MinC ve zihin zaman ortalama bir konsantrasyon gradyan yuvası kutuplarda maksimum konsantrasyon ve en az konsantrasyon ile bölme (Şekil 5F) ortasında gösterecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Şekil 1: SDS-sayfa protein purifications nihai ürünler gösteriliyor. O'nun-zihin (33.3 kDa), O'nun-eGFP-US (60.1 kDa), O'nun-mRuby3-US (59.9 kDa), O'nun-MinE (13,9 kDa) ve O'nun MinC (28,3 kDa) sırada gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Şekil 2: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama üzerinde desteklenen lipid sigara desenli bilayers (adım 1-6) kendi kendine bir organizasyon için protokolün. Kesikli kutuları şu iki seçenekten birini temizlemek için kullanılabilir gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Şekil 3: fayans tahlil tarafından confocal mikroskobu Imaging. A) düzenli Min sarmal, hangi dalga yayılma hızı, yoğunluk arsa ve hız ölçümleri elde edilebilir. Kullanılan konsantrasyonları: 0.6 µM, zihin (% 30 eGFP-MinD) 1.8 O'nun µM madeni (% 30 O'nun-maden-Alexa647) B) örnek normalleştirilmiş yoğunluğu Arsa bölge için işaretlenmiş A'ya C) tüm tahlil odası genel bakış (ölçek çubuğu: 1 mm, olarak aynı protein konsantrasyonları yukarıda). Her iki yönde de hedef desenler görülebilir dönüm spiraller. Büyütülmüş bölgesi nasıl dalga kalıpları UV uyuşmuşhalde farklılık gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Şekil 4: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama çubuk şeklinde microstructures (adım 1-5, 7, 8) içinde kendi kendine organizasyon için protokolün. Gri kutuları nereye ürünleri yeniden kullanılabilir merdivenlerinde protokolü üzerinden desteklenen lipid sigara desenli bilayers gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Şekil 5: fayans için temsil edici sonuçlar desen çubuk şeklinde PDMS microcompartments oluşumu. A) fayans kendi kendine organize yüzey dalgaları seyahat oluşturan PDMS yüzeyinde (1 µM MinD (% 30 EGFP-zihin), 2 µM benim ve 2.5 mM ATP). B) sonra arabellek microstructures yüksekliğe indirilir, protein kendi kendine organizasyon düzlemsel yüzey microcompartments arasında durur. C) şematik bir çubuk şeklinde microcompartment. D) fayans pole pole salınımlarını arabellek çıkarıldıktan sonra temsilcisi görüntüler. E) D içinde gösterilen vurgulanan hattı boyunca titreşimler Kymograph). F) görüntü ve profil-serisi D içinde gösterildiği zaman ortalama floresans yoğunluk) açıkça maksimal microcompartment Polonyalılar ve bölme orta, en az protein degrade gösterilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Şekil 6: negatif deneysel sonuçlar örnekleri. A) aşırı yıkanmış membranlar birikir delik, suboptimal. sivilce ürünleri ve lipit kompozisyonları veziküller yapışmasını için kurşun iken. İki merkezi panelleri sorunları ve nasıl onlar Min salınımlarını gözlemleyerek zaman görünür hale gelir bir arada göstermek. Membranlar ile % 0.05 etiketli Atto655-DOPE. (ölçek çubukları: 50 µm) B) üst panel: kurudu microcompartments çok fazla arabellek kaldırma veya arabellek zaman içinde buharlaşır neden olabilir. Alt paneli: eksik bölmeleri Gofret üretim veya PDMS döküm sırasında oluşmuş. (ölçek çubukları: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1: Plazmid harita onun zihin için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2: Plazmid harita His-EGFP-US için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 3: Plazmid harita His-mRuby3-US için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 4: Plazmid harita benim onun için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 5: Plazmid harita MinC onun için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 6: Microcompartments çubuk şeklinde silikon gofret için CAD dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Bu yöntem, hücrenin organizasyonu ve zarları hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, geometrik ipuçlarının süreçte oynadığı rol. Bu tekniğin temel avantajı, protein konsantrasyonları gibi patern oluşumunu etkileyen tüm yönler üzerinde hassas kontrole izin vermesidir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi çok katmanlı veziküller oluşturun.Şimdi, lipitleri yedi ila 10 döngü boyunca dondurarak çözün, önce sıcak bir plaka üzerinde 70 ila 99 santigrat derecede su içeren bir beher ve ayrıca sıvı nitrojen tutan bir kap hazırlayın. Azot kaynamayı durdurana kadar şişeyi büyük cımbızla sıvı nitrojen içinde tutun. Ardından, çözelti tamamen çözülene kadar şişeyi sıcak suya aktarın.Karışıma bağlı olarak, lipit karışımı göze net görünene kadar bu adımları tekrarlayın. Ardından, bir lipit ekstrüder monte edin ve sistemi Min tamponu ile önceden durulayın. Lipid karışımını 50 nanometre gözenek boyutuna sahip bir zardan 35 ila 41 kez ekstrüde edin.Zarı hiç geçmeyen agregalardan kaçınmak için tek sayıda geçişle bitirdiğinizden emin olun. Cam lamelleri ters çevrilmiş bir cam Petri kabına veya başka bir inert yüzeye dağıtın. Bir cam pipetle, her lamellerin ortasına yedi damla konsantre sülfürik asit ekleyin.Daha sonra asit damlalarının ortasına iki damla% 50 hidrojen peroksit ekleyin. Reaksiyonu örtün ve en az 45 dakika inkübe edin. Şimdi, lamelleri cımbız kullanarak tek tek alın ve asidi ultra saf suyla durulayın.Yıkanmış lamelleri yapışmaz tutuculara veya benzeri bir taşıma cihazına yerleştirin. Şimdi her bir lamel ultra saf su ile yoğun bir şekilde durulayın ve yüzeyi basınçlı gazla kurulayın. Lamelin temiz tarafını kalıcı kalemle işaretleyin.Hazneyi monte etmek için önce kapağı ve 0,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünün konik kısmını keskin bir makasla kesin ve atın. Ardından tüpün üst kenarına UV yapıştırıcısı sürün ve bir pipet ucu kullanarak yapıştırıcıyı eşit şekilde dağıtın. Tüpü lamel temiz tarafına baş aşağı yapıştırın.Son olarak, 360 nanometrelik bir lamba veya LED'in altına beş ila 15 dakika boyunca birden fazla oda yerleştirerek UV yapıştırıcısını sertleştirin. Desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için, bir ısı bloğunu 37 santigrat dereceye ısıtın ve iki mililitrelik reaksiyon tüpünü hazne başına bir tüpte Min veya SLB tamponu ile inkübe edin. UV kürleme ve montajı sırasında çökelmiş olabilecek toz veya diğer parçacıkları temizlemek için monte edilmiş ve kürlenmiş odalara nitrojen üfleyin.Ardından, odaları ısı bloğunun üzerine yerleştirin. 20 mikrolitrelik berrak lipitleri 130 mikrolitre Min tampon ile seyreltin ve mililitre başına 0.53 miligramlık bir çalışma konsantrasyonu oluşturun. Her hazneye 75 mikrolitre lipit karışımı ekleyin.Şimdi, bir zamanlayıcıyı üç dakikaya ayarlayın. Kuluçka süresi boyunca, veziküller hidrofilik cam yüzeyde patlar ve tutarlı bir SLB oluşturmak için birleşir. 60 saniye geçtikten sonra, her odaya 150 mikrolitre Min tampon ekleyin.Kalan 120 saniyeden sonra, her bir hazneyi 200 mikrolitre Min veya SLB tamponu ekleyerek, birkaç kez dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek, çıkarıp 200 mikrolitre daha ekleyerek yıkayın. Her hazne bir kez yıkandıktan sonra, iki mililitre tampon bitene kadar ilk hazneyi iyice yıkamaya devam edin. Desteklenen lipit çift katmanlarının yıkanması, haznedeki hareketlerin kapsamını mükemmelleştirmek ve doğru yıkama yoğunluğunu bulmak için biraz deneyim gerektirir.Desenli silikon gofretlerden PDMS mikro yapıları üretmek için önce 10 gram PDMS tabanı ve bir gram PDMS çapraz bağlayıcı ağırlığında plastik bir kap kullanın. PDMS karışımını karıştırmak ve gazını almak için bir karıştırma cihazı kullanın. Şimdi, az miktarda PDMS'yi doğrudan silikon gofret üzerindeki yapıya bırakmak için bir pipet ucu kullanın.Hemen PDMS damlasına 1 lamel yerleştirin ve lameli silikon gofret üzerine hafifçe bastırmak için temiz bir pipet ucunun üst ucunu alın. PDMS, lamel ve silikon gofret arasında ince bir şekilde yayılmalıdır. Gofretleri lamellerle birlikte bir fırına koyun ve PDMS'yi üç ila dört saat veya gece boyunca 75 santigrat derecede kürleyin.Ardından, gofreti fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Bir tıraş bıçağıyla, takılı PDMS ile lameli silikon gofretten dikkatlice çıkarın. Şimdi, cam için daha önce açıklandığı gibi PDMS'ye plastik bir hazne takın.Lamelleri ekli hazne ile alın ve proses gazı olarak oksijenli plazma temizleyiciye yerleştirin. Lamelleri plazma ile temizleyin. Bu çalışmada bir dakika boyunca %30 güç ve 0.3 milibar oksijen basıncı kullanılmıştır.Şimdi, daha önce cam üzerinde anlatıldığı gibi haznede bir SLB hazırlayın. Kendi kendine organizasyon testini gerçekleştirmek için, odadaki tampon hacmini, eksi protein ve ATP çözeltisi miktarı düşüldükten sonra 200 mikrolitre Min tampona ayarlayın. Ardından MinD, MinE etiketli MinD ve istenirse MinC ekleyin ve bileşenleri pipetleyerek hafifçe karıştırın.Şimdi, MinDE'nin kendi kendine organizasyonunu başlatmak için 2.5 milimolar ATP ekleyin. Önümüzdeki 10 ila 30 dakika boyunca, bir floresan mikroskobu üzerinde düzenli MinDE desen oluşumunu ve uygun şekilde oluşturulmuş mikro yapıları kontrol edin. Düzenli MinDE kalıpları oluştuğunda, bileşenleri karıştırmak için iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak büyük miktarda tamponu çıkarın ve ardından 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak geri kalanını dikkatlice çıkarın. Daha uzun görüntüleme sürelerine izin vermek için, haznenin içine nemli bir sünger parçası tıkayın. Süngerin lamel yüzeyine temas etmediğinden emin olun.Mikro yapılarda kalan tamponun kurumasını önlemek için hazneyi hemen bir kapakla kapatın. Mikro yapıların görüntülenmesinden önce, mikro boşluklardaki proteinler salınırken MinDE kendi kendine organizasyonunun PDMS mikro yapısının üzerinde durdurulduğunu doğrulayın. Bu temsili videoda, çift renkli görüntüleme, MinD ve MinE'nin, desteklenen lipid çift katmanları üzerinde spiral desenlere uyan hareketli yüzey dalgaları halinde nasıl kendi kendini organize ettiğini gösterir.Burada, tek renkli görüntüleme, PDMS mikro yapılarında kutuptan kutba salınımlar gerçekleştiren MinD ve MinE'yi gösterir. Salınımlar, bölme kutuplarında maksimum konsantrasyon ve bölmenin ortasında minimum konsantrasyon ile zaman ortalamalı bir MinD konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bu prosedürü takiben, membran bağlanma kinetiğini ve kalma sürelerini belirlemek için tek partikül takibi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Piranha solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Burada, yapay lipid membranlarda yüksek uzay-zamansal hassasiyetle ışık regüle edilmiş ve geri dönüşümlü protein modelleri oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, mavi ışık altında ortak proteini Nano'ya (vahşi tip SspB) bağlanan model zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilen protein iLID'in (geliştirilmiş ışıkla indüklenebilir dimer) lokalize fotoaktivasyonundan oluşur.

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

Öğrenin, MinD ve MinE proteinlerinin desteklenen lipid çift katmanları üzerinde kendi kendini düzenleme davranışlarını incelemek için geliştirilen bu yöntemi. PDMS mikro bölmeler kullanılarak geometrik kısıtlamaların protein deseni oluşumuna etkisi detaylıca analiz edilir.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Daha fazla video keşfet