Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Bu yöntem, hücrenin organizasyonu ve zarları hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, geometrik ipuçlarının süreçte oynadığı rol. Bu tekniğin temel avantajı, protein konsantrasyonları gibi patern oluşumunu etkileyen tüm yönler üzerinde hassas kontrole izin vermesidir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi çok katmanlı veziküller oluşturun.

Şimdi, lipitleri yedi ila 10 döngü boyunca dondurarak çözün, önce sıcak bir plaka üzerinde 70 ila 99 santigrat derecede su içeren bir beher ve ayrıca sıvı nitrojen tutan bir kap hazırlayın. Azot kaynamayı durdurana kadar şişeyi büyük cımbızla sıvı nitrojen içinde tutun. Ardından, çözelti tamamen çözülene kadar şişeyi sıcak suya aktarın.

Karışıma bağlı olarak, lipit karışımı göze net görünene kadar bu adımları tekrarlayın. Ardından, bir lipit ekstrüder monte edin ve sistemi Min tamponu ile önceden durulayın. Lipid karışımını 50 nanometre gözenek boyutuna sahip bir zardan 35 ila 41 kez ekstrüde edin.

Zarı hiç geçmeyen agregalardan kaçınmak için tek sayıda geçişle bitirdiğinizden emin olun. Cam lamelleri ters çevrilmiş bir cam Petri kabına veya başka bir inert yüzeye dağıtın. Bir cam pipetle, her lamellerin ortasına yedi damla konsantre sülfürik asit ekleyin.

Daha sonra asit damlalarının ortasına iki damla% 50 hidrojen peroksit ekleyin. Reaksiyonu örtün ve en az 45 dakika inkübe edin. Şimdi, lamelleri cımbız kullanarak tek tek alın ve asidi ultra saf suyla durulayın.

Yıkanmış lamelleri yapışmaz tutuculara veya benzeri bir taşıma cihazına yerleştirin. Şimdi her bir lamel ultra saf su ile yoğun bir şekilde durulayın ve yüzeyi basınçlı gazla kurulayın. Lamelin temiz tarafını kalıcı kalemle işaretleyin.

Hazneyi monte etmek için önce kapağı ve 0,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünün konik kısmını keskin bir makasla kesin ve atın. Ardından tüpün üst kenarına UV yapıştırıcısı sürün ve bir pipet ucu kullanarak yapıştırıcıyı eşit şekilde dağıtın. Tüpü lamel temiz tarafına baş aşağı yapıştırın.

Son olarak, 360 nanometrelik bir lamba veya LED'in altına beş ila 15 dakika boyunca birden fazla oda yerleştirerek UV yapıştırıcısını sertleştirin. Desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için, bir ısı bloğunu 37 santigrat dereceye ısıtın ve iki mililitrelik reaksiyon tüpünü hazne başına bir tüpte Min veya SLB tamponu ile inkübe edin. UV kürleme ve montajı sırasında çökelmiş olabilecek toz veya diğer parçacıkları temizlemek için monte edilmiş ve kürlenmiş odalara nitrojen üfleyin.

Ardından, odaları ısı bloğunun üzerine yerleştirin. 20 mikrolitrelik berrak lipitleri 130 mikrolitre Min tampon ile seyreltin ve mililitre başına 0.53 miligramlık bir çalışma konsantrasyonu oluşturun. Her hazneye 75 mikrolitre lipit karışımı ekleyin.

Şimdi, bir zamanlayıcıyı üç dakikaya ayarlayın. Kuluçka süresi boyunca, veziküller hidrofilik cam yüzeyde patlar ve tutarlı bir SLB oluşturmak için birleşir. 60 saniye geçtikten sonra, her odaya 150 mikrolitre Min tampon ekleyin.

Kalan 120 saniyeden sonra, her bir hazneyi 200 mikrolitre Min veya SLB tamponu ekleyerek, birkaç kez dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek, çıkarıp 200 mikrolitre daha ekleyerek yıkayın. Her hazne bir kez yıkandıktan sonra, iki mililitre tampon bitene kadar ilk hazneyi iyice yıkamaya devam edin. Desteklenen lipit çift katmanlarının yıkanması, haznedeki hareketlerin kapsamını mükemmelleştirmek ve doğru yıkama yoğunluğunu bulmak için biraz deneyim gerektirir.

Desenli silikon gofretlerden PDMS mikro yapıları üretmek için önce 10 gram PDMS tabanı ve bir gram PDMS çapraz bağlayıcı ağırlığında plastik bir kap kullanın. PDMS karışımını karıştırmak ve gazını almak için bir karıştırma cihazı kullanın. Şimdi, az miktarda PDMS'yi doğrudan silikon gofret üzerindeki yapıya bırakmak için bir pipet ucu kullanın.

Hemen PDMS damlasına 1 lamel yerleştirin ve lameli silikon gofret üzerine hafifçe bastırmak için temiz bir pipet ucunun üst ucunu alın. PDMS, lamel ve silikon gofret arasında ince bir şekilde yayılmalıdır. Gofretleri lamellerle birlikte bir fırına koyun ve PDMS'yi üç ila dört saat veya gece boyunca 75 santigrat derecede kürleyin.

Ardından, gofreti fırından çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Bir tıraş bıçağıyla, takılı PDMS ile lameli silikon gofretten dikkatlice çıkarın. Şimdi, cam için daha önce açıklandığı gibi PDMS'ye plastik bir hazne takın.

Lamelleri ekli hazne ile alın ve proses gazı olarak oksijenli plazma temizleyiciye yerleştirin. Lamelleri plazma ile temizleyin. Bu çalışmada bir dakika boyunca %30 güç ve 0.3 milibar oksijen basıncı kullanılmıştır.

Şimdi, daha önce cam üzerinde anlatıldığı gibi haznede bir SLB hazırlayın. Kendi kendine organizasyon testini gerçekleştirmek için, odadaki tampon hacmini, eksi protein ve ATP çözeltisi miktarı düşüldükten sonra 200 mikrolitre Min tampona ayarlayın. Ardından MinD, MinE etiketli MinD ve istenirse MinC ekleyin ve bileşenleri pipetleyerek hafifçe karıştırın.

Şimdi, MinDE'nin kendi kendine organizasyonunu başlatmak için 2.5 milimolar ATP ekleyin. Önümüzdeki 10 ila 30 dakika boyunca, bir floresan mikroskobu üzerinde düzenli MinDE desen oluşumunu ve uygun şekilde oluşturulmuş mikro yapıları kontrol edin. Düzenli MinDE kalıpları oluştuğunda, bileşenleri karıştırmak için iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak büyük miktarda tamponu çıkarın ve ardından 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak geri kalanını dikkatlice çıkarın. Daha uzun görüntüleme sürelerine izin vermek için, haznenin içine nemli bir sünger parçası tıkayın. Süngerin lamel yüzeyine temas etmediğinden emin olun.

Mikro yapılarda kalan tamponun kurumasını önlemek için hazneyi hemen bir kapakla kapatın. Mikro yapıların görüntülenmesinden önce, mikro boşluklardaki proteinler salınırken MinDE kendi kendine organizasyonunun PDMS mikro yapısının üzerinde durdurulduğunu doğrulayın. Bu temsili videoda, çift renkli görüntüleme, MinD ve MinE'nin, desteklenen lipid çift katmanları üzerinde spiral desenlere uyan hareketli yüzey dalgaları halinde nasıl kendi kendini organize ettiğini gösterir.

Burada, tek renkli görüntüleme, PDMS mikro yapılarında kutuptan kutba salınımlar gerçekleştiren MinD ve MinE'yi gösterir. Salınımlar, bölme kutuplarında maksimum konsantrasyon ve bölmenin ortasında minimum konsantrasyon ile zaman ortalamalı bir MinD konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bu prosedürü takiben, membran bağlanma kinetiğini ve kalma sürelerini belirlemek için tek partikül takibi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Piranha solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.