Name: Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Keşfedin parakrin sinyal iletişimini proksimal kültür yöntemiyle over kanser hücreleri ve mikroçevre arasındaki etkileşimleri incelemek için. Bu basit ve tekrarlanabilir teknik kanser araştırmalarına değerli katkılar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hastalara bu deneyler dokusu toplamalarında onların katılım için borçlu bulunmaktadır. Bir DoD OCRP yumurtalık kanseri Akademi Ödülü (W81XWH-15-0253) ve Anirban K. Mitra için Colleen'in rüya Vakfı Ödülü pilot bu araştırma desteklenen.

Protokol kurumsal düzenleme kurulu, Indiana Üniversitesi kuralları izler.
1. hücre hazırlık
<ol><li>
Yalıtım ve kültür insan birincil mesothelial hücreler
	<ol>
<li>Ayrı tutma insan birincil mesothelial hücreleri (HPMCs)17,18 daha önce açıklanan ve onları büyümek insan omentumun büyüme orta [Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, % 1'i içeren DMEM) tamamlamak penisilin-streptomisin, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1'i vitamin] 37 ° C ve % 5 CO2. Not: HPMCs genellikle % 100 izdiham (Şekil 1A) yetiştirilmektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yumurtalık kanser hücrelerinin büyüme koşulları
	<ol>
<li>Tam büyüme orta 37 ° C ve % 5 CO2HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerinde büyür. Not: Kullanım HeyA8 yetiştirilen yaklaşık % 80'i izdiham (Şekil 1B) hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre kültürü
<ol><li>
Proksimal kültür set-up
	<ol>
<li>6-iyi plakaları ile 10 mikron kalınlığında Polikarbonat doku kültürü tedavi membran 0.4 mikron gözenekleri (108 gözenekleri/cm2) ve 4,67 cm2 büyüme alanı için kullanım Transwell ekler. Gerekirse, optimize etmek için farklı Ekle boyutları göre büyüme yüzey alanı seribaşı hücre sayısı ölçekleyerek. Sıcak tam büyüme orta, tripsin ve fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanmadan önce 37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ekler hazırlanıyor
	<ol>
<li>HeyA8 hücre membran ucun alt yüzeyinde tohum için INSERT steril forseps kullanarak onun paketinden çıkarın ve bir steril 15 cm kültür tabak içinde ters yerleştirin.</li>
		<li>Derinliği ters Ekle karşılamak ya da herhangi bir uygun Steril konteyner ile vekil için olduğu gibi 15 cm tabak kullanın. Deney bağlı olarak ekler gerekli sayıda 15 cm çanak yerleştirin.</li>
		<li>Buna göre üç denetimi ve üç deneysel koşullar etiket ekler kenarında bir marker ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kanser hücrelerinin hazırlanıyor
	<ol>
<li>25 cm2 şişeye (~ 2 x 106 hücreler) % 80 izdiham, yetiştirilen HeyA8 hücre trypsinize, 40 – 60 s için 1 mL tripsin (%0.25) ekleyin ve tripsin tam büyüme ortamının 6 mL ile nötralize etmek için.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında (RT) 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve hücre Pelet tam büyüme orta 5 mL resuspend. Trypan mavi boya hariç tutma yöntemini kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kanser hücrelerinin tohumlama
	<ol>
<li>100.000 hücre/mL tam büyüme orta canlı HeyA8 hücrelerinin askıya alma. Tam büyüme orta (ters beri bu şimdi, karşı karşıya) Ekle alt 800 μL içinde dikkatle tohum 80.000 HeyA8 hücreleri.</li>
		<li>Böylece hücreleri Ekle (Şekil 1 c) kalır bir kubbe gibi şekli oluşturmak için hücre tohum. Membran Merkezi'nden başlayın ve yavaş yavaş pipetting süre eşmerkezli daireler dışa doğru hareket. 3 mm den fazla herhangi bir orta dökülmesini önlemek için kenarından gidiyor kaçının. Not: Numaralı seribaşı hücre sayısı hücre büyüme oranı ve deneme süresi bağlıdır. Proksimal bu kültürü için tohumlari HeyA8 hücre sayısı optimize ve hücreleri üçüncü günün sonunda % 80 – 90 birleşmesi olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kanser hücre Eki
	<ol>
<li>15 cm çanak kapağı ve dikkatle CO2 kuluçka için ekler içeren yemek taşımak. Orta ve hücreleri üzerine yerleştirin Bu adımda damla bozmaya değil önemlidir. Kanser hücrelerinin Ekle'nin üzerine takmak izin vermek 4 h için 37 ° C'de hücreler bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesothelial hücreler hazırlanıyor
	<ol>
<li>Yaklaşık 4 saat sonra % 100 izdiham tripsin (% 0,25) 1-2 min için 2 mL ile 75 cm2 şişeye (~ 4 x 106 hücreler) içinde yetiştirilen HPMCs trypsinize ve tripsin tam büyüme ortamının 12 mL ile nötralize.</li>
		<li>Hücreleri, 500 x g de RT 3 dk santrifüj kapasitesi, hücre Pelet 10 mL tam büyüme orta resuspend ve trypan mavi boya hariç tutma yöntemini kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesothelial hücreler tohumlama
	<ol>
<li>Canlı HPMCs 300.000 hücre/mL tam büyüme aracı olarak askıya alma. Taze tam büyüme ortamının 2.5 mL 6-şey plaka her şey için ekleyin. Dikkatle Biyogüvenlik hood için dışarı ekler içeren 15 cm çanak getir. Steril forseps kullanarak, INSERT flip ve dik, tam büyüme orta (Şekil 1 c) dalmış alt yüzey bağlı HeyA8 hücreleri ile 6-şey kalıbının kuyuya yerleştirin.</li>
		<li>Tohum 450.000 HPMCs (Şekil 1 c) kuyunun bakan yüzeyi veya ekler olmadan herhangi bir HeyA8 hücreleri HPMC denetimler için bağlı HeyA8 hücreler ekler iç büyüme ortamının 1,5 ml askıya. Hücreleri olmadan büyüme ortamının 1.5 mL HeyA8 denetimleri ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proksimal kültür büyüyen
	<ol>
<li>Proksimal kültür için 72 h 37 ° C ve %5 CO2 CO2 kuluçka büyümeye izin. Gerekirse, orta aşağıdaki gibi doldurulan.<ol>
<li>İç ekleme için 750 µL kaldırın ve taze tam büyüme ortamının 750 µL ekleyin.</li>
			<li>Dış ekleme (6-şey plaka) için 1 mL kaldırın ve 1 mL taze tam büyüme ortamının ekleyin. 1 mL tek adımda orta değiştirme kolaylığı için seçildi. İsterseniz, 1,25 mL kaldırıldı ve yerine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre toplama
	<ol>
<li>Hücreleri proksimal kültür 72 h sonra toplamak. Hücreleri çapraz bulaşma HeyA8 hücreleri ve HPMCs. Trypsinize önlemek için bu adımı, özel dikkat, onları santrifüj kapasitesi ve çapraz kontaminasyonu önlemek için membran hücrelerdeyse lysing yerine Pelet parçalayıcı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreleri trypsinizing
	<ol>
<li>Her iki ucun 1 x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Yeni bir de ekler nakletmek ve tripsin eklemek. Tripsin 0.5 mL ucun içeriye doğru ekleyin ve tripsin 2 mL 6-şey kalıbı Ekle alt yüzeyine bağlı kanser hücrelerinin trypsinize ekleyin. 37 ° C'de 2 dk plaka kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tripsin nötralize
	<ol>
<li>Tam büyüme orta 1 mL tripsin nötralize, yukarı ve aşağı, pipet ve sonra hücreleri almak ve etiketli toplama tüp aktarmak için INSERT içine ekleyin. Tam büyüme ortamı tam bir nötralizasyon için bir ek 2 mL ekleyin. Membran değil delmek hücrelerin bir çapraz kontaminasyonu önlemek için pipetting süre için özen gösterilmelidir.</li>
		<li>Hücreleri ekleme alt toplamak için böylece hücreleri 6-şey kalenin dibine oldu ekledi adım 12,2 alt yüzeyine 2-3 x 2 mL tripsin pipette. Tripsin plaka altındaki büyüme ortamının 6 mL ile etkisiz hale getirmek ve etiketli toplama tüp plaka içeriğini aktarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplama ve hücre lysing
	<ol>
<li>500 x g 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi ve medya Aspire edin. Resuspend ve fenol ve guanidin thiocyanate-tabanlı lizis reaktif RNA çıkarılması için 0.7 mL ile hücre topakları parçalayıcı. Herhangi bir uygun kiti kullanarak RNA yalıtmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Not: Aşağıdaki adımlarda bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir gen ifadeleri değişikliklerin sonucu olarak proksimal kültür çalışmaya tepkimesi (qPCR) açıklanmıştır.
<ol><li>CDNA RNA örneklerinden qPCR için hazır olun. Uygun herhangi bir ters transkriptaz Ters transkripsiyon tüm mRNA emin olmak için karşılık gelen bir tampon ve rasgele astar ile kullanın (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>Fibronektin (FN1) ve E-cadherin (CDH1) mRNA ifade düzeyde değişiklikleri değerlendirme ve büyüme faktörü beta 1 (TGFβ1) tarafından qPCR gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) olarak bir iç kontrol ile dönüşümü. Standart ticari olarak mevcut gen ifade deneyleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanmak veya astar tasarım için mümkündür.</li>
	<li>HeyA8 kontrolleri ile HPMCs ve proksimal kültür HPMC kontrolleri ile yetiştirilen HPMCs ile proksimal kültüründe yetiştirilen HeyA8 hücreleri karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Parakrin ve juxtacrine hücreler arasında sinyal mekanizmasının anlama, normal doku homeostazı hastalığı koşullar7,ve8hakkında daha iyi bilgi geliştirmek için önemlidir. Çoğu parakrin toplayarak yürütülen çalışmalar sinyal orta bir hücre tipi ve diğer hücre tipi tedavi etmek için kullanarak şartına. Bu yöntem doğal sadeliği içinde bir avantaja sahiptir. Ancak, bu doğru hücresel microenvironment salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları veya üretim ki...

Kanser hücreleri ve tümör microenvironment tümör ilerleme arasındaki üretken karşılıklı etkileşimler rolü de kurulmuş olup araştırma kanser biyoloji1' deki önemli bir odak noktası haline gelmiştir. Çift yönlü sinyal benzer örnekleri şifa, bağışıklık yanıtı, anjiogenez, kök hücre nişler, yara ve geliştirme2,3,4,5,6 sırasında açısından büyük önem taşıyor , 7 , 8. hücreleri hücre kaderi, doku fizyolojisi ve hastalık ilerleme belirleyen çeşitli şekillerde ekstraselüler ipuçlarını kendi microenvironment gelen tepki bu biyolojik süreçler içinde ortak bir tema olduğunu. Bu nedenle, odak giderek tür hücre-hücre iletişim içinde yer alan mekanizmaları daha iyi bir anlayış geliştirmek doğru döndü. Bu tür etkileşimler çoğunluğu ücretli olabilecek parakrin veya hücreler arasında sinyal juxtacrine. Parakrin sinyal bir yanıtta ise9,10, tetikleme çevresinde, tabloda başka bir hücreyi tarafından karşılık gelen reseptörleri juxtacrine algılanan spesifik sinyal faktörler bir hücre salgılanmasını içerir sinyal iki hücre dahil11,12hücresel bileşenleri arasında doğrudan temas gerektirir.
Böyle sinyal doku homeostazı, hem de tümör microenvironment çok önemli bir bileşenidir. Kanser hücrelerinin parakrin ve juxtacrine faktörleri kanser ilişkili fibroblastlar (restorantlar), bağışıklık hücreleri ve adiposit13,14,15,16gibi tümör stroma hücreden faydalanın. Juxtacrine sinyal bitişik ligandlar ve çentik sinyal veya integrinler ve onların anılan sıraya göre arasındaki etkileşimler reseptörler içerir iken büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, vb, aracılı sinyal parakrin hücre dışı matriks proteinleri. Yumurtalık kanseri hücreleri ve restorantlar arasındaki karşılıklı etkileşimler tümör ilerleme ve metastaz14önemini göstermiştir. Benzer şekilde, anahtar mikroRNA ve metastatik kolonizasyon17, teşvik kanser hücreleri transkripsiyon faktörleri Onkolojisti yumurtalık kanser hücrelerinin metastaz sitenin kapsayan mesothelial hücreler ile etkileşimleri düzenleyen 18.
Bir şartına orta ikinci hücre tipi ile tedavi etmek için bir hücre türünden toplanan kullanımı dahil parakrin sinyal üzerinde çoğu çalışmaları. Bu yaklaşım yaygın olarak kullanılan iken, alan hücre microenvironment salgılanan faktöründeki yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyon düzeyleri etkili çoğaltmaz. Aynı zamanda bir hücre tarafından üretilen salgılanan faktörü, sürekli akış kinetik çoğaltmak başarısız olur ve komşu hücre tarafından alınan. Parakrin salgılanan faktörler sadece kaynak hücre çevresinde gerekli konsantrasyonlarda ve diffüz ve mesafe arttıkça dışarı seyreltik eğilimi gibi kısa mesafelerde etkilidir sinyal. Salgılanan faktör bu yerelleştirilmiş yüksek yoğunlukta bir yanıt reseptör hücre olarak tetiklemek için esastır. Ayrıca, alıcı hücrelerdeki yanıt da yeni salgılanan faktörler ve onların sürekli tükenmesi bozulması, bağlama ve içselleştirilmesi alıcı hücreler ve kaynak hücreye uzak difüzyon yoluyla denge bağlıdır. Klimalı orta yüksek yerelleştirilmiş konsantrasyonları microenvironment içinde mevcut için hesabına konsantre olabilir, ama bu doğru bir şekilde tam konsantrasyonları çoğaltma yapamaz. Ayrıca, üretimin doğal kinetik ve faktör ilgili tükenmesi taklit edemez. Daha doğrusu parakrin sinyal çoğaltmak ve mekanizmaları sinyal juxtacrine ayırmak için her iki yüzeyi geçirgen membran iki hücre tipleri büyüyen içerir bir roman proksimal kültür yöntemi tasarladılar. Gözenekleri juxtacrine etkileşimleri önlemek ve henüz yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonları salgılanan faktörler değişimine izin vermek için küçük. Bu şekilde, bu sistem üretim kinetik ve parakrin faktörler tükenmesi korur.

<table><tbody><tr><td>24 mm Transwell 0.4 & ile geçirgen destek; m Gözenekli Polikarbonat Membran Ekleme</td><td>Corning (Costar)</td> <td>3412</td> <td>& boğa; 10 & mikro; M kalınlığında yarı saydam polikarbonat membran & boğa; Optimal hücre bağlanması ve boğa için tedavi edilmiştir; 6 oyuklu bir plakada paketlenmiş 6 uç, kutu başına 4 plaka ve boğa; Hücre görünürlüğü için zar boyanmalıdır &boğa; Gama radyasyonu ile sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Düz Tabanlı, TC ile işlenmiş, steril, Kapaklı</td></tr><tr><td>15 cm kültür kabı</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Steril, TC ile muamele edilmiş Hücre Kültürü Kabı</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminler</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin, 2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td></td><td></td><td>Her marka iyidir</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td></td><td></td> Herhangi <td>bir marka iyidir</td></tr><tr><td>Biyogüvenlik seviye II kabini</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir marka iyidir</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Gen Ekspresyon Testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan Gen Ekspresyon Testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan Gen Ekspresyon Testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan Gen İfadesi Tahlil</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini RNA izolasyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri</td><td>Ernst Lengyel Laboratuvarı, Chicago</td><td></td><td></td>Üniversitesi</tr><tr><td>TGF ve beta'dan elde edilmiştir; Nötralize Edici Antikor</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Hücreler arası etkileşimler tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Parakrin veya juxtacrine sinyal bu tür etkileşimler aracılık eder. Bir şartına orta ve coculture çalışmalar etkileşimleri bu iki tür arasında ayırımcılık için en yaygın yöntem vardır. Ancak, yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonda microenvironment salgılanan faktörler parakrin etkileşimleri sırasında etkisini doğru tarafından şartına orta recapitulated değil ve böylece, imprecise sonuçlara yol açabilir. Bu sorunu çözmek için parakrin sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi tasarladılar. İki hücre tipleri 0.4 µm gözenekli bir 10 µm kalınlığında Polikarbonat membran her iki yüzeyi yetiştirilmektedir. Gözenekleri salgılanan faktörler değişimine izin ver ve aynı zamanda, juxtacrine sinyal inhibe. Hücreleri toplanan ve uç noktada parakrin sinyal etkilerini belirlemek için lysed. Salgılanan faktörlerin yerelleştirilmiş konsantrasyon degradeler için izin vermeye ek olarak, bu yöntem takmaktan kültürünün yanı sıra inhibitörleri kullanımını içeren deneyler için mükellef olur. Biz yumurtalık kanseri hücreleri ve metastaz sitesinde karşılaştıkları mesothelial hücreler arasındaki etkileşimler eğitim için bu yöntemi kullanırken, çeşitli alanlarda sinyal parakrin çalışmaya araştırmacılar için herhangi bir iki yapışık hücre tipleri için adapte edilebilir, tümör microenvironment, immünoloji ve geliştirme de dahil olmak üzere.

Onkolojisti yumurtalık kanser hücrelerinin metastaz periton boşluğuna19içinde yerinde mesothelial hücreler karşılaşma. Mesothelial hücreler yardımıyla uyarlamalı başarılı metastaz17,18,20,21 etkinleştirmek yumurtalık kanser hücrelerinin yanıt-e doğru inducing içinde üretken parakrin ve juxtacrine etkileşimleri . Proksimal kültür yöntemini...

Parakrin ve juxtacrine hücresel etkileşimlerin tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, proksimal kültür yöntemi parakrin sinyal incelemek için doğrudan hücresel temas engelleyen sırasında salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları nerede saklanır kullanılır.

Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Bu yöntem, hücreler arası iletişim alanında, iki hücre tipi arasındaki karşılıklı parakrin ve jukstakrin etkileşimleri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, tipik kültür koşulları altında parakrin sinyallemesini doğru bir şekilde yakalayan ve aynı zamanda etkili juxtacrine sinyallemesini önleyen çok basit ve tekrarlanabilir bir teknik olmasıdır. Bu tekniğin sonuçları, kanser hücreleri ve tümör mikroçevresi arasındaki karışma mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına kadar uzanır.Bu yöntem, kanser hücreleri ve tümör stroması arasındaki etkileşimler hakkında fikir verebilse de, yara iyileşmesi ve anjiyogenez gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Yumurtalık kanseri hücrelerini 40 ila 60 saniye boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin içeren% 80 birleşik bir karışımdan ayırarak başlayın, ardından reaksiyonun altı mililitre tam büyüme ortamı ile nötralizasyonu ile başlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti beş mililitre taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.Saydıktan sonra, hücreleri mililitre tam büyüme ortamı konsantrasyonu başına 100.000 yumurtalık kanseri hücresine seyreltin ve uygun boyutta bir steril doku kültürü kabına deneysel koşul başına üç ters 0.4 mikrometre gözenekli doku kültürü ile muamele edilmiş polikarbonat membran hücre kültürü eki yerleştirin. Ekleri deneysel duruma göre etiketleyin ve kanser hücrelerini, zarın ortasından başlayarak ve 800 mikrolitrelik bir kubbe oluşturmak için dışa doğru hareket ederek eşmerkezli daireler halinde her bir ekin altına dikkatlice pipetleyin. Hücreleri ekin alt yüzeyine tohumlarken son derece dikkatli olun, böylece hücre içeren ortamın kubbesi inkübasyon sırasında ekin kenarlarından akmaz.Tüm ekler tohumlandığında, tabağı örtün ve ekleri dikkatlice hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yaklaşık dört saat sonra, HPMC'yi bir ila iki dakika boyunca iki mililitre% 0.25 tripsin ile ayırın, ardından reaksiyonun 12 mililitre tam büyüme ortamı ile nötralizasyonu izleyin. HPMC'yi santrifüjleme ile toplayın ve peleti sayım için 10 mililitre tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.Hücreleri, mililitre tam büyüme ortamı başına 300.000 HPMC'ye seyreltin ve altı oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 2.5 mililitre taze tam büyüme ortamı ekleyin. Steril forseps kullanarak, her bir parçayı sağ tarafı yukarı bakacak şekilde altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna yerleştirin, böylece alt yumurtalık kanseri hücresine bağlı yüzeyler ortama daldırılır. Daha sonra her bir ekin kuyusuna 1,5 mililitre HPMC tohumlayın.Daha sonra plakayı 72 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, ekleri her bir oyuktan dikkatlice çıkarın ve eklerin her iki tarafını PBS ile durulayın. Her bir parçayı yeni bir altı oyuklu plakaya yerleştirin ve uç kuyucuklarına 0,5 mililitre tripsin ve alt kuyucuklara iki mililitre tripsin ekleyin.37 santigrat derecede iki dakika sonra, her bir parçaya bir mililitre tam büyüme ortamı ekleyin ve zarı yırtmadan veya hücre süspansiyonunu aşağıdaki kuyuya dökmeden çözeltiyi birkaç kez dikkatlice pipetleyin. Pipetleme sırasında, hücrelerin bir odacıktan diğerleriyle çapraz kontaminasyonunu önlemek için özen gösterilmelidir. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri etiketli bir toplama tüpüne aktarın ve tripsini iki mililitre tam büyüme ortamı ile daha da nötralize edin.Eklerin altındaki hücreleri toplamak için, zarların tabanlarını, altı oyuklu plakanın karşılık gelen oyuğundan iki mililitre tripsin ile iki ila üç kez yıkayın, böylece ayrılan hücreler uygun kuyu tabanlarında yakalanır. Tüm hücreler ayrıldığında, her bir oyuktaki tripsini altı mililitre taze büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonlarını etiketli toplama tüplerine aktarın. Daha sonra tüm hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri standart protokollere göre RNA ekstraksiyonu ve izolasyonu için tüp başına 0.7 mililitre fenol ve guanidin tiyosiyanat bazlı lizis reaktifi içinde yeniden süspanse edin.HPMC'nin yumurtalık kanseri hücreleri ile proksimal kültürü, kanser hücrelerinin yokluğunda ekler üzerine ekilen kontrol HPMC'ye kıyasla fibronektin ve Dönüştürücü Büyüme Faktörü veya TGF beta bir ekspresyonunun artmasına neden olur. Hem fibronektin hem de TGF beta birin ekspresyonu, HPMC'ler ile proksimal kültür üzerine yumurtalık kanseri hücrelerinde, HPMC yokluğunda kültürlenen kontrol yumurtalık hücresine kıyasla önemli ölçüde artar. Tersine, HPMC şartlandırılmış besiyeri ile tedavi edilen yumurtalık kanseri hücreleri, TGF beta bir ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmaksızın önemli ölçüde azalmış bir fibronektin ekspresyonu gösterir.Bununla birlikte, TGF beta bir'in nötralize edici bir antikor ile bloke edilmesi, HPMC'lerle proksimal kültürde yumurtalık kanseri hücrelerinde TGF beta bir ekspresyonunda önemli bir azalmaya neden olur. İlginç bir şekilde, muhtemelen telafi edici bir yanıt olarak proksimal olmayan kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde TGF beta bir ekspresyonunda hafif bir artış gözlenir. Yumurtalık kanseri hücreleri ile proksimal kültür, HPMC'lerde E-kaderin ekspresyonunu hafifçe arttırırken, HPMC'lere yakın olarak büyüyen yumurtalık kanseri hücrelerinde kontrollere kıyasla E-kaderinde belirgin bir azalma gözlenir, bu da proksimal kültür sisteminin etkinliğini daha da gösterir yumurtalık kanseri hücreleri ile metastaz bölgesindeki normal hücreler arasındaki parakrin sinyallemeyi incelemek için.Bu prosedürü denerken, ekilen hücre sayısını ve proksimal kültürün süresini optimize etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, tümör hücresi mezotelyal hücre ko-kültürü sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikler ve aşağı akış işleme sinyal yollarının aktivasyonu hakkında ek soruları yanıtlamak için immünoblotlama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, tümör mikroçevresi, immünoloji, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, salgılanan faktörler aracılığıyla hücreler arasındaki karşılıklı parakrin etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, yumurtalık kanseri hücrelerinin ve birincil insan mezotelyal hücrelerinin proksimal bir ko-kültür modelini geliştiriyoruz. Fizyolojik olarak ilgili bu model, doğrudan hücresel teması önlerken salgılanan faktörlerin lokalize konsantrasyonlarının korunduğu parakrin sinyalizasyonun incelenmesine izin verir.

Proksimal Kültür Sistemi: Hücreler Arasındaki Parakrin Sinyalleşmeyi İncelemek İçin Bir İn Vitro Kültür Tekniği

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Hücre kültür manken direnç arter yollar endotel, düz kas, veya endotel ve düz kas (myoendothelial junction) arasında sinyal diseksiyon için izin açıklanmıştır. Bu hücre kültür model kullanarak agonistler veya protein yalıtım, elektron mikroskopi veya ayirt seçici uygulama yararlı olabilir.

Hücre kültür manken direnç arter

Biz X x-ray ışınlanmış Caco-2 ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) arasındaki çapraz karışma araştırmak için bir protokol mevcut. Protokol Caco-2 ışınlama ve set-up ortak kültür PBMC ile başlar; daha sonra trans-epitel elektriksel direnç düzenli olarak 48 s ve western blot Caco-2 ve PBMC gerçekleştirilen üzerinden ölçülür.

X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

Mezenkimal kök hücre diş hamurundan izole ve prostat kanseri hücre etkileşimi doğrudan ve dolaylı ortak kültür yöntemleri üzerinde temel değerlendirilmesi için iletişim kuralları sağlar. Koşul orta ve trans-şey membranlar dolaylı parakrin etkinliğini çözümlemeye uygundur. Differentially Tohum hücreleri birlikte lekeli doğrudan hücre-hücre etkileşim için uygun bir model olduğunu.

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Bu çalışma, in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal olaylarını incelemek için oldukça tekrarlanabilir ve izlenebilir bir yöntemi özetlemektedir.  Bu protokol, parakrin Wnt5a sinyallemesinin murin nöral krest hücrelerinde ve miyoblastlarda etkisini değerlendirmek için uygulandı.

Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Keşfedin parakrin sinyal iletişimini proksimal kültür yöntemiyle over kanser hücreleri ve mikroçevre arasındaki etkileşimleri incelemek için. Bu basit ve tekrarlanabilir teknik kanser araştırmalarına değerli katkılar sağlar.

Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Daha fazla video keşfet