Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Bu yöntem, hücreler arası iletişim alanında, iki hücre tipi arasındaki karşılıklı parakrin ve jukstakrin etkileşimleri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, tipik kültür koşulları altında parakrin sinyallemesini doğru bir şekilde yakalayan ve aynı zamanda etkili juxtacrine sinyallemesini önleyen çok basit ve tekrarlanabilir bir teknik olmasıdır. Bu tekniğin sonuçları, kanser hücreleri ve tümör mikroçevresi arasındaki karışma mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına kadar uzanır.

Bu yöntem, kanser hücreleri ve tümör stroması arasındaki etkileşimler hakkında fikir verebilse de, yara iyileşmesi ve anjiyogenez gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Yumurtalık kanseri hücrelerini 40 ila 60 saniye boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin içeren% 80 birleşik bir karışımdan ayırarak başlayın, ardından reaksiyonun altı mililitre tam büyüme ortamı ile nötralizasyonu ile başlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti beş mililitre taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri mililitre tam büyüme ortamı konsantrasyonu başına 100.000 yumurtalık kanseri hücresine seyreltin ve uygun boyutta bir steril doku kültürü kabına deneysel koşul başına üç ters 0.4 mikrometre gözenekli doku kültürü ile muamele edilmiş polikarbonat membran hücre kültürü eki yerleştirin. Ekleri deneysel duruma göre etiketleyin ve kanser hücrelerini, zarın ortasından başlayarak ve 800 mikrolitrelik bir kubbe oluşturmak için dışa doğru hareket ederek eşmerkezli daireler halinde her bir ekin altına dikkatlice pipetleyin. Hücreleri ekin alt yüzeyine tohumlarken son derece dikkatli olun, böylece hücre içeren ortamın kubbesi inkübasyon sırasında ekin kenarlarından akmaz.

Tüm ekler tohumlandığında, tabağı örtün ve ekleri dikkatlice hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yaklaşık dört saat sonra, HPMC'yi bir ila iki dakika boyunca iki mililitre% 0.25 tripsin ile ayırın, ardından reaksiyonun 12 mililitre tam büyüme ortamı ile nötralizasyonu izleyin. HPMC'yi santrifüjleme ile toplayın ve peleti sayım için 10 mililitre tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Hücreleri, mililitre tam büyüme ortamı başına 300.000 HPMC'ye seyreltin ve altı oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 2.5 mililitre taze tam büyüme ortamı ekleyin. Steril forseps kullanarak, her bir parçayı sağ tarafı yukarı bakacak şekilde altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna yerleştirin, böylece alt yumurtalık kanseri hücresine bağlı yüzeyler ortama daldırılır. Daha sonra her bir ekin kuyusuna 1,5 mililitre HPMC tohumlayın.

Daha sonra plakayı 72 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, ekleri her bir oyuktan dikkatlice çıkarın ve eklerin her iki tarafını PBS ile durulayın. Her bir parçayı yeni bir altı oyuklu plakaya yerleştirin ve uç kuyucuklarına 0,5 mililitre tripsin ve alt kuyucuklara iki mililitre tripsin ekleyin.

37 santigrat derecede iki dakika sonra, her bir parçaya bir mililitre tam büyüme ortamı ekleyin ve zarı yırtmadan veya hücre süspansiyonunu aşağıdaki kuyuya dökmeden çözeltiyi birkaç kez dikkatlice pipetleyin. Pipetleme sırasında, hücrelerin bir odacıktan diğerleriyle çapraz kontaminasyonunu önlemek için özen gösterilmelidir. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri etiketli bir toplama tüpüne aktarın ve tripsini iki mililitre tam büyüme ortamı ile daha da nötralize edin.

Eklerin altındaki hücreleri toplamak için, zarların tabanlarını, altı oyuklu plakanın karşılık gelen oyuğundan iki mililitre tripsin ile iki ila üç kez yıkayın, böylece ayrılan hücreler uygun kuyu tabanlarında yakalanır. Tüm hücreler ayrıldığında, her bir oyuktaki tripsini altı mililitre taze büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonlarını etiketli toplama tüplerine aktarın. Daha sonra tüm hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri standart protokollere göre RNA ekstraksiyonu ve izolasyonu için tüp başına 0.7 mililitre fenol ve guanidin tiyosiyanat bazlı lizis reaktifi içinde yeniden süspanse edin.

HPMC'nin yumurtalık kanseri hücreleri ile proksimal kültürü, kanser hücrelerinin yokluğunda ekler üzerine ekilen kontrol HPMC'ye kıyasla fibronektin ve Dönüştürücü Büyüme Faktörü veya TGF beta bir ekspresyonunun artmasına neden olur. Hem fibronektin hem de TGF beta birin ekspresyonu, HPMC'ler ile proksimal kültür üzerine yumurtalık kanseri hücrelerinde, HPMC yokluğunda kültürlenen kontrol yumurtalık hücresine kıyasla önemli ölçüde artar. Tersine, HPMC şartlandırılmış besiyeri ile tedavi edilen yumurtalık kanseri hücreleri, TGF beta bir ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmaksızın önemli ölçüde azalmış bir fibronektin ekspresyonu gösterir.

Bununla birlikte, TGF beta bir'in nötralize edici bir antikor ile bloke edilmesi, HPMC'lerle proksimal kültürde yumurtalık kanseri hücrelerinde TGF beta bir ekspresyonunda önemli bir azalmaya neden olur. İlginç bir şekilde, muhtemelen telafi edici bir yanıt olarak proksimal olmayan kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde TGF beta bir ekspresyonunda hafif bir artış gözlenir. Yumurtalık kanseri hücreleri ile proksimal kültür, HPMC'lerde E-kaderin ekspresyonunu hafifçe arttırırken, HPMC'lere yakın olarak büyüyen yumurtalık kanseri hücrelerinde kontrollere kıyasla E-kaderinde belirgin bir azalma gözlenir, bu da proksimal kültür sisteminin etkinliğini daha da gösterir yumurtalık kanseri hücreleri ile metastaz bölgesindeki normal hücreler arasındaki parakrin sinyallemeyi incelemek için.

Bu prosedürü denerken, ekilen hücre sayısını ve proksimal kültürün süresini optimize etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, tümör hücresi mezotelyal hücre ko-kültürü sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikler ve aşağı akış işleme sinyal yollarının aktivasyonu hakkında ek soruları yanıtlamak için immünoblotlama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, tümör mikroçevresi, immünoloji, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, salgılanan faktörler aracılığıyla hücreler arasındaki karşılıklı parakrin etkileşimleri keşfetmelerinin yolunu açtı.