Name: Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Öğrenin, insan makrofajları ve apoptotik Jurkat hücreleri kullanarak tek hücreli floresan mikroskobu ile efferositoz miktarlandırma yöntemini. Bu teknik, hücre ölümü ve temizleme mekanizmalarını araştıran bilim insanları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada sağlık araştırma (CIHR) işletim Grant paspas-123419, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada keşif Grant 418194 ve bir Ontario Bakanlığı araştırma ve yenilik erken Araştırma Ödülü BH için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. DGW bazı resimler, iletişim kuralları'nın bir optimizasyon ve el yazması yazma sunulan katkıda bulunmuştur; Liverpool Üniversitesi bir pompa astar hibe tarafından finanse edildi. CY Vanier Yüksek Lisans Burs ve CIHR MD/doktora öğrencilik tarafından finanse edilmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve miktar sabit-hücre ve canlı hücre yaklaşımları kullanarak dinamik efferocytic işleminin etkinleştirin. Bu yaklaşımlar yaygın istihdam akış sitometresi tabanlı yöntemleri23,24çeşitli avantajlar sunuyor. Inside-out ile sabit örnekleri boyama kullanım oranı daha sağlam ve doğru miktar ve efferocytosis kapsamı sağlar — gerçekten de, birçok akış sitometresi tabanlı yöntem sadece apoptotik hücreler ve makrofajlar ile...

Apoptozis veya programlanmış hücre ölümü, en çok hücreli canlılar arasında oluşur ve onların gelişme ve homeostasis1için son derece önemli bir son derece düzenlenir fizyolojik süreçtir. Ek olarak normal hücre ciro ve embriyonik geliştirme dahil olmak, apoptozis dokular enfekte veya hasarlı hücreleri ortadan kaldırılması sağlar ve yanıt enfeksiyon, inflamasyon, kanser ve aynı zamanda tıbbi müdahaleler tarafından tetiklenebilir radyoterapi veya steroid1gibi. Apoptotik hücreleri göstermek "ye-bana" fagositler, profesyonel ve profesyonel olmayan bir dizi reseptörler tarafından tanınan sinyalleri onların hücre yüzeyinde topluca "efferocytes" anılacaktır. Bu reseptörler nişan alımı ve apoptotik hücre bozulması efferocyte efferocytosis2,3bilinen işlem aracılığıyla tarafından neden olmaktadır. Fosfatidilserin en iyisi karakterize yemek-sürüş efferocytosis işaret. Normalde plazma zarı iç broşür böylece açığa Fosfatidilserin hücre yüzey4' te bu membran asimetrisi bozan bir lipid scramblase aktive apoptozis ile sınırlanır. Fosfatidilserin olgun makrofajlar gibi bazı sigara apoptotik hücre hücre dışı yüzeyinde bulunan ve trombosit aktive. Ancak, bu hücreler efferocytosed "beni yeme" gibi sinyallerini CD47, onların hücre yüzey5,6,7varlığı nedeniyle değildir. Maruz Fosfatidilserin efferocytic reseptörleri efferocytes tarafından ifade edilen bir dizi tarafından kabul edilmektedir. Bu reseptörler Fosfatidilserin için bağlama, doğrudan veya opsonins, yardım yoluyla etkinleştirir apoptotik hücre engulfment efferosome8, olarak adlandırdığı bir membran bağlı çarpıtması içine teşvik sinyal yolları 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sırayla endosomes ile sigortalar ve Moleküler makineler efferosome acidify ve apoptotik aşağılamak için gerekli teslim organellerin hücre kargo13,14. Bir kez bozulmuş, apoptotik hücre kaynaklı malzemeler için geri dönüşüm endosome ticareti — bir süreç olan bağışıklık yanıtı apoptotik hücre kaynaklı antijenleri için sınırlar ve hangi apoptotik hücre13, besin kurtarma için izin verebilir 15. Engelli izni efferocytosis sonuçlarında apoptotik hücre bir başarısızlık; temizlenmemiş bu hücreler sonunda sekonder nekrozis tabi. Nekrotik hücre pro-inflamatuar sitozolik İçindekiler, patojenler ve autoantigens böylece driving range infektif, enflamatuar ve otoimmün hastalıklar16,17ekstraselüler ortamın yayın. Birlikte, apoptozis ve efferocytosis ölmek üzere olan ve ölü hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırmak ve doku homeostazı bakım için izin.
Efferocytosis temel moleküler mekanizmaları araştıran apoptotik hücre Alım açık bir miktar sağlamak üzere yöntemler gerektirir. Bu miktar diğer alımını mekanizmaları endositoz ve fagositoz18,19, efferocytosis gibi sağlam hedef hücre, parçalı Anlamazdın kaynaklanan engulfment neden olabileceğini değil aslında tarafından karmaşıktır apoptotik hücre efferocyte20. Burada açıklanan protokolü sağlar internalized doğru tarif bir vitro efferocytosis tahlil açıklar karşı bireysel apoptotik hücre bölümleri sigara içselleştirilmiş ve sabit-hücre çeşitli ile kombine edilebilir ve Live-cep mikroskobu yaklaşımlar. Geleneksel fagositoz deneyleri eklemek antikorlar Özel Sigara içselleştirilmiş hedefleri, nerede bizim yöntemi olarak etiketlemek için deney sonunda fagositik hedefe farklı kovalent bağlı biotin21 apoptotik hedefle etiketleme , 22. apoptotik hücre belirli antikor-ebilmek var olmak kullanılmış bu tahlil ederken, biotinylation yaklaşım herhangi bir protein taşıyan hedef etiketlenmeye olanak sağlar ve immunostaining gerçekleştirilirse ikincil antikor olan ile olası sorunları önler . Özellikle, bir hücre izleme boya ve biotin ile çift lekeli edilmiştir apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması anahat. Boya izleme hücre efferocytosis sırasında izleniyor, efferocytosed apoptotik hücre sigara içselleştirilmiş bölümlerden ise yüzey biotinylation ayrımcılık için sağlar internalized apoptotik hücre kaynaklı malzeme sağlar. Ayrıca Kültür ve hazırlanması J774.2 ve THP-1 hücre hatları için fare ve insan efferocytes olarak kullanmak, monosit kaynaklı M2 makrofajlar birincil hücre efferocytosis ve Jurkat hücreleri kullanmak için bir örnek olarak efferocytic hedef olarak açıklar. Bu yöntemler diğer hücre hatlara veya primer hücre, hücre ölümü (Örneğin apoptosis, nekroz ve necroptosis) her türlü geçiren hedef hücrelere ve hangi apoptotik hücreler lipid kaplamalar arasında taklit mikron büyüklüğünde taklit eder kolayca uygulanabilir veya kaplama ligandlar belirli bir faiz efferocytic takımı ile.
Bu protokol için özetlenen yöntemi yaygın olarak kullanılan alan23,24akış sitometresi dayalı yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır. NET her iki toplam ve sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi etiketleme ile kombine Fagosit-apoptotik hücre etkileşimi doğrudan görüntüleme tarafından efferocytosis nicel ölçüleri yapılabilir. Ayrıca, pH-duyarlı fluorophores bazı alternatif yöntemler25zihnimi karıştıran lizozomal pH FITC ve GFP floresans bastırılması gibi karıştırıcı faktörlerin kısıtlar. Son olarak, ayrıntılı olarak açıklanmıştır değil iken, bu yöntemler transgenes, fluorescently etiketli ifade efferocytes kullanarak istihdam edilebilir veya sonrası fiksasyon immunostaining molekül etkinlik sinyal ve izlenmesi miktar için izin vermek için ile hücresel süreçler sırasında efferocytosis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medya</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medya</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm dairesel cam lameller # 1.5 kalınlık</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72290-08</td><td>Lamelin boyutu ve şekli kritik değildir, ancak hücre kültürünü basitleştiren standart 12 oyuklu bir plakanın kuyularına 18 mm sığar</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>DMSO'da 1 mM'de çözün (1.000x stok çözeltisi)</td></tr> <tr><td>Annexin V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Bir dessikatörde saklayın. Stok çözeltisi hazırlamayın.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Turuncu</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Lenfolit-poli hücre ayırma ortamı</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-4</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Makrofaj Hücre Hattı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 İnsan Monosit Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat T Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis Yönetmeliği okuyan ve doğru bir şekilde apoptotik hücreler alımını ölçmek için efferocytosis kontrol sinyal ve hücresel işlemleri soruşturma için yöntemler gerektirir. Bu miktar böylece doğru bir şekilde apoptotik hedef karşı artık unengulfed cep efferocytosed kısmı arasında betimlemek Yöntemler gerektiren çoğu kez efferocytosed parça parça, apoptotik hücreler gibi yapmak zor olabilir parçaları. Burada özetlenen yaklaşım doğru makrofajlar gibi efferocytes efferocytosis ve efferocytic kapasitesini dinamikleri ölçmek için çift etiketleme yaklaşımlar kullanır. Apoptotik hücre sitozol apoptotik hücre yüzey biotinylation farklılaşma için sağlar internalized ve sigara içselleştirilmiş arasında iken tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler, izleme özelliğini etkinleştirme bir hücre izleme boya ile etiketlenir apoptotik hücre kesirler. Canlı ya da sabit hücre floresan fotoğraf çekmek ve streptavidin boyama tarafından Ayrıştırılan gibi ilişkili içselleştirilmiş hedefleri karşı miktarı miktarının efferocytes efferocytic kapasitesini belirler. Bu yaklaşım yöntemleri akış sitometresi, yani efferocytosed apoptotik hücre kesirler, efferocytic dynamics tarafından canlı-cep mikroskobu, ölçmek için yetenek karşı efferocytosed doğru tarif gibi birçok avantaj sunar ve hücresel fluorescently etiketli transgenes ifade hücrelerde sinyalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kapasite. Birlikte, bu protokol için özetlenen yöntemleri doğru efferocytic etkinliğini ölçmek ve hücresel sinyal yolları efferocytosis sırasında etkin sorguya çekmek için kullanılan esnek bir deneysel yaklaşım için temel olarak hizmet vermektedir.

Gecede 1 µM staurosporine sonuçlarında apoptozis ile Jurkat hücre kültür &gt; Annexin (Şekil 1) boyama V ile teyit edilmesi hücrelerin % 95'i. Staurosporine konsantrasyonu ve staurosporine tedavi süresi her hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir, ancak diğer hücre tipleri bu deneyler için kullanılabilir. Güvenilir algılama ve efferocytosis, miktar için &gt; hücrelerin % 80'i-meli var olmak efferocytes için eklemeden önce apoptotik. Apoptozis (Ö...

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Bu yöntem, apoptotik hücrelerin alımına aracılık etmede sinyal moleküllerinin rolü gibi efferositoz alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, diğer yöntemlerle her zaman belirgin olmayan kısmi veya parçalı apoptotik hücre alımı da dahil olmak üzere apoptotik hücre alımının net bir miktarını sağlamasıdır. Bu yöntem, bağışıklık hücreleri tarafından efferositoz hakkında bilgi sağlayabilse de, epitel veya kanser hücreleri gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, mikroskop edinme ayarlarını optimize etmenin zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir. İnsan makrofajlarını ve apoptotik Jurkat hücrelerini hazırladıktan sonra, apoptotik hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Daha sonra yeterli miktarda apoptotik hücreyi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Jurkat hücrelerini beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleme yoluyla peletleyin. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Jurkat hücreleri santrifüjdeyken, 10 mikrolitre DMSO'yu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alın.Daha sonra, DMSO'da minimum miktarda NHS-Biotin'i çözün. Bundan sonra, apoptotik hücreni

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, konfokal mikroskopi kullanarak apoptotik hücrelerin klirensini incelemek için efferositoz testini gösteriyoruz. Efferositoz, apoptotik hücrelerin fagositler tarafından yutulduğu ve efferozom adı verilen veziküller içinde parçalandığı çok aşamalı bir süreçtir. Bu protokol, tek tek apoptotik hücrelerin içselleştirilmiş ve içselleştirilmemiş kısımlarını görselleştirmek ve efferositozu ölçmek için bir yöntem sağlar.

Sabit Hücreli Efferositoz Deneyi: Floresan Mikroskobu Kullanarak Apoptotik Hücrelerin Makrofajlar Tarafından Efferositik Alımını İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, insan lökositleri tarafından FITC etiketli patojenik mantar sporlarının fagositozunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Fagositozlu sporlar, karşı boyama yoluyla hücreye bağlı sporlardan ayırt edilir, ardından akış sitometrik analizi yapılır.

Mantar Sporu Fagositozunun İnsan Fagositleri ile Kantitatif Akış Sitometrik Ölçümü

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Hücrelerin hücre popülasyonlarının bir biyolojik ve kimyasal analiz gerektiren pek çok bilimsel çalışmalar için saflık yüksek bir devlet olmalıdır. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), saf hücre popülasyonlarının elde etmek için üstün bir yöntemdir.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Öğrenin, insan makrofajları ve apoptotik Jurkat hücreleri kullanarak tek hücreli floresan mikroskobu ile efferositoz miktarlandırma yöntemini. Bu teknik, hücre ölümü ve temizleme mekanizmalarını araştıran bilim insanları için değerli bir araç sunar.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Daha fazla video keşfet