Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Bu yöntem, apoptotik hücrelerin alımına aracılık etmede sinyal moleküllerinin rolü gibi efferositoz alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, diğer yöntemlerle her zaman belirgin olmayan kısmi veya parçalı apoptotik hücre alımı da dahil olmak üzere apoptotik hücre alımının net bir miktarını sağlamasıdır. Bu yöntem, bağışıklık hücreleri tarafından efferositoz hakkında bilgi sağlayabilse de, epitel veya kanser hücreleri gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, mikroskop edinme ayarlarını optimize etmenin zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir. İnsan makrofajlarını ve apoptotik Jurkat hücrelerini hazırladıktan sonra, apoptotik hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Daha sonra yeterli miktarda apoptotik hücreyi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Jurkat hücrelerini beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleme yoluyla peletleyin. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Jurkat hücreleri santrifüjdeyken, 10 mikrolitre DMSO'yu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alın.

Daha sonra, DMSO'da minimum miktarda NHS-Biotin'i çözün. Bundan sonra, apoptotik hücrenin 500 mikrolitresini ve PBS süspansiyonunu DMSO ve NHS-Biotin içeren tüpe aktarın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre uygun bir hücre izleme boyasını seyreltin.

Hücre süspansiyonunu karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, %10 FBS ile eşit hacimde RPMI 1640 ekleyin ve süspansiyonu karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleme yoluyla peletleyin.

Daha sonra süpernatanı atın ve lekeli hücreleri %10 FBS ile 100 mikrolitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin. Her bir makrofaj oyuğuna 100 mikrolitre lekeli hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra plakayı bir dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin.

Plakayı bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Uygun inkübasyon süresinden sonra, hücreleri inkübatörden çıkarın. Sonra hücreleri iki kez bir mililitre PBS ile yıkayın.

Bundan sonra, her bir oyuğa seyreltilmiş FITC konjuge streptavidin ekleyin. Ve plakayı karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Hücreleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve her durulamadan sonra numuneleri beş dakika boyunca hafifçe çalkalayın.

Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fazla PFA'yı gidermek için hücreleri PBS ile bir kez durulayın. Lamelleri bir görüntüleme slaytına monte edin ve lamı bir floresan mikroskobuna aktarın.

Niceleme için yeterli sayıda hücrenin Z yığınlarını yakalayın. Söz konusu bölümler arasındaki mesafeyi, yutulan tüm apoptotik materyalin tespit edileceği şekilde ayarlamak çok önemlidir. Söz konusu bölümler arasındaki maksimum mesafe, objektif lensinizin odak derinliğinden daha büyük olmamalıdır, tipik olarak 0,5 ila bir mikrometre.

İçe Aktar özelliğini kullanarak Z yığınlarından birini yazılıma yükleyin. Ardından, Ölçümleri Ayarla panelinin altında bir ölçüm seçeneği olarak Entegre yoğunluk'u seçin. Hem streptavidin hem de hücre izleme boya kanalları bir kaplama olarak görüntüleniyorsa analizin gerçekleştirilmesi en kolay olanıdır.

Bir çevre boyunca herhangi bir yerde streptavidin boyaması olan herhangi bir nesne streptavidin pozitif olarak kabul edilmeli ve bu nedenle streptavidin negatif olarak ölçülmemelidir. Görüntü yüklendikten sonra, streptavidin ve Freehand veya çokgen seçim aracını kullanarak, tüm hücre izleme boyası pozitifleri streptavidin negatif malzemesini Z yığınının tek bir düzleminde daire içine alın. Ardından, bölgedeki hücre izleme boyasının entegre yoğunluğunu ölçün.

Aynı Z bölümünde, tüm hücre izleme boyası pozitif streptavidin pozitif malzemesini daire içine almak için streptavidin boyamayı ve Freehand veya çokgen seçim aracını kullanın. Son olarak, bu bölgenin entegre yoğunluğunu ölçün. Bu prosedürü kullanarak, Staurosporin ile tedavi edilen Jurkat hücrelerinin% 95'inden fazlası apoptozdan geçti.

Çoğu deneyde, efferositozlu apoptotik hücrelerin fraksiyonu zamana bağlı bir şekilde artmıştır. Bu protokolü farklı efferositik hücre tipleri veya farklı apoptotik hücre hedefleri için optimize ederken, apoptotik hücre aralığını efferositik hücre oranlarına test etmek önemlidir. Genellikle 10'a bir veya 30'a bir oranları en iyi sonucu verir.

Bu prosedür, efferositik hücrelerde floresan raportör genleri eksprese ederek sinyal molekülü aktivasyonunu veya hücre içi trafiği izlemek için kolayca değiştirilebilir, böylece bu süreçlerin efferositoz sırasında görüntülenmesine izin verir.