Bitki çözünür Protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği, Mısır (Zea mays) kullanarak bir suret olarak miktarının

Bu yöntem, bitki bilimleri ve beslenme ekolojisi alanındaki araştırmacıların, bitki dokusundaki çözünür proteinlerin ve sindirilebilir karbonhidratların konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ölçmelerini sağlar. Bu tekniklerin temel avantajı, bu iki inanılmaz derecede önemli makro besin maddesini yüksek doğrulukla ölçmek için hızlı ve kolay bir yöntem sunmalarıdır. Bu tekniklerin ekoloji alanı için güçlü etkileri vardır, çünkü bitki proteinleri ve karbonhidratlar karasal besin ağlarının temelini oluşturur.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, genel kullanımlı bir laboratuvarda yaygın olarak gerçekleştirilmeyen birkaç adım ve bazı teknikler olduğu için mücadele edebilir. Başlamak için, her dokunun kopya örneklerini etiketli 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine tartın. Ardından, her bir numunenin kesin kütlesini kaydedin.

Bir mikropipetleyici kullanarak, her tüpe 500 mikro litre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri 30 dakika boyunca sonik olarak ısıtın. Ardından, tüpleri 15 dakika önceden ısıtılmış bir sıcak su banyosuna yerleştirin.

Bundan sonra, tüpleri 10 dakika boyunca 15.000 G'de santrifüjleyin. Her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak süpernatanı yeni, etiketli mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Peletin içine 300 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin ve santrifüjlemeyi 10 dakika boyunca tekrarlayın.

Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve ilk santrifüjlemeden süpernatanı içeren tüplere aktarın. Süpernatantın pH'ını nötralize etmek için 11 mikrolitre 5.8 molar hidroklorik asit ekleyin. PH'ın yaklaşık yedi olduğunu doğrulamak için turnusol kağıdı kullanın.

Ardından, her tüpe 90 mikrolitre %100 trikloroasetik asit ekleyin. Daha sonra tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 13.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika

Trikloroasetik asidi çıkarmak için dikkatlice bir vakum hattı ve cam mikropipet ucu kullanın. Emme ucu ile peleti rahatsız etmemeye çok dikkat edin. Ardından, peleti 20 santigrat dereceye kadar soğutulmuş 100 mikrolitre asetonla yıkayın, ardından asetonun bir davlumbazda buharlaşmasına izin verin.

Protein peletini bir mililitre sodyum hidroksit ile çözün. Ek ısıtma, girdap ve sonik ısıtma turları gerekebilir. A1 konumundan başlayarak üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya her bir IGG standart çözeltisinden 160 mikrolitre ekleyin, Daha sonra, yeni bir 1.5 mililitrelik tüpte, 950 mikrolitre damıtılmış suya her bir numune çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra, her seyreltilmiş numuneden 60 mikrolitreyi, H1 konumundan başlayarak üç nüsha halinde kuyu plakasına ekleyin. Tüm boş ve bilinmeyen numune kuyucuklarına 100 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakanın her bir oyuğuna 40 mikrolitre Coomassie Brilliant Blue G-250 protein boyası ekleyin.

Bir iğne kullanarak, kuyucuklarda bulunan kabarcıkları patlatın. Bundan sonra, plakanın oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, her bir kuyucuk için absorbans değerlerini 595 nanometrede kaydetmek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın.

İlk olarak, her doku örneğinden kopyaları 15 mililitrelik cam tüplere tartın. Tüpleri etiketleyin ve her numunenin tam kütlesini kaydedin. Daha sonra, her tüpe bir mililitre 0.1 molar sülfürik asit ekleyin ve kapakları sıkıca kapatın.

Daha sonra tüpleri bir saat boyunca kaynar su banyosuna koyun. Tüpleri soğuması için ılık bir su banyosuna aktarın. Daha sonra tüplerin içeriğini etiketli 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dökün.

Bundan sonra santrifüj tüpleri 10 dakika boyunca 15.000 G'de. Süpernatanı yeni etiketli 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Bir pipet kullanarak, bilinmeyen her numuneden 15 mikrolitreyi kendi test tüpüne aktarın.

Daha sonra her tüpe 385 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Bir davlumbazda, her standart ve bilinmeyen numune test tüpüne 400 mikrolitre %5 fenol ekleyin. Hemen ardından her tüpe iki mililitre sülfürik asit ekleyin.

Sülfürik asidi çözeltinin yüzeyine eklediğinizden emin olun. Tüpleri 10 dakika inkübe ettikten sonra, tüpleri girdaplayın. Ardından tüpü 30 dakika daha inkübe edin.

Her numune tüpünden 800 mikrolitreyi üç polistiren 1.5 mililitre yarı mikroküvete aktarın. Ardından spektrofotometreyi 490 nanometrede okuyacak şekilde ayarlayın ve boş bir küvet ile kalibre edin. Son olarak, her bir küveti spektrofotometreden geçirin ve absorbansı kaydedin.

Bu protokol kullanılarak, üç coğrafi bölgeden dört farklı tarla ve tatlı mısır dokusunun çözünebilir protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriği analiz edilmiştir. Bölgeler arasında çözünür protein içeriğinde önemli farklılıklar gözlendi, bu nedenle her bölge için ayrı analizler gerektirdi. Bölgeler arasında, dokular arasında çözünür protein ve sindirilebilir karbonhidrat içeriğinde çeşitli farklılıklar vardı.

Minnesota'da, dokular sadece çözünür protein içeriğinde değişiklik gösterirken, Kuzey Carolina dokuları hem çözünür protein hem de sindirilebilir karbonhidratlarda farklılık gösteriyordu. Teksas'taki doku makro besin içeriğindeki değişkenlik çeşitliliğe bağlıydı. Bu teknik, bitki bilimleri ve beslenme ekolojisi alanındaki araştırmacıların, temel ölçümlerden ekstrapolasyon yapmak yerine, çözünür bitki proteinini ve sindirilebilir karbonhidratları hassas bir şekilde ölçmelerine olanak sağlayacaktır.

Sıvı nitrojen, konsantre asitler ve bazlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bu kimyasallarla çalışırken daima eldiven, koruyucu gözlük, önlük ve kapalı ayakkabı gibi önlemler alın.