Name: T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Öğrenin, T7 bakteriyofajlarını kantitatif PCR ile hızlı ve doğru bir şekilde sayma yöntemini. Bu teknik, faj görüntüleme biyopanning deneylerinde çok sayıda örneği analiz etmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser ilaç Vakfı araştırma Starter hibe tarafından desteklenen ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R01HL138251 altında verin.

1. primer tasarım ve T7 fajının genomik DNA'ın Analizi
<ol><li>T7 fajının genomik DNA amplifikasyon için tasarım astar. Not: F (ileriye doğru) ve (bkz: Malzemeler tablo) R (ters) astar T7 DNA dizisi yükseltmek akıntıya karşı bulunduğu kitaplığı değişken bölge (Şekil 1).</li>
	<li>Erime sıcaklığı (Tm), yüzde GC içeriği (GC %), astar Dimer, saç tokası oluşumu ve PCR uygunluğu (Şekil 1) de dahil olmak üzere astar, parametrelerini değerlendirmek için bir uygun astar analizörü seçin.</li>
	<li>Astar oligonucleotides (oligos) sipariş ve elimize lyophilized oligos 100 µM hisse senedi konsantrasyonları bir 1,5 mL santrifüj tüpü alın ve birkaç ay için-20 ° C'de saklayın DNaz ve RNase free ultra saf su için resuspend.</li>
	<li>Birkaç aliquots (yaklaşık 50 µL her 1,5 mL tüp) 100 µM astar stokunun olun. Not: Bu adımı sık donma-çözülme döngüsü önlemek için kullanılır.</li>
</ol>2. standartlar T7 fajının genomik DNA miktar için hazırlayın
<ol><li>Seri olarak 0.1 µg/µL (1.0 x 108 fg/µL) başvuru T7 faj DNA seyreltik (satın; 0,1 µg/µL bilinen bir konsantrasyon malzemeleri görmek) 10 kat 1.0 x 106 x 100 fg/µL ultra-saf H2O ' 0.2 mL PCR tüpleri ile 1.0. 20 µL (Şekil 2) bir hacmi her konsantrasyon hazırlayın.</li>
	<li>Girdap ayrıntılı seyreltme her adımda karıştırma sağlamak için PCR tüpleri. Ayrıca ipuçları DNA örneği için aşağıdaki seyreltme eklerken değiştirin. Not: Bu qPCR denemenin her toplu iş için standart bir eğri DNA standartların yeni çözüm hazırlamak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Denklem 1 (aşağıda) T7 fajının başvuru için DNA konsantrasyonları fg/µL genom kopya (gc) /µL (Şekil 2) dönüştürmek için kullanın.</li>
	<li>T7 faj DNA konsantrasyon gc/µL = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) Not: bp: baz çifti; T7 genomik DNA başvurudur 37314 bp.</li>
</ol>3. ön tedavisinde fajının örnekleri önce qPCR reaksiyon hazırlık
<ol><li>
(1. seçenek) Damlalıklı 20 µL vitro kistik fibrozis (CF) karşı biopanning seçildiği bir T7 klonu (fajının)-mukus model 1.5 mL santrifüj tüpleri içine gibi. DNaz 1,25 birimleri ekleyin ben (0.5 µL) her 20 µL örnek için. Not: T7 fajının sistein kısıtlanmış heptapeptide kitaplığı (CX7C) biopanned 15dk için 24-şey zar ekler ( Tablo malzemelerigörmek) kaplı CF benzeri mukus karşı yapıldı. Daha fazla bilgi sonuçları bölümünde sağlanır. Bir T7 klon qPCR numune hazırlama eluate üzerinden için seçildi.<ol>
<li>Seçenek 2: Damlalıklı 200 T7 µL klon 1,5 mL tüpler içine ve 5 adet DNaz ekleyin ben (2 µL) her örnek için. Not: Bu adımda seçilen fajının örnek hacmi biopanning toplanan birimden bağlıdır. Odağı iletişim kuralının biopanned fajının qPCR üzerinde olmakla birlikte, biopanning ayrıntılı için T7 fajının Kullanıcı Protokolü adımları (bakınız Tablo reçetesi)13kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 fajının örnek tüpler (adım 3.1) kap ve onları 37 ° c ısıtılmış kuru banyo (Yani, ısı blok) 10 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir ısıtmalı kuru banyoda (Şekil 3A) 15 dakika 100 ° C'de (Kimden adım 3.2) tüpler kuluçkaya. Dikkat: buharlaşma ve yoğunlaşma Isıtma adımı sırasında meydana beri 1.5 mL santrifüj tüpleri tamamen şapkalı emin olun.</li>
	<li>Isıl phages adım 3.3 18,534 x g , 10 s. karışımı bir girdap karıştırıcı tüp yerleştirerek phages ayarla 10 s ve 18,534 x g 10 için spin için dokunmatik-harekete geçirmek modu için spin s tekrar. Not: Spin-mix-spin döngüsü ısıtmalı fajının örnekleri de karıştırılır emin olmaktır.</li>
	<li>Onları deney tezgah veya mağaza buzdolabında 4 ° C'de gecede terk ederek örnek tüpler, oda sıcaklığında (RT) sakin. Not: Bu adımda deneme duraklatılmış.</li>
</ol>4. qPCR reaksiyonlar hazırlayın
Not: Bir PCR reaksiyon için bir örnektir. 5 her PCR reaksiyon içerir µL qPCR Master mix (malzemeleri görmek), 5 µM astar çifti Mix 1 µL, H2O 2 µL ve 2 µL ısıl T7 fajının örneği. Birden fazla PCR reaksiyonları için fajının örnek dışında tüm reaktifler bir 1,5 mL tüp premix. Premiks her reaktif hacmi qPCR için fajının örnek sayısına bağlıdır.
<ol><li>10 biopanned fajının örnekleri bilinmeyen konsantrasyon ve 7 nüsha standart konsantrasyonlarda örnekleri qPCR Premiks hazırlayın. Sonuç olarak, 51 Toplam örnekleri ve bu nedenle, 51 qPCR reaksiyonlar (Yani, örnek başına bir reaksiyon) vardır. 51 reaksiyonlar için 255 µL (51 x 2 µL) qPCR ana Mix (51 x 5 µL), astar (51 x 1 µL) 51 µL ve H2O 102 µL Premiks hazırlayın. Not: Bu bir kaç ilave PCR reaksiyonları sırasında aliquoting PCR karışımı içine her şey 96-şey qPCR plaka için hacim kaybı telafi etmek için hazırlamak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Aliquot 8 µL PCR Premiks 96-şey qPCR plaka 51 wells (Yani, 51 qPCR reaksiyonlar) olmak üzere toplam her kuyuya. Aliquoting sırasında ipuçları değiştirmeye gerek yoktur.</li>
	<li>Her şey (Şekil 3B); 2 µL ısıl T7 fajının örnekleri (adım 3.4) veya T7 fajının başvuru DNA (adım 2.1) ekleme ipuçları farklı DNA örnekleri çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuya eklerken değiştirin. Ayrıca, 2 µL DNA örnekleri qPCR Premiks (Yani, 8 µL PCR Premiks içine) yüzeyinin altında dağıtmak.</li>
	<li>QPCR levha yapıştırıcı film ile kapatın. Not: Bu qPCR plaka türü ne olursa olsun kritik bir adımdır. Plaka tamamen mühür için önerilen setini kullanın; Aksi takdirde, plaka mühürlü olmayan bölgede PCR sırasında cilt kaybı neden olur Bisiklete binme.</li>
	<li>QPCR plaka floresan photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile sarın ve qPCR ekipman üzerinde çalışmaya devam edin.</li>
</ol>5. qPCR Bisiklete binme koşulları
Not: qPCR Bisiklet koşullarını belirli qPCR ekipman üzerinde kurulmuştur ( Tablo malzemelerigörmek).
<ol><li>96-şey qPCR plaka qPCR ekipman üzerinde çalıştırın. Ekipman, aşağıdaki deneysel koşullar (Şekil 3 c) ayarlamak için menüden ayarları seçin.</li>
	<li>Koşulları aşağıdaki gibi 10 µL örnek hacmi için bisiklet ayarla: bir çevriminde 2 min 50 ° c 95 ° C'de bir döngüsü için 2 dk, ardından 40 döngüleri tarafından (95 ° C 15 s, 1 dk. için 60 ° C). Sonra çalışma eritebilir eğri ayarları: 95 ° C bir döngüsü için 15 s, 60 ° C için 1 dakika ve 95 ° C 15 s.</li>
	<li>6. adımda açıklandığı gibi verileri çözümlemek için devam edin.</li>
</ol>6. qPCR ham veri analiz ve qPCR T7 Bacteriophages için gc/µL için Ct değeri dönüştürmek
<ol><li>Ham qPCR veri analiz etmek ve veri kalitesi ve ham veri (Şekil 4) karakteristik araziler analiz ederek değerlendirmek. Not: Amplifikasyon arsa, uygulamasının arsa ve erime eğrisi Arsa qPCR veri kalitesini doğrulamak anahtar özelliği araziler vardır.</li>
	<li>
İneklemek örneklerinden standart eğri (adım 2.1) her toplama, ortalama eşik döngüsü (Ct) değerleri hesaplar.
	<ol>
<li>Ortalama Ct (Y) günlük (gc/µL) (X Y doğrusal eğrisi almak için) karşı komplo = kX + b (k doğrusal eğrinin eğimini, b kesme noktası).</li>
		<li>Doğrusal katsayısı14 R2 hesaplamak (R2 -meli var olmak &gt; 0.99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standart eğri Y kullanın = kX + b (Şekil 5) gc/µL T7 phages biopanning örneklerinde (Yani, phages CF benzeri mukus karşı seçili) sayısını hesaplamak için. Not: Standart eğrinin eğimini k var.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemle amplifikasyon verimlilik hesaplamak <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) Not: başvuru DNA qPCR oluşturulan standart eğrinin eğimini k var. İdeal amplifikasyon verimliliği % 90-110 aralığıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
<li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20020040">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li>
<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
<li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li>
<li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li>
<li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li>
<li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li>
<li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li>
<li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li>
<li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li>
<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li>
<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
<li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure%3A+A+Kinetic+Study%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

QPCR yöntemleri fajının genomik DNA5ölçmek için geliştirdiğimiz ve burada açıkladığımız ve T7 phages karşı bir CF benzeri mukus bariyer seçili numaralandırmak için qPCR yöntemini benimsemiştir. Yayın, nicel gerçek zamanlı PCR deneyler (MIQE) yönergeleri için en az bilgiyi geliştirmek ve numaralandırma T7 phages15qPCR yöntemini doğrulamak için adapte. Phages biopanning deneyler üzerinden ölçmek için geliştirilmiş zaman verimli, güvenilir ve ekonomik bir yaklaşım protokolüdür...

Bakteriyofaj (fajının) ekran teknolojisi, George Smith tarafından 1985 yılında geliştirilen peptid veya protein ligandlar hedefleri veya reseptörleri hücre zarı, hastalık antijenleri, hücre organelleri veya özel karşı tanımlamak için güçlü, yüksek-den geçerek bir yaklaşım olduğunu organ ve dokulara son yirmi yılda1,2. Burada, rasgele kütüphanelerin polipeptitler veya tek zincir antikorlar phages (genellikle M13 veya T7) kat protein üzerinde görüntülenir ve belirli ligandlar immobilize proteinler vitro veya içinde vivo karşı kaydırma tespit edilmesi Biyolojik sistemlerde bir yinelemeli seçim sürecinde. O zaman, ligandlar tanı ve tedavi hastalıkları3,4için görüntüleme veya terapötik ajanlar ile birleştiğinde olabilir. Doğru bir şekilde phages biopanning birden çok adımı sırasında numaralandırmak için önemlidir: (1) substrat için bağlamak phages ölçmek için ve (2) her turda seçim ile zenginleştirme olup olmadığını belirlemek için phages ölçmek için (fajının zenginleştirme gösterir biopanned Feyc benzeşme hedef için). Miktar, Çift katmanlı plak yöntemi, geçerli altın standart birden çok zorluklar sunar; sıkıcı, hantal ve potansiyel olarak çok sayıda örnekleri için yanlış olduğunu. Bu nedenle, bizim grup M13 ve T7 fajının parçacıklar biopanning5numaralandırmak için bir hassas, tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yöntemi geliştirmiştir.
qPCR doğru bir şekilde T7 ve M13 phages ölçmek için cazip ve uygun bir yöntemdir. Her bireysel fajının parçacık yalnızca genomik DNA (dsDNA veya ssDNA) bir kopyasını içerebilir yana bir fajının genom bir fajının parçacık için eşdeğerdir; Feyc genleri sayısı miktarının tarafından phages sayısını ölçmek mümkün olabilir. QPCR, floresan muhabir sırasında boyalar özel olarak sigara fajının genomik DNA bağlamak veya özellikle fingerprinting astar PCR güçlendirme sırasında ve floresan sinyal güçlendirme her turu ile artar. Floresans sinyal bu yuvarlak/amplifikasyon döngüsü eşik ulaştığında eşik döngüsü (Ct) belirtilmektedir. Başvuru faj DNA bilinen konsantrasyonları standart bir eğri oluşturmak için Ct değerlerine karşı çizilir. Standart eğri DNA örnekleri Ct değerleri ile kullanarak, phages konsantrasyonları değiştirilmiş.
Çok sayıda stratejileri daha önce geliştirilen ve yoğun phages biopanning üzerinden ölçmek için kullanılan iken, her biri belirli zorlukları vardır. En popüler ve geleneksel yöntem çift-tabaka plak tahlil olduğunu. Burada, bakteri seri dilutions hazırlanan phages ile enfekte, solid agar substrat kaplama ve agar ile overlaid ana bilgisayar; phages oluşan plaklar (Yani, plak oluşturan birimler veya pfu) agar plaka numarası ile numaralandırılır. Plak tahlil hassas ama sıkıcı, zaman alıcı ve yanlış, özellikle çok sayıda örnekleri ve yüksek konsantrasyonları5. Ayrıca, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) M13 T7 fajının parçacıklar6,7,ve8numaralandırmak için adapte edilmiştir. Burada, farklı dilutions, phages bağlı olan ve bir katı substrat (Yani, bir Mikroplaka) yakalanan, fajının özel antikorlar ile probed ve gazetecilere (Örneğin, enzim hassas chromogenic yüzeylerde, fluorophores) kullanarak tespit Feyc parçacıklar mevcut sayısını belirleyin. Veriler (Örneğin, floresan, absorbans) örneklerinin fajının standartları bilinen konsantrasyonlarda karşı bilinmeyen konsantrasyonları ölçmek için kullanılabilir. Farklı fajının tabanlı ELISAs geliştirilmiştir ancak potansiyel kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir grubu bir kağıda dayalı sandviç ELISA yedi büyüklük (102-109 pfu/mL); yayılmış bir miktar aralığı ile geliştirilen Ancak, bu yöntem birden çok adımı antikor kaplama gerekli ve tahlil8için tüm günümü aldı. Grubumuz aynı zamanda M13 fajının parçacıklar ölçmek için bir ELISA yöntemi geliştirilmiş ancak 10 daha az duyarlı algılama aralığı vardı6 ' 1011 pfu/mL5. Değiştirilebilir lanthanide floresan problar M13 numaralandırmak için geliştirilmiştir ve miktar veri içinde 20 dk alınamadı; Ancak, bu tahlil vardır dar bir Dinamik Aralık 10 1012 pfu/mL99 . Bir grup atomik kuvvet mikroskobu M13 fajının parçacıklar çözüm numaralandırmak için kullanılan, ama bu gelişmiş elektron mikroskobu gerektirir ve sadece konsantrasyonları10dar bir Aralık içinde çalıştı. Başka bir çalışmada monodisperse emülsiyonlar floresan M13 ve T4 muhabir phages tuzak ve floresan damlacıkları tarafından phages saymak için kullanılır; Ancak, bu yaklaşım aynı zamanda bir dar miktar aralığı 10 sergilenen2 106 pfu/mL11. Damlacık dijital PCR M13 phages ölçmek için kullanılan, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan fajının parçacıklar12sayısı arasında ayırt etmek bu yaklaşım değiştiremiyor.
Bizim grup yakın zamanda T7 ve M13 phages biopanning iki farklı floresan muhabir boyalar5kullanarak bir kan - beyin bariyerini hücre modeli üzerinden tespit numaralandırmak için qPCR yöntemleri geliştirmiştir. Söz konusu miktar yöntemlerine göre geliştirdiğimiz qPCR yöntemleri yüksek üretilen iş ve zaman tasarruflu çok sayıda örnekleri ölçmek için ve mümkün ayırt arasında bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan phages DNaz ile ben, ön arıtma Feyc örnekleri. Önemlisi, bu yaklaşımın M13 ve T7 bacteriophages biopanning örneklerinden tekrarlanarak ve doğru bir şekilde ölçmek. Acemi araştırmacılar fajının qPCR alanında rehberlik için burada T7 fajının parçacıkları bir sistein kýsýtlanmýþ kitaplığı (CX7C) karşı bir vitro kistik fibrozis (CF) mukus bariyer panned numaralandırmak için detaylı qPCR yöntemi açıklanmaktadır. Bu işten qPCR yöntemi fajının parçacıklar biopanning diğer türlerinden ve su, toprak ve vücut sıvıları gibi diğer kaynaklardan ölçmek için genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzemeler ve Reaktifler< T7 genomik DNA için güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primerler IDT</td><td></td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Select ambalaj kontrolü DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optik 96 kuyulu reaksiyon plakası</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR ana karışımı - SYBR'yi güçlendirin Yeşil ana karışım</td><td>Uygulamalı biyosistemler</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optik yapışkan film kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 Klonlama Kiti</td><td>EMD Millipore</td><td>70015</td><td>Kullanıcı protokolleri: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>DNase I çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu transwell plakası</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase / RNase İçermeyen Damıtılmış H 2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)</td> <td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr> <<tr><td>strong > Name <</td> <td>strong > Company </td> <td> Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Hızlı 96 Kuyulu Bloklu Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 Mikrosantrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Dijital Vorteks Karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC Çoklu Blok Isıtıcı</td><td>ThermoFisher Scientific Model</td><td>:2001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Mikroplaka Sallanan Kova Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Gerçek zamanlı PCR yazılımı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı qPCR primer tasarımı</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t7 bakteriyofaj biopanning üzerinden kantitatif pcr

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Bu iletişim kuralı T7 phages fajının seçimi deneyler (Yani, "biopanning") üzerinden Numaralandırılacak kantitatif PCR (qPCR) kullanımını açıklar. qPCR DNA ölçmek için bir floresan tabanlı yaklaşımdır ve faj parçacıklar için bir proxy olarak faj genleri ölçmek için adapte işte. Bu protokol için yüksek sıcaklık ısıtma olmadan ek DNA arıtma kullanılarak facile faj DNA hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Yöntemin yalnızca küçük hacimli ısı phages ve küçük hacimli qPCR tepki gerekir. qPCR yüksek üretilen iş ve hızlı, işlemek ve diğer fajının numaralandırma yaklaşımlar 2 – 4 h. ile karşılaştırıldığında tepkileri bir 96-şey tabak veri almak mümkün, qPCR daha zaman verimli olur. Burada, qPCR biopanning karşı vitro kistik fibrozis gibi mukus modeli üzerinden tespit T7 phages numaralandırmak için kullanılır. QPCR yöntemi T7 phages biopanning diğer türleri dahil olmak üzere diğer deneyler üzerinden ölçmek için genişletilebilir (e.g., protein bağlayıcı, içinde vivo immobilize fajının tarama) ve diğer kaynaklar (Örneğin, su sistemleri veya vücut sıvıları). Özet olarak, herhangi bir DNA kapsüllenmiş virüs ölçmek için bu iletişim kuralı değiştirilebilir.

Farklı astar tasarım araçları qPCR astar tasarlamak için kullanılabilir. Genellikle, astar tasarım programları hesaplamak ve astarlar, Örneğin, GC %, Tm, astar dimer veya saç tokası oluşumu, vb anahtar parametrelerinin genellikle doğrulamak için yerleşik kendi algoritmalar, anahtar ölçüt içinde farklı benzer astar tasarım araçları ve astar onların talimatları tasarlanabilir. Astar patlama astar özgüllük onaylamak için kullanılabilir. Bir astar genomik DNA <strong class="...

T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Bu yöntem, karmaşık örneklerden ve bakteriyofaj esaslı tanı ve tedavilerden bakteriyofajların numaralandırması ile ilgili viroloji ve mikrobiyoloji alanlarındaki temel sorunların yanıtına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, geleneksel tahlillerle mümkün olmayan çok sayıda faj görüntü biyopanning deneylerinden elde edilen çok sayıda numunenin zaman verimli ve doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Rashmi Mohanty ve Jasmim Leal, benim laboratuvar dan lisansüstü öğrenciler olacaktır.Astarları tasarladıktan ve stok konsantrasyonu oluşturduktan sonra, mikrolitre başına 0,1 mikrogram konsantrasyonla referans T7 faj DNA'sı elde edin. Ultra saf su kullanarak, 0.2 mililitre PCR tüplerde mikrolitre başına bir milyon femtogramdan mikrolitre başına bir femtograma kadar bu DNA'yı on kat daha fazla seyreltin. Her konsantrasyon20 mikrolitre hazırlayın, pipet ipuçlarını değiştirmek ve seyreltme her aşaması arasında tüpler girdap emin olun.Daha sonra T7 faj referans DNA konsantrasyonunu mikrolitre başına femtogramdan mikrolitre başına genom kopyalarına dönüştürün. İlk olarak, pipet 200 mikrolitre numune T7 faj klon 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp her 10 istenen örnekler için. Her tüpe iki mikrolitre DNase ekleyin.Tüpleri kaplayın ve ısıtılmış kuru banyoda 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonra 100 derecede 15 dakika ısıtılmış kuru banyoda kuluçkaya yatırın. Isıl işlem görmüş fajları içeren tüpleri 18, 534 kez g 10 saniye santrifüj edin.Fantazileri karıştırmak için 10 saniye boyunca dokunmatik aktivasyon modunda ayarlanmış bir girdap karıştırıcıüzerine santrifüjlü tüpler yerleştirin. 10 saniye boyunca 18, 534 kez g tekrar döndürün. Bundan sonra, oda sıcaklığına kadar soğutmak için yaklaşık bir saat laboratuvar bankında örnekleri bırakın.QPCR premixini bilinmeyen konsantrasyondaki 10 biyopanned faj örneği ve trilikatta standart konsantrasyonlardan yedi örnek için hazırlayın. 255 mikrolitre qPCR ana karışımı, 51 mikrolitre astar ve 102 mikrolitre su içeren 51 numune için premix elde edin. Aliquot hazırlanan PCR sekiz mikrolitre 96-iyi qPCR plaka 51 kuyuiçine karıştırın.Daha sonra bu kuyuların her birine ısıl işlem görmüş T7 faj örneklerinin iki mikrolitresini ekleyin ve qPCR premixinin yüzeyinin altına dağıtın. Yapışkan film kullanarak plakayı kapatın. Floresan fotoğraf ağartma en aza indirmek için alüminyum folyo plaka sarın ve daha sonra qPCR ekipman plaka çalıştırmak için devam edin.Metin protokolünde belirtildiği gibi döngü koşullarını ve erime eğrisi ayarlarını ayarlayın. QPCR çalıştırıldıktan sonra, amplifikasyon çizimi, erime eğrisi çizimi ve çok bileşenli çizim ham verilerden analiz edilir. Amplifikasyon çizimi, her bir örneğin PCR amplifikasyonunun başarılı olup olmadığını gösterir.Çok bileşenli çizim, amplifikasyon döngüleri boyunca floresan sinyalin amplifikasyonunu ve çürümesini temsil eder. Her PCR ürününün benzersiz bir erime sıcaklığı olduğundan, erime eğrisi çizimi astarların özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. Standart eğri daha sonra referans DNA'dan oluşturulur.Burada amplifikasyon verimliliği bir qPCR çalışmadan% 92.4 Temsili veri olarak hesaplanır sonra mikrolitre başına 10 ila 10 milyon genom kopyaları test aralığında bir çift katmanlı plak testi ile ölçülen aynı faj ile karşılaştırılır. Burada görüldüğü gibi, qPCR niceliklerinde faj sayısı plak testinden daha yüksektir. Varyans katsayısı ile temsil edilen qPCR yönteminin tekrarlanabilirliğinin 2,85 ile %27,2 arasında değişen değerlere sahip olduğu görülmektedir, bu işlem denenirken, numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi ve hazırlanması ve ilgili ekipmanların kalibrasyonu da dahil olmak üzere, qPCR'nin geliştirilmesi ve kullanımında çok sayıda husus un bulunduğu unutulmamalıdır.Bu yöntemden sonra, karmaşık çevre örneklerinde vivo biopanning, faj kütüphanesi DNA hazırlama ve yeni nesil sıralama ve faj tespiti dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda faj partiküllerini sayısallaştırmak için başka teknikler de yapılabilir. Fajların laboratuvarda biyolojik tehlike olarak görüldüğünü ve eldiven ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin prosedürü gerçekleştirirken her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.

quantitative-pcr-of-t7-bacteriophage-from-biopanning

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, DNA kantitatifikasyonu yoluyla T7 bakteriyofajlarını numaralandırmak için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu (qPCR) tartışıyoruz. PCR karışımındaki floresan boya, yeni sentezlenen DNA zincirlerine bağlanır ve ölçülen floresan yayar.

Bakteriyofajları Numaralandırmak için Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, T7 faj ile görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör tabanlı biyopanlamasını kullanarak protein-ilaç etkileşimlerini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. QCM biyosensöründe spesifik bir peptit gösteren fajların biyopanlanması, yüksek afiniteli peptitlerin spesifik izolasyonuna ve ardından hedef protein üzerindeki spesifik etkileşim bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olan amino asit dizilimine izin verir.

Protein-İlaç Etkileşimlerini İncelemek için Kuvars-Kristal Mikro Terazi Biyosensör Tabanlı Biyopanlama

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinlerini kullanarak gecikmeli iplik başlatmanın kinetiğini incelemek için hassas, jel bazlı süreksiz tahlilleri tanımlıyoruz.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Bu protokol, kehanetlerin konakçıları üzerindeki etkisinin ortaya çıkmasını sağlar. Bakteri kültürleri, lizojenik durumu en iyi destekleyen ve spontan indüksiyonu sınırlayan koşullar kullanılarak senkronize edilir. RT-qPCR, kehanet kısıtlı genleri ve faj kontrolünden ayrılmamış genleri, litik replikasyon döngüsü sırasında eksprese edilenlerden kesin olarak ayırır.

Ilıman Bakteriyofajların Lizojenleri Üzerindeki Etkisini Transkriptomik Yoluyla Anlamak

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektör genom kopyalarının kesin miktar tayini kritiktir, ancak standart bir protokol henüz oluşturulmamıştır. Bu protokol, saflaştırılmış AAV numunelerinin hazırlanması ve viral genom titresinin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun (dd_PCR) yürütülmesi için doğrulanmış bir yöntemi tanımlar.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

Öğrenin, T7 bakteriyofajlarını kantitatif PCR ile hızlı ve doğru bir şekilde sayma yöntemini. Bu teknik, faj görüntüleme biyopanning deneylerinde çok sayıda örneği analiz etmeyi kolaylaştırır.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Daha fazla video keşfet